Name: using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish
Uploaded: 2021-04-29T14:00:00
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La financiación fue proporcionada por los Institutos Nacionales de Salud (NIH: R15 DK114732-01 a D.L.S.), la Fundación Nacional de Ciencias (NSF: RMN 1626406 a D.L.S.), y del Programa de Honor en la Universidad Estatal chico de California (a K.F.R.). Los autores agradecen a Betsey Tamietti por la gestión de laboratorios y a Kathy Johns por su asistencia administrativa.

El consejo asesor del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Estatal de California, Chico, aprobó todos los métodos descritos a continuación.
NOTA: Se recomienda tratar embriones con 1-fenilo 2-tiourea (PTU; Tabla 1) a las 24 horas de postfertilización (HPF) para prevenir la pigmentación que afecta negativamente a la discriminación por fluorescencia por citometría de flujo. Todos los procedimientos enumerados a continuación son ace...

<ol>
	<li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish.">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li><li>Weinstein, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+mutations+in+the+zebrafish.">Hematopoietic mutations in the zebrafish.</a> Development. , 303-309 (1996).</li><li>Ransom, D. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+globin+switching+occurs+in+two+developmental+stages+and+is+controlled+by+the+LCR.">Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR.</a> Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish.">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106, 3803-3810 (2005).</li><li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish.">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, e1-e11 (2013).</li><li>Ding, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+High-Throughput+Flow+Cytometry+in+Early+Drug+Discovery:+An+AstraZeneca+Perspective.">Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective.</a> SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).</li><li>Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+flow+cytometry+for+drug+discovery:+principles,+applications,+and+case+studies.">High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies.</a> Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).</li><li>Joslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fully+Automated+High-Throughput+Flow+Cytometry+Screening+System+Enabling+Phenotypic+Drug+Discovery.">A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery.</a> SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).</li></ol>

El pez cebra es un excelente sistema modelo para estudiar la hematopoyesis de vertebrados primitiva y definitiva. En las últimas décadas, se han desarrollado y refinado múltiples ensayos, permitiendo que el pez cebra se convierta en un modelo rápido y económico para probar fármacos, generar y probar mutantes genéticos, y en general permitiendo a los investigadores analizar vías moleculares esenciales para la hematopoyesis. Este protocolo utiliza peces cebra embrionarios que permiten una recopilación rápida de d...

La producción de sangre (hematopoyesis) es un proceso de desarrollo esencial que comienza por primera vez en el embrión temprano. Este proceso comienza generando glóbulos rojos primitivos y macrófagos directamente a partir del mesodermo, y más tarde se desplaza hacia la producción de células madre hematopoyéticas y progenitoras (HSPCs). Estas células madre, que son multipotentes, generan todas las variedades de células sanguíneas maduras en el organismo. Capaz de auto-renovación, el sistema se repone continuamente a través de estos HSPCs. Mientras que este proceso comienza temprano en el desarrollo, hematopoyesis continúa durante la vida del animal, proporcionando la capacidad de transportar oxígeno a sitios distantes del cuerpo, para detener el sangrado después de la lesión, y para proteger el cuerpo de la infección. El desarrollo de este complejo sistema se controla temporal y espacialmente durante el desarrollo y cualquier perturbación en la producción de células sanguíneas puede ser catastrófico para el organismo, lo que resulta en anemia, trombocitopenia, leucopenia y leucemia.
Un modelo animal popular utilizado para la investigación hematopoyética es el pez cebra(Danio rerio)porque tienen un desarrollo sanguíneo similar en comparación con los seres humanos. De hecho, muchos de los genes y vías moleculares utilizados durante la hematopoyesis se conservan a lo largo de la evolución de los vertebrados, lo que nos permite aprender sobre los genes humanos estudiando el pez cebra. Es importante destacar que los embriones de pez cebra se desarrollan fuera del cuerpo y en 7 días han generado la mayoría de los tipos de células sanguíneas maduras, lo que permite la visualización directa del sistema hematopoyético en un corto período de tiempo. El pez cebra también es extremadamente fecunda, lo que permite a los investigadores observar un mayor número de muestras en un corto período de tiempo, lo que también es importante para generar datos reproducibles. El tiempo de corta generación y desarrollo externo del pez cebra prevé una manipulación y observación más sencillas durante los estudios de mutagénesis1,2,3,4,5 y cribado de drogas6,7,8,9,10. Esto permite que un panel de compuestos terapéuticos prometedores para los trastornos sanguíneos humanos se pruebe rápida y eficientemente.
Es importante destacar que los peces cebra también son genéticamente aptos, y el genoma se secuencia y anota. Esta tractabilidad permite realizar técnicas genéticas inversas como el derribo mediado por morpholino(MO)y la ablación genética mediada por CRISPR. Los peces cebra también han demostrado su utilidad como modelo para realizar pantallas genéticas delanteras; muchos genes esenciales y vías involucradas en la formación de sangre de vertebrados se han descubierto de esta manera. También se han desarrollado numerosos métodos de observación de células sanguíneas en peces cebra. Si bien existen técnicas tradicionales de tinción histológica, también es posible realizar la hibridación in situ para transcripciones específicas de la sangre. Es importante destacar que también existen numerosas líneas transgénicas de peces mediante las cuales las proteínas fluorescentes son expresadas por promotores específicos del linaje, permitiendo el etiquetado de células sanguíneas específicas con proteínas fluorescentes11. Esto permite a los investigadores realizar observaciones de hasta el minuto de génesis, expansión y regulación de células sanguíneas en un organismo vivo con el tiempo.
En general, la conservación del sistema hematopoyético, la presencia y el fácil desarrollo de líneas transgénicas, la fácil visualización y el corto tiempo de generación han hecho del pez cebra un modelo económico, rápido y adaptable de hematopoyesis. Para mejorar la caja de herramientas de técnicas disponibles para los investigadores de peces cebra, desarrollamos este ensayo para cuantificar sólidamente el número de células sanguíneas en embriones. El método consiste en digerir animales transgénicos y realizar citometría de flujo para glóbulos fluorescentes. De esta manera, las células sanguíneas de animales mutantes, el efecto de la modificación del MO y crispr, y el efecto de las moléculas pequeñas se pueden analizar cuantitativamente de una manera rápida y reproducible. Estos ensayos son formas fáciles de usar y económicas de enumerar las células sanguíneas, permitiendo el examen de su generación, proliferación y mantenimiento a lo largo del tiempo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml MCF tube</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm Polystyrene easygrip Petri dish</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria Fusion flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiolthreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14080-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 500 mL</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone PBS (1x)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>sh30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Librease</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>dissociation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>11459643001</td>
			<td>dechorionation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red Dead Cell Stain</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish

La diversidad de linajes celulares que comprenden sangre madura en animales vertebrados surge de la diferenciación de células hematopoyéticas madre y progenitoras (HSPCs). Este es un proceso crítico que ocurre a lo largo de la vida útil de los organismos, y la interrupción de las vías moleculares implicadas durante la embriogénesis puede tener consecuencias catastróficas a largo plazo. Por multitud de razones, el pez cebra(Danio rerio)se ha convertido en un organismo modelo para estudiar la hematopoyesis. Los embriones de pez cebra se desarrollan externamente, y para 7 días la posfertilización (dpf) han producido la mayoría de los subtipos de células sanguíneas definitivas que persistirán durante su vida útil. Se han desarrollado ensayos para evaluar el número de células hematopoyéticas, utilizando principalmente manchas histológicas específicas, técnicas de hibridación in situ y microscopía de animales transgénicos que utilizan promotores específicos de células sanguíneas que impulsan la expresión de proteínas fluorescentes. Sin embargo, la mayoría de los ensayos de tinción y las técnicas de hibridación in situ no cuantifican con precisión el número de células sanguíneas presentes; sólo las grandes diferencias en el número de celdas se visualizan fácilmente. La utilización de animales transgénicos y el análisis de individuos con microscopía fluorescente o confocal se pueden realizar, pero la cuantificación de estos ensayos se basa en contar manualmente o utilizar software de imágenes costoso, ambos de los cuales pueden cometer errores. El desarrollo de métodos adicionales para evaluar el número de células sanguíneas sería económico, más rápido e incluso podría automatizarse para evaluar rápidamente el efecto de la modificación genética mediada por CRISPR, la reducción de transcripción mediada por morpholino y el efecto de los compuestos farmacológicos que afectan a la hematopoyesis a gran escala. Este nuevo ensayo para cuantificar las células sanguíneas se realiza desvinculando embriones enteros de pez cebra y analizando la cantidad de células sanguíneas etiquetadas fluorescentemente presentes. Estos ensayos deben permitir la aclaración de las vías moleculares responsables de la generación, expansión y regulación de células sanguíneas durante la embriogénesis, lo que permitirá a los investigadores descubrir aún más nuevos factores alterados durante las enfermedades de la sangre, así como vías esenciales durante la evolución de la hematopoyesis vertebrada.

Para enumerar los glóbulos rojos en el pez cebra embrionario, se inyectaron16 embriones lcr:GFP 16 en una etapa celular con PBS, 7.0 ng/nL ism1 MO, o 7.0 ng/nL ism1 MO con 7.0 ng ism1 mRNA12. A 48 CV fueron digeridos y sometidos a análisis de citometría de flujo. Después de analizar el porcentaje de GFP+ glóbulos rojos de cada muestra (cada muestra es 5 embriones seleccionados aleatoriament...

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Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

Este ensayo es un método simple para cuantificar las células hematopoyéticas en el desarrollo de peces cebra embrionarios. Los glóbulos del pez cebra disociado se someten a análisis de citometría de flujo. Esto permite la detección de defectos sanguíneos en animales mutantes y después de la modificación genética.

Uso de la citometría de flujo para detectar y cuantificar la formación de sangre alterada en el pez cebra en desarrollo

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...

Este protocolo es significativo porque permite la eliminación y sobreexpresión de los genes en un pez en desarrollo, y la cuantificación de esos efectos aguas abajo en las células sanguíneas. Este protocolo es rápido, fácil de realizar, económico y fácil de automatizar con acceso a la instrumentación adecuada. Demostrando este procedimiento estará Kristen Rueb, una investigadora de pregrado en el laboratorio.Comience transfiriendo entre cinco y 200, 48 horas después de los embriones de fertilización a una placa de plástico petri de 10 centímetros. Incline el plato para que el embrión se hunda hasta el borde inferior, y retire tanto medio E3 del plato como sea posible. A continuación, añadir 500 microlitros de proteasa de deschorionación a los embriones.Después de cinco minutos a temperatura ambiente, coloque todos los embriones en el borde inferior de la placa de nuevo y toque suavemente el lado del plato, permitiendo que los embriones se froten suavemente contra la parte inferior de la placa para quitar completamente sus corales. Con una botella de compresión añadir aproximadamente 20 mililitros de medio E3 para diluir la proteasa, y permitir que los embriones se asienten. A continuación, decantar el medio, y enjuagar los embriones tres veces más con medio fresco como se acaba de demostrar para eliminar todos los rastros de la proteasa.Para preparar los embriones para la disociación, utilice una pipeta P1000 para transferir de cinco a 10 embriones en un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros y aspire el medio E3 transferido. A continuación, añadir un mililitro de 10 mililitros de TDT en medio E3 al pez cebra embrionario, y colocar el tubo de microcentrífuga en una posición horizontal durante 30 minutos a temperatura ambiente para eliminar el recubrimiento de moco. Para la disociación de embriones, lave los embriones tratados con TDT tres veces con un mililitro de DPBS complementado con calcio y magnesio por lavado.Antes de añadir 500 microlitros de DPBS complementados con calcio y magnesio, y cinco microlitros de cinco miligramos por mililitro, proteasa de disociación. Luego incuba las muestras a 37 grados Celsius en una coctelera orbital horizontal a 185 revoluciones por minuto durante 60 minutos. Asegúrese de revisar periódicamente los embriones, para que no los digiere en exceso.Cuando se pueda observar una muestra no completamente homogénea con algún tejido sólido presente, triturar los embriones con una pipeta P1000 hasta que la muestra esté completamente disociada. Para preparar las células embrionarias de pez cebra disociadas para la citometría de flujo, transfiera toda la muestra celular al depósito superior de un tubo inferior redondo de poliestireno de cinco mililitros, con una tapa de colador celular de 35 micrómetros. Enjuague la tapa con cuatro mililitros de PBS sin calcio o magnesio, y pegue las células por centrifugación.A continuación, resuspend las células en 500 microlitros de PBS sin calcio y magnesio por tubo. Para el análisis citométrico de flujo de las células embrionarias del pez cebra, vórtice suavemente las suspensiones celulares antes de agregar una dilución de uno a mil de la mancha de células muertas rojas a cada tubo. A los 30 minutos de aplicar la mancha de celda muerta, vacíe el tanque de residuos, llene el tanque de vaina con la solución adecuada e inicie el sistema fluido del cytómetro de flujo.En el software de análisis, dibuje cinco trazados y establezca el primer trazado para medir hacia delante frente a la dispersión lateral. Establezca la dispersión hacia delante en lineal y el lado se dispersará a logarítmico. Establezca el segundo trazado para medir la altura de dispersión hacia delante frente al ancho de dispersión hacia delante, y el tercer trazado para medir la altura de dispersión frente al ancho de dispersión lateral.Establezca el cuarto trazado para medir la mancha roja de la célula muerta en el eje X y la dispersión lateral en el eje y para permitir la discriminación de vivir de las células muertas. La quinta parcela debe fijarse para medir el fósforo de elección. Cuando se hayan establecido todas las gráficas, cargue la muestra en el citómetro y reduzca el caudal para que las celdas no se agoten rápidamente.Ajuste los ajustes de dispersión hacia delante y hacia el lado para que la mayor parte de la población celular se pueda observar claramente y dibuje una puerta alrededor de la población celular. Etiquete las celdas de esta puerta. Con la segunda gráfica de puntos cerrada en las celdas, la puerta en la dispersión hacia adelante y los singletes de dispersión laterales para excluir los dobletes.En la cuarta gráfica, ajuste la configuración de la mancha roja de la célula muerta para que haya una población claramente negativa. Dibuje una puerta alrededor de estas celdas y etiquete las celdas vivas de esta puerta. En el quinto trazado, puerta en las celdas vivas y dibujar una puerta alrededor de las celdas positivas, a continuación, ejecutar cada muestra recogiendo al menos 25.000 eventos de células vivas.Cuando se hayan analizado todas las muestras, siga el procedimiento de apagado para apagar los fluidos, rellenar el depósito de vaciones y vaciar el depósito de residuos. Después de analizar el porcentaje de glóbulos rojos positivos de GFP de cada muestra embrionaria de pez cebra, se puede calcular el promedio de todo el grupo de control. Normalmente, el promedio se establece como uno y todos los porcentajes se calculan a partir de este punto de referencia.En este análisis representativo, se determinó que la reducción de la transcripción del ISM1 con un morfolino específico, reduce el número de glóbulos rojos positivos de GFP presentes dentro de las 48 horas posteriores a los embriones de fertilización. Rescatar esta reducción en los niveles de morfolino ISM1 con ARNm exógeno, devolver el número de glóbulos rojos a la normalidad. La digestión adecuada en las muestras es fundamental.Si digiere o infra-digiere, no obtendrá los resultados correctos. Si hay una máquina de fax disponible, los investigadores pueden recoger las células sanguíneas ordenando para cultivo in vitro, secuenciación de ARN y RT-PCR cuantitativo.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Técnica de microinyección a Target a los países en desarrollo<em&gt; Xenopus</em&gt; riñón

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Utilización de hojas de luz de microscopía de fluorescencia a la imagen de ojo de pez cebra Desarrollo

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identificación de progenitores eritromioideos y su progenie en el embrión de ratón por citometría de flujo

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Aislar y analizar células del páncreas mesénquima por Citometría de Flujo

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Formación de gránulos condrogénicos a partir de células madre pluripotentes inducidas derivadas de sangre del cordón umbilical

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Desarrollo de un ensayo In Vitro para cuantificar Progenitor y vástago hematopoyética células (HSPCs) en el desarrollo de embriones de pez cebra

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Uso de trasplante de células madre hematopoyéticas para evaluar el origen del síndrome mielodisplásico

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Citometría de flujo en tiempo real de células vivas para investigar la afluencia del calcio, formación de poro y fagocitosis por los receptores P2X7 en células progenitoras neurales adultas

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Hibridación en situ de montaje completo en embriones de pez cebra y ensayo de formación de tubos en iPSC-CE para estudiar el papel de la endoglina en el desarrollo vascular

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...