Name: using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish
Uploaded: 2021-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish at JoVE.com

Finansiering tillhandahölls av National Institutes of Health (NIH: R15 DK114732-01 till D.L.S.), National Science Foundation (NSF: MRI 1626406 till D.L.S.), och från Honor's Program vid California State University Chico (till K.F.R.). Författarna tackar Betsey Tamietti för laboratorieledningen och Kathy Johns för administrativ hjälp.

Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) rådgivande nämnd vid California State University, Chico, godkände alla metoder som beskrivs nedan.
OBS: Det rekommenderas att behandla embryon med 1-fenyl 2-thiourea (PTU; Tabell 1) vid 24 timmars postfertilisering (hpf) för att förhindra pigmentering som negativt påverkar fluorescensdiskriminering genom flödescytometri. Alla procedurer som listas nedan är acceptabla för flödescytometri och fluorescensaktiverad cell...

<ol>
	<li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish.">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li><li>Weinstein, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+mutations+in+the+zebrafish.">Hematopoietic mutations in the zebrafish.</a> Development. , 303-309 (1996).</li><li>Ransom, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+mutants+with+defects+in+embryonic+hematopoiesis.">Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis.</a> Development. 123, 311-319 (1996).</li><li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+insertional+mutagenesis+screen+in+zebrafish.">A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish.</a> Genes &amp; Development. 13, 2713-2724 (1999).</li><li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish.">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383, 829-832 (1996).</li><li>Yeh, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+chemical+modifiers+of+oncogene-regulated+hematopoietic+differentiation.">Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation.</a> Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).</li><li>Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+genetic+screen+in+zebrafish+for+pathways+interacting+with+cdx4+in+primitive+hematopoiesis.">A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis.</a> Zebrafish. 7, 61-68 (2010).</li><li>Ridges, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+screen+identifies+novel+compound+with+selective+toxicity+against+leukemia.">Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia.</a> Blood. 119, 5621-5631 (2012).</li><li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis.">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447, 1007-1011 (2007).</li><li>Astuti, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+Bioluminescent+Zebrafish+Screen+for+Enhancing+Hematopoietic+Cell+Homing.">A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing.</a> Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).</li><li>Stachura, D. L., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dissection+of+zebrafish+hematopoiesis.">Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis.</a> Methods in Cell Biology. 133, 11-53 (2016).</li><li>Berrun, A. C., Stachura, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+In+Vitro+Assay+to+Quantitate+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+(HSPCs)+in+Developing+Zebrafish+Embryos.">Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56836 (2017).</li><li>Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Essential Zebrafish Methods: Cell and Developmental Biology. , (2009).</li><li>Drummond, I. A., Davidson, A. J., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Kidney+Development.">Zebrafish Kidney Development.</a> The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A. 100, 233-260 (2010).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature Immunology. 4, 1238-1246 (2003).</li><li>Ganis, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+globin+switching+occurs+in+two+developmental+stages+and+is+controlled+by+the+LCR.">Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR.</a> Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish.">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106, 3803-3810 (2005).</li><li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish.">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, e1-e11 (2013).</li><li>Ding, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+High-Throughput+Flow+Cytometry+in+Early+Drug+Discovery:+An+AstraZeneca+Perspective.">Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective.</a> SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).</li><li>Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+flow+cytometry+for+drug+discovery:+principles,+applications,+and+case+studies.">High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies.</a> Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).</li><li>Joslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fully+Automated+High-Throughput+Flow+Cytometry+Screening+System+Enabling+Phenotypic+Drug+Discovery.">A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery.</a> SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).</li></ol>

Zebrafisk är ett utmärkt modellsystem för att studera primitiva och definitiva ryggradsdjur hematopoiesis. Under de senaste decennierna har flera analyser utvecklats och förfinats, vilket gör det möjligt för zebrafisk att bli en snabb och ekonomisk modell för att testa läkemedel, generera och testa genetiska mutanter och totalt sett göra det möjligt för forskare att analysera molekylära vägar som är väsentliga för hematopoiesis. Detta protokoll använder embryonala zebrafiskar som möjliggör snabb datai...

Blodproduktion (hematopoiesis) är en viktig utvecklingsprocess som först börjar i det tidiga embryot. Denna process börjar med att generera primitiva röda blodkroppar och makrofager direkt från mesoderm, och skiftar senare mot produktion av hematopoetiska stam- och stamceller (HSPCs). Dessa stamceller, som är multipotenta, genererar alla sorter av mogna blodkroppar i organismen. Systemet kan förnya sig själv och fylls kontinuerligt på via dessa HSPC:er. Medan denna process börjar tidigt i utvecklingen, fortsätter hematopoiesis för djurets liv, vilket ger möjlighet att transportera syre till avlägsna platser i kroppen, att sluta blöda efter skada och att skydda kroppen från infektion. Utvecklingen av detta komplexa system kontrolleras tidsmässigt och rumsligt under utveckling och eventuella förändringar i blodcellsproduktionen kan vara katastrofala för organismen, vilket resulterar i anemi, trombocytopeni, leukopeni och leukemi.
En populär djurmodell som används för hematopoetisk forskning är zebrafisken (Danio rerio) eftersom de har liknande blodutveckling jämfört med människor. Faktum är att många av de gener och molekylära vägar som används under hematopoiesis bevaras genom hela ryggradsdjursutvecklingen, så att vi kan lära oss om mänskliga gener genom att studera zebrafisk. Viktigt är att zebrafiskembryon utvecklas utanför kroppen och inom 7 dagar har genererat de flesta mogna blodcellstyper, vilket möjliggör direkt visualisering av det hematopoetiska systemet på kort tid. Zebrafisk är också extremt fecund, vilket gör det möjligt för forskare att observera ett större antal prover på kort tid, vilket också är viktigt för att generera reproducerbara data. Zebrafiskens korta generationstid och externa utveckling ger lättare manipulering och observation under mutagenesstudier1,2,3,4,5 och läkemedelsscreening6,7,8,9,10. Detta gör det möjligt att snabbt och effektivt testa en panel av lovande terapeutiska föreningar för mänskliga blodsjukdomar.
Viktigt är att zebrafisk också är genetiskt mottaglig, och genomet är sekvenserat och kommenterat. Denna kantbarhet gör det möjligt att utföra omvända genetiktekniker som morpholino- (MO-) medierad knockdown och CRISPR-medierad genetisk ablation. Zebrafisk har också bevisat sitt användbarhet som modell för att utföra framåtriktade genetiska skärmar; många viktiga gener och vägar som är involverade i ryggradsdjur blod bildas har upptäckts på detta sätt. Många metoder för att observera blodkroppar har också utvecklats i zebrafisk. Medan traditionella histologiska färgningstekniker finns, är det också möjligt att utföra in situ hybridisering för blodspecifika transkriptioner. Det är viktigt att det finns många transgena fiskartlinjer där fluorescerande proteiner uttrycks av härstamningsspecifika promotors, vilket gör det möjligt att märka specifika blodkroppar med fluorescerandeproteiner 11. Detta gör det möjligt för forskare att utföra den snabba observationen av blodcellsuppkomst, expansion och reglering i en levande organism över tid.
Sammantaget har bevarandet av det hematoopoetiska systemet, närvaron och den enkla utvecklingen av transgena linjer, enkel visualisering och kort generationstid gjort zebrafisken till en ekonomisk, snabb och anpassningsbar modell av hematopoiesis. För att förbättra verktygslådan med tekniker tillgängliga för zebrafiskforskare utvecklade vi denna analys för att robust kvantifiera antalet blodkroppar i embryon. Metoden innebär att smälta transgena djur och utföra flödescytometri för fluorescerande blodkroppar. På detta sätt kan blodkroppar från muterade djur, effekten av MO- och CRISPR-modifiering och effekten av små molekyler kvantitativt analyseras på ett snabbt och reproducerbart sätt. Dessa analyser är användarvänliga och ekonomiska sätt att räkna upp blodkroppar, vilket möjliggör undersökning av deras generation, spridning och underhåll över tid.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml MCF tube</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm Polystyrene easygrip Petri dish</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria Fusion flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiolthreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14080-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 500 mL</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone PBS (1x)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>sh30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Librease</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>dissociation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>11459643001</td>
			<td>dechorionation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red Dead Cell Stain</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish

Mångfalden av cellstammar som består av moget blod hos ryggradsdjur härrör från differentiering av hematopoetiska stam- och stamceller (HSPCs). Detta är en kritisk process som sker under organismers hela livslängd, och störningar av de molekylära vägarna som är involverade under embryogenes kan få katastrofala långsiktiga konsekvenser. Av en mängd olika skäl har zebrafisk (Danio rerio) blivit en modellorganism för att studera hematopoiesis. Zebrafiskembryon utvecklas externt, och med 7 dagar efter efterfertilisering (dpf) har producerat de flesta subtyperna av definitiva blodkroppar som kommer att kvarstå under sin livstid. Analyser för att bedöma antalet hematopoetiska celler har utvecklats, främst med hjälp av specifika histologiska fläckar, in situ hybridiseringstekniker och mikroskopi av transgena djur som använder blodcellsspecifika promotors som driver uttrycket av fluorescerande proteiner. De flesta färgningsanalyser och hybridiseringstekniker på plats kvantifierar dock inte exakt antalet närvarande blodkroppar. Endast stora skillnader i cellantal visualiseras enkelt. Att använda transgena djur och analysera individer med fluorescerande eller konfokal mikroskopi kan utföras, men kvantifieringen av dessa analyser förlitar sig på att antingen räkna manuellt eller använda dyr bildprogramvara, som båda kan göra fel. Utveckling av ytterligare metoder för att bedöma blodcellsnummer skulle vara ekonomisk, snabbare och kan till och med automatiseras för att snabbt bedöma effekten av CRISPR-medierad genetisk modifiering, morpholino-medierad transkriptionsminskning och effekten av läkemedelsföreningar som påverkar hematopoiesis i stor skala. Denna nya analys för att kvantifiera blodkroppar utförs genom att dissociera hela zebrafiskembryon och analysera mängden fluorescerande märkta blodkroppar som finns. Dessa analyser bör möjliggöra klargörande av molekylära vägar som ansvarar för blodcellsgenerering, expansion och reglering under embryogenes, vilket gör det möjligt för forskare att ytterligare upptäcka nya faktorer som förändrats under blodsjukdomar, liksom vägar som är väsentliga under utvecklingen av ryggradsdjur hematopoiesis.

För att räkna upp röda blodkroppar i embryonal zebrafisk injicerades lcr:GFP16 embryon i encellsstadiet med PBS, 7,0 ng/nL ism1 MO, eller 7, 0 ng/nL ism1 MO med 7,0 ng ism1 mRNA12. Vid 48 hpf smältes de och utsattes för flöde cytometri analys. Efter att ha analyserat procentandelen GFP+ röda blodkroppar från varje prov (varje prov är 5 slumpmässigt utvalda embryon; <strong class="xfig"...

Watch this Scientific Journal Video about Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish at JoVE.com

Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

Denna analys är en enkel metod för att kvantifiera hematopoetiska celler för att utveckla embryonala zebrafiskar. Blodkroppar från dissocierade zebrafiskar utsätts för flödescytometrianalys. Detta gör det möjligt att upptäcka bloddefekter hos muterade djur och efter genetisk modifiering.

Använda flödescytometri för att upptäcka och kvantifiera förändrad blodbildning i den utvecklande zebrafisken

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...

Detta protokoll är betydelsefullt eftersom det tillåter knockdown och över uttryck av gener i en utvecklande fisk, och kvantifieringen av dessa nedströms effekter på blodkroppar. Detta protokoll är snabbt, lätt att utföra, ekonomiskt och lätt att automatisera med tillgång till rätt instrumentering. Kristen Rueb, grundforskare i laboratoriet, demonstrerar detta förfarande.Börja med att överföra mellan fem och 200, 48 timmar efter befruktning embryon i en plast 10 centimeter Petri skål. Luta skålen så att embryot sjunker till bottenkanten och ta bort så mycket E3 medium från skålen som möjligt. Tillsätt sedan 500 mikroliter dechorionation protease till embryona.Efter fem minuter vid rumstemperatur, tippa alla embryon till bottenkanten av plattan igen och knacka försiktigt på sidan av skålen, så att embryona försiktigt kan gnugga mot botten av plattan för att helt ta bort sina chorions. Använd en klämflaska tillsätt cirka 20 milliliter E3-medium för att späda ut proteasen och låta embryona sätta sig. Dekantera sedan mediet och skölj embryona ytterligare tre gånger med färskt medium som bara visat sig ta bort alla spår av proteasen.För att förbereda embryona för dissociation, använd en P1000-pipett för att överföra fem till tio embryon till ett, 1,5 milliliter mikrocentrifugrör och aspirera det överförda E3-mediet. Tillsätt sedan en milliliter 10 millimolar DTT i E3 medium till den embryonala zebrafisken och placera mikrocentrifugröret i horisontellt läge i 30 minuter vid rumstemperatur för att ta bort slembeläggningen. För embryodisociation, tvätta de DTT-behandlade embryona tre gånger med en milliliter DPBS kompletterat med kalcium och magnesium per tvätt.Innan du lägger till 500 mikroliter DPBS kompletterat med kalcium och magnesium, och fem mikroliter på fem milligram per milliliter, dissociation protease. Inkubera sedan proverna vid 37 grader Celsius på en horisontell orbital shaker vid 185 varv per minut i 60 minuter. Var noga med att regelbundet kontrollera embryona, så att du inte översmält dem.När ett inte helt homogent prov med viss fast vävnad kan observeras, triturera embryona med en P1000-pipett tills provet är helt dissocierat. För att förbereda de dissocierade zebrafiskens embryonala celler för flödescytometri, överför hela cellprovet till den övre behållaren på ett fem millimeters polystyren runt bottenröret, med ett 35 mikrometer cellsillock. Skölj locket med fyra milliliter PBS utan kalcium eller magnesium och pellet cellerna genom centrifugation.Återanvänd sedan cellerna i 500 mikroliter PBS utan kalcium och magnesium per rör. För flödescytometrisk analys av zebrafiskens embryonala celler, vifta försiktigt cellupphängningen innan du lägger till en till tusen utspädning av röd död cellfläck till varje rör. Inom 30 minuter efter applicering av den döda cellfläcken, töm avfallstanken, fyll manttanken med lämplig lösning och starta flödescytometerns fluidiska system.I analysprogramvaran ritar du fem diagram och ställer in den första tomten för att mäta framåt kontra sidospridning. Ställ in den främre scattern på linjär och sidospridningen till logaritmisk. Ställ in det andra området för att mäta framåtspridningshöjd kontra framåtspridningsbredd och det tredje området för att mäta spridningshöjd kontra sidospridningsbredd.Ställ in den fjärde tomten för att mäta den röda döda cellfläcken på x-axeln och sidospridning på y-axeln för att tillåta diskriminering av levande från döda celler. Den femte tomten bör ställas in för att mäta valfri fluorofor. När alla tomter har ställts in, ladda provet på cytometern och minska flödeshastigheten så att cellerna inte tar snabbt.Justera inställningarna för framåt- och sidospridning så att huvuddelen av cellpopulationen tydligt kan observeras och rita en grind runt cellpopulationen. Märk den här portcellerna. Med den andra punktdiagramn gated på cellerna, grind på framåt spridning och sidan sprida singlets för att utesluta dubbelgångare.I den fjärde tomten justerar du de röda döda cellfläcksinställningarna så att det finns en tydligt negativ population. Rita en grind runt cellerna och märk den här porten levande celler. I den femte tomten, grind på levande celler och rita en grind runt de positiva cellerna, kör sedan varje prov som samlar minst 25 000 livecellhändelser.När alla prover har analyserats, följ avstängningsproceduren för att stänga av fluidiken, fylla på manttanken och tömma avfallstanken. Efter att ha analyserat procentandelen GFP-positiva röda blodkroppar från varje embryonalt zebrafiskprov kan genomsnittet av hela kontrollgruppen beräknas. Vanligtvis anges medelvärdet som ett och alla procentsatser beräknas från den här referenspunkten.I denna representativa analys fastställdes det att minska ISM1-transkriptionen med en specifik morpholino, minska antalet GFP positiva röda blodkroppar som finns inom 48 timmar efter befruktning embryon. Rädda denna minskning av ISM1 morpholino nivåer med exogen mRNA, återföra antalet röda blodkroppar till det normala. Korrekt matsmältning på proverna är avgörande.Om du översmält eller undersmält dig får du inte rätt resultat. Om en fax finns tillgänglig kan forskare samla in blodkropparna genom att sortera efter in vitro-kultur, RNA-sekvensering och kvantitativ RT-PCR.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analys av Zebrafish Larver skelettmuskulatur Integrity med Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Teknik till Target mikroinjektion till utvecklings<em&gt; Xenopus</em&gt; Njure

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Använda ljus Sheet fluorescensmikroskopi till bild Zebrafish Eye utveckling

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identifikation av erytromyeloidprogenitorer och deras avkomma i musembryo med flödescytometri

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Isolera och analysera celler i bukspottkörteln mesenkym med flödescytometri

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Kondrogen pelletsbildning från Cord Blood-härledda inducerade Pluripotenta stamceller

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Utveckling av ett In Vitro -test att kvantifiera hematopoetiska stamceller och stamceller celler (HSPCs) utveckla zebrafiskar embryon

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Användning av hematopoetisk stamcellstransplantation att bedöma beskärningen av myelodysplastiskt syndrom

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Realtid Live-cell flödescytometri att undersöka kalcium tillströmning, Pore bildandet och fagocytos av P2X7-receptorer i vuxen neurala stamceller

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Helmonterad in situ-hybridisering i Zebrafish Embryon och Tube Formation Assay i iPSC-ECs att studera rollen av Endoglin i vaskulär utveckling

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...