Name: using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish
Uploaded: 2021-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish at JoVE.com

Финансирование было предоставлено Национальными институтами здравоохранения (NIH: R15 DK114732-01 в D.L.S.), Национальным научным фондом (NSF: MRI 1626406 до D.L.S.), а также программой Почета в Калифорнийском государственном университете Чико (К.Ф.Р.). Авторы благодарят Бетси Тамиетти за лабораторное управление и Кэти Джонс за административную помощь.

Институциональный комитет по уходу за животными и использованию (IACUC) консультативный совет в Университете штата Калифорния, Чико, одобрил все методы, описанные ниже.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется лечить эмбрионы с 1-фенил 2-thiourea (PTU; Таблица 1) в течение 24 часов после п...

<ol>
	<li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish.">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li><li>Weinstein, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+mutations+in+the+zebrafish.">Hematopoietic mutations in the zebrafish.</a> Development. , 303-309 (1996).</li><li>Ransom, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+mutants+with+defects+in+embryonic+hematopoiesis.">Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis.</a> Development. 123, 311-319 (1996).</li><li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+insertional+mutagenesis+screen+in+zebrafish.">A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish.</a> Genes &amp; Development. 13, 2713-2724 (1999).</li><li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish.">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383, 829-832 (1996).</li><li>Yeh, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+chemical+modifiers+of+oncogene-regulated+hematopoietic+differentiation.">Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation.</a> Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).</li><li>Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+genetic+screen+in+zebrafish+for+pathways+interacting+with+cdx4+in+primitive+hematopoiesis.">A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis.</a> Zebrafish. 7, 61-68 (2010).</li><li>Ridges, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+screen+identifies+novel+compound+with+selective+toxicity+against+leukemia.">Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia.</a> Blood. 119, 5621-5631 (2012).</li><li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis.">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447, 1007-1011 (2007).</li><li>Astuti, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+Bioluminescent+Zebrafish+Screen+for+Enhancing+Hematopoietic+Cell+Homing.">A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing.</a> Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).</li><li>Stachura, D. L., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dissection+of+zebrafish+hematopoiesis.">Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis.</a> Methods in Cell Biology. 133, 11-53 (2016).</li><li>Berrun, A. C., Stachura, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+In+Vitro+Assay+to+Quantitate+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+(HSPCs)+in+Developing+Zebrafish+Embryos.">Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56836 (2017).</li><li>Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Essential Zebrafish Methods: Cell and Developmental Biology. , (2009).</li><li>Drummond, I. A., Davidson, A. J., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Kidney+Development.">Zebrafish Kidney Development.</a> The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A. 100, 233-260 (2010).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature Immunology. 4, 1238-1246 (2003).</li><li>Ganis, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+globin+switching+occurs+in+two+developmental+stages+and+is+controlled+by+the+LCR.">Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR.</a> Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish.">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106, 3803-3810 (2005).</li><li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish.">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, e1-e11 (2013).</li><li>Ding, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+High-Throughput+Flow+Cytometry+in+Early+Drug+Discovery:+An+AstraZeneca+Perspective.">Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective.</a> SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).</li><li>Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+flow+cytometry+for+drug+discovery:+principles,+applications,+and+case+studies.">High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies.</a> Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).</li><li>Joslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fully+Automated+High-Throughput+Flow+Cytometry+Screening+System+Enabling+Phenotypic+Drug+Discovery.">A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery.</a> SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).</li></ol>

Зебрафиш являются отличной моделью системы для изучения примитивных и окончательных позвоночных гематопоэзиса. За последние несколько десятилетий, несколько анализов были разработаны и уточнены, что позволяет зебры, чтобы стать быстрой и экономичной моделью для тестирования наркот?...

Производство крови (гематопоезис) является важным процессом развития, который впервые начинается в раннем эмбрионе. Этот процесс начинается с генерации примитивных красных кровяных телец и макрофагов непосредственно из мезодерма, а затем смещается в сторону производства гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников (ГФУ). Эти стволовые клетки, которые являются многопотентными, генерируют все разновидности зрелых клеток крови в организме. Способная к самооб обновлению, система постоянно пополняется через эти ГЦП. В то время как этот процесс начинается на ранних стадиях развития, гематопоеза продолжается для жизни животного, обеспечивая возможность транспортировки кислорода в отдаленные места тела, чтобы остановить кровотечение после травмы, и защитить организм от инфекции. Развитие этой сложной системы контролируется временно и пространственно во время развития, и любые возмущения в производстве клеток крови могут быть катастрофическими для организма, что приводит к анемии, тромбоцитопении, лейкопении и лейкемии.
Популярной моделью животных, используемой для гематопоэтических исследований, является зебрафиш(Danio rerio),потому что они имеют аналогичное развитие крови по сравнению с людьми. В самом деле, многие из генов и молекулярных путей, используемых во время гематопоэза сохраняется на протяжении всей эволюции позвоночных, что позволяет нам узнать о человеческих генах, изучая зебры. Важно отметить, что эмбрионы зебры развиваются вне тела и в течение 7 дней породили большинство зрелых типов клеток крови, что позволяет для прямой визуализации гематопоэтической системы в короткий промежуток времени. Зебрафиш также чрезвычайно fecund, что позволяет исследователям наблюдать большее количество образцов в короткие сроки, что также важно для генерации воспроизводимых данных. Короткое время генерации зебры и внешнее развитие обеспечивает более легкую манипуляцию и наблюдение во время исследований мутагенеза1,2,3,4,5 и скринингапрепарата 6,7,8,9,10. Это позволяет группе перспективных терапевтических соединений для человеческих заболеваний крови, чтобы быть быстро и эффективно протестированы.
Важно отметить, что зебры также генетически подложки, и геном секвенирован и аннотирован. Эта трактуируемость позволяет обратные методы генетики, такие как морфолино- (MO-) опосредованное нокдаун и CRISPR-опосредованной генетической абляции, которые будут выполняться. Зебрафиш также доказали свою полезность в качестве модели для выполнения вперед генетических экранов; многие основные гены и пути, участвующие в формировании крови позвоночных были обнаружены таким образом. Многочисленные методы наблюдения клеток крови были также разработаны в зебры. В то время как традиционные гистологические методы окрашивания существуют, можно также выполнить на месте гибридизации для крови конкретных стенограмм. Важно отметить, что многочисленные трансгенные линии рыбы также существуют в соответствии с которой флуоресцентные белки выражаются линии конкретных промоутеров, что позволяет маркировки конкретных клеток крови сфлуоресцентными белками 11. Это позволяет исследователям выполнять до минуты наблюдения генезиса клеток крови, расширение и регулирование в живом организме с течением времени.
В целом, сохранение гематопоэтической системы, наличие и легкое развитие трансгенных линий, легкая визуализация и короткое время генерации сделали зебру экономичной, быстрой и адаптируемой моделью гематопоэза. Чтобы улучшить набор инструментов, доступных для исследователей зебры, мы разработали этот анализ, чтобы надежно количественно количество клеток крови в эмбрионах. Метод включает переваривание трансгенных животных и выполнение цитометрии потока для флуоресцентных клеток крови. Таким образом, клетки крови животных-мутантов, эффект модификации MO и CRISPR, а также эффект малых молекул могут быть количественно проанализированы в быстрой и воспроизводимой манере. Эти анализы являются удобными и экономичными способами перечисления клеток крови, что позволяет с течением времени изутовить их генерацию, распространение и техническое обслуживание.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml MCF tube</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm Polystyrene easygrip Petri dish</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria Fusion flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiolthreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14080-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 500 mL</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone PBS (1x)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>sh30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Librease</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>dissociation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>11459643001</td>
			<td>dechorionation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red Dead Cell Stain</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish

Разнообразие клеточных линий, составляющих зрелую кровь у позвоночных животных, возникает в результате дифференциации гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников (ГСПК). Это критический процесс, который происходит на протяжении всей жизни организмов, и нарушение молекулярных путей, участвующих во время эмбриогенеза может иметь катастрофические долгосрочные последствия. По множеству причин,зебрафиш (Danio rerio) стала моделью организма для изучения гематопоеза. Эмбрионы зебры развиваются внешне, и к 7 дням постферизайние (dpf) произвело большинство подтипов окончательных клеток крови, которые будут сохраняться в течение их жизни. Анализы для оценки количества гематопоэтических клеток были разработаны, в основном с использованием конкретных гистологических пятен, на месте методы гибридизации, и микроскопия трансгенных животных, которые используют клетки крови конкретных промоутеров вождения выражение флуоресцентных белков. Тем не менее, большинство окрашивания анализы и на месте методы гибридизации точно не количественно количество клеток крови настоящее время; только большие различия в числах клеток легко визуализированы. Использование трансгенных животных и анализ лиц с флуоресцентной или конфокаленной микроскопией может быть выполнена, но количественная оценка этих анализов зависит либо от подсчета вручную, либо от использования дорогостоящего программного обеспечения для визуализации, оба из которых могут делать ошибки. Разработка дополнительных методов для оценки количества клеток крови будет экономичной, быстрее, и даже может быть автоматизирована, чтобы быстро оценить влияние CRISPR-опосредованные генетической модификации, морфолино-опосредованное сокращение стенограммы, и влияние лекарственных соединений, которые влияют на гематопоеза в больших масштабах. Этот новый анализ количественных клеток крови выполняется путем разобщенности целых эмбрионов зебры и анализа количества флуоресцентно помеченных клеток крови присутствует. Эти анализы должны позволить выяснение молекулярных путей, ответственных за генерацию клеток крови, расширение и регулирование во время эмбриогенеза, что позволит исследователям в дальнейшем обнаружить новые факторы, измененные во время заболеваний крови, а также пути, необходимые во время эволюции позвоночных гематопоэз.

Чтобы перечислить красные кровяные тельца в эмбриональных зебры, lcr:GFP16 эмбрионов были введены на одноклеточной стадии с PBS, 7,0 нг/nL ism1 MO, или 7,0 нг/ nL ism1 MO с 7,0 нг ism1 mRNA12. При 48 л.с. они перевариваются и подвергаются анализу цитоме...

Watch this Scientific Journal Video about Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish at JoVE.com

Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

Этот анализ является простым методом количественно гематопоэтических клеток в развивающихся эмбриональных зебры. Клетки крови от диссоциированных зебры подвергаются анализу цитометрии потока. Это позволяет выявлять дефекты крови у животных-мутантов и после генетической модификации.

Использование цитометрии потока для обнаружения и количественного изменения формации крови в развивающейся зебрефиш

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...

Этот протокол имеет важное значение, поскольку он позволяет нокдаун и чрезмерное выражение генов в развивающихся рыб, и количественной оценки этих вниз по течению воздействие на клетки крови. Этот протокол является быстрым, простым в работе, экономичным и простым в автоматизации с доступом к надлежащему инструментарию. Демонстрация этой процедуры будет Кристен Rueb, студент исследователь в лаборатории.Начните с переноса от пяти до 200, 48 часов после оплодотворения эмбрионов в пластиковые 10 сантиметров Петри блюдо. Наклоните блюдо так эмбриона опускаться до нижнего края, и удалить как можно больше E3 среды из блюда, как это возможно. Затем добавьте 500 микролитров протеазы деторионации к эмбрионам.После пяти минут при комнатной температуре, наконечник всех эмбрионов на нижний край пластины снова и осторожно нажмите сторону блюда, что позволяет эмбрионам аккуратно руб против нижней части пластины, чтобы полностью удалить их хорионов. Использование выжать бутылку добавить около 20 миллилитров E3 среды, чтобы разбавить протеазы, и позволяют эмбрионам осесть. Затем декант среды, и промыть эмбрионы еще три раза со свежей среде, как только что продемонстрировали, чтобы удалить все следы протеазы.Чтобы подготовить эмбрионы к диссоциации, используйте трубу P1000 для переноса от пяти до 10 эмбрионов в одну, 1,5 миллилитровую микро центрифугу и аспирировать перенесенную среду E3. Затем добавьте один миллилитр 10 миллимолярной DTT в E3 среды эмбриональной зебры, и поместите микроцентрифуг трубки в горизонтальном положении в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы удалить слизистое покрытие. Для диссоциации эмбрионов, мыть DTT лечение эмбрионов три раза с одним миллилитр DPBS дополняется кальцием и магнием на стирку.Перед добавлением 500 микролитров DPBS, дополненных кальцием и магнием, и пять микролитров по пять миллиграммов на миллилитр, диссоциации протеазы. Затем инкубировать образцы при 37 градусах по Цельсию на горизонтальном орбитальном шейкере при 185 оборотов в минуту в течение 60 минут. Будьте уверены, чтобы периодически проверять эмбрионы, так что вы не более переварить их.Когда не совсем однородный образец с некоторыми твердых тканей настоящее время можно наблюдать, тритурировать эмбрионы с P1000 пипетки до образца полностью разобщены. Чтобы подготовить диссоциированные эмбриональные клетки зебры для цитометрии потока, перенесите весь образец клетки на верхний резервуар пятими миллилитров полистирола круглой нижней трубки, с 35 микрометровым клеточным ситечком крышки. Промыть крышку четырьмя миллилитров PBS без кальция или магния, и гранулы клеток центрифугации.Затем повторное потребление клеток в 500 микролитров PBS без кальция и магния на трубку. Для цитометрического анализа потока эмбриональных клеток зебры, осторожно вихрем клеточных суспензий, прежде чем добавить от одной до одной тысячи разбавления красного пятна мертвых клеток в каждой трубке. В течение 30 минут после нанесения пятна мертвой клетки, опорожнить резервуар для отходов, заполнить оболочку бак с соответствующим раствором, и начать жидкостную систему потока цитометра.В программном обеспечении анализа нарисуйте пять участков и установите первый сюжет для измерения вперед и бокового рассеяния. Установите вперед рассеяния к линейной, и боковой рассеяния для logarithmic. Установите второй участок для измерения высоты рассеяния вперед по сравнению с шириной рассеяния вперед, а третий участок для измерения высоты рассеяния по сравнению с шириной бокового рассеяния.Установите четвертый участок для измерения красного пятна мертвых клеток на х-оси, и боковой рассеяния по оси, чтобы дискриминация жить из мертвых клеток. Пятый участок должен быть установлен для измерения флюорофора выбора. Когда все участки будут установлены, загрузите образец на цитометр и уменьшите скорость потока, чтобы клетки не закончились быстро.Отрегулируйте настройки перемотки вперед и сбоку так, чтобы основная часть популяции клеток была четко замечена, и нарисуйте ворота вокруг популяции клеток. Наклеить этикетку на эти ячейки ворот. Со второй точкой участок закрыты на клетки, ворота на вперед рассеяния и боковой рассеяния синглетов, чтобы исключить дублеты.На четвертом участке отрегулируйте настройки пятна красных мертвых клеток так, чтобы была явно отрицательная популяция. Нарисуйте ворота вокруг этих ячеек и обозначить эти ворота живыми клетками. В пятом участке, ворота на живых клетках и нарисовать ворота вокруг положительных клеток, а затем запустить каждый образец сбора по крайней мере 25000 живых событий ячейки.Когда все образцы были проанализированы, следуйте процедуре выключения, чтобы выключить жидкость, пополнить оболочку бака и опорожнить резервуар для отходов. После анализа процент GFP положительных красных кровяных телец из каждого эмбрионального образца зебры, в среднем все контрольной группы могут быть рассчитаны. Как правило, среднее значение устанавливается как один, и все проценты рассчитываются с этой точки отсчета.В этом репрезентативном анализе было установлено, что уменьшение ISM1 стенограммы с конкретным морфолино, уменьшить количество GFP положительных красных кровяных телец, присутствующих в течение 48 часов после оплодотворения эмбрионов. Спасая это снижение уровня морфолино ISM1 с экзогенной мРНК, вернуть количество красных кровяных телец в нормальное русло. Правильное пищеварение на образцах имеет решающее значение.Если вы перевариваете или перевариваете, вы не получите правильных результатов. Если факс доступен, исследователи могут собирать клетки крови путем сортировки для культуры in vitro, секвенирования РНК и количественного RT-PCR.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Анализ данио рерио Личинки скелетных мышц целостности с синий краситель Эванса

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Методика Целевой показатель микроинъекции к проявляющему<em&gt; Xenopus</em&gt; почки

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Использование Light Sheet флуоресцентной микроскопии для изображения развития данио глаз

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Идентификация эритромиелоидных прародителей и их потомство в мышечном эмбрионе методом проточной цитометрии

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Разделительный и анализ клеток поджелудочной железы мезенхимы с помощью проточной цитометрии

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Хондрогенное образование гранул из индуцированных пуповинной клеткой флуоресцентных стволовых клеток

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Разработка в Vitro Assay чтобы Quantitate гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPCs) в развитии эмбрионов у рыбок данио

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Использование трансплантации гемопоэтических стволовых клеток для оценки происхождения миелодиспластический синдром

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

В реальном времени живой клетки проточной цитометрии расследовать приток кальция, порообразования и фагоцитоз, P2X7 рецепторы в клетках взрослых нейронных прародителя

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Целая гора В Ситу Гибридизация в зебрафиш эмбрионов и трубоусветки Ассав в iPSC-ECs для изучения роли эндоглин в сосудистом развитии

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...