Name: using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish
Uploaded: 2021-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish at JoVE.com

Fon, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH: R15 DK114732-01'den D.L.S.'e), Ulusal Bilim Vakfı (NSF: MRI 1626406'dan D.L.S.'e) ve California State University Chico'daki Onur Programı'ndan (K.F.R.'a) sağlandı. Yazarlar laboratuvar yönetimi için Betsey Tamietti'ye ve idari yardım için Kathy Johns'a teşekkür ediyor.

Kaliforniya Eyalet Üniversitesi, Chico'daki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) danışma kurulu, aşağıda açıklanan tüm yöntemleri onayladı.
NOT: Embriyoların 1-fenil 2-tiyoea (PTU; Tablo 1) akış sitometrisi ile floresan ayrımını olumsuz etkileyen pigmentasyonu önlemek için 24 saat postfertilizasyon (hpf). Aşağıda listelenen tüm prosedürler akış sitometrisi ve floresan ile aktive hücre sıralama (FACS) için kabul edilebilir. Bununla b...

<ol>
	<li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish.">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li><li>Weinstein, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+mutations+in+the+zebrafish.">Hematopoietic mutations in the zebrafish.</a> Development. , 303-309 (1996).</li><li>Ransom, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+mutants+with+defects+in+embryonic+hematopoiesis.">Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis.</a> Development. 123, 311-319 (1996).</li><li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+insertional+mutagenesis+screen+in+zebrafish.">A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish.</a> Genes &amp; Development. 13, 2713-2724 (1999).</li><li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish.">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383, 829-832 (1996).</li><li>Yeh, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+chemical+modifiers+of+oncogene-regulated+hematopoietic+differentiation.">Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation.</a> Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).</li><li>Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+genetic+screen+in+zebrafish+for+pathways+interacting+with+cdx4+in+primitive+hematopoiesis.">A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis.</a> Zebrafish. 7, 61-68 (2010).</li><li>Ridges, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+screen+identifies+novel+compound+with+selective+toxicity+against+leukemia.">Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia.</a> Blood. 119, 5621-5631 (2012).</li><li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis.">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447, 1007-1011 (2007).</li><li>Astuti, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+Bioluminescent+Zebrafish+Screen+for+Enhancing+Hematopoietic+Cell+Homing.">A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing.</a> Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).</li><li>Stachura, D. L., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dissection+of+zebrafish+hematopoiesis.">Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis.</a> Methods in Cell Biology. 133, 11-53 (2016).</li><li>Berrun, A. C., Stachura, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+In+Vitro+Assay+to+Quantitate+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+(HSPCs)+in+Developing+Zebrafish+Embryos.">Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56836 (2017).</li><li>Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Essential Zebrafish Methods: Cell and Developmental Biology. , (2009).</li><li>Drummond, I. A., Davidson, A. J., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Kidney+Development.">Zebrafish Kidney Development.</a> The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A. 100, 233-260 (2010).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature Immunology. 4, 1238-1246 (2003).</li><li>Ganis, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+globin+switching+occurs+in+two+developmental+stages+and+is+controlled+by+the+LCR.">Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR.</a> Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish.">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106, 3803-3810 (2005).</li><li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish.">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, e1-e11 (2013).</li><li>Ding, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+High-Throughput+Flow+Cytometry+in+Early+Drug+Discovery:+An+AstraZeneca+Perspective.">Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective.</a> SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).</li><li>Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+flow+cytometry+for+drug+discovery:+principles,+applications,+and+case+studies.">High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies.</a> Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).</li><li>Joslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fully+Automated+High-Throughput+Flow+Cytometry+Screening+System+Enabling+Phenotypic+Drug+Discovery.">A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery.</a> SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).</li></ol>

Zebra balığı, ilkel ve kesin omurgalı hematopoezleri incelemek için mükemmel bir model sistemidir. Son birkaç on yılda, zebra balıklarının ilaçları test etmek, genetik mutantları üretmek ve test etmek için hızlı ve ekonomik bir model haline gelmesine ve genel olarak araştırmacıların hematopoez için gerekli moleküler yolları analiz etmelerine izin sağlayan birden fazla test geliştirilmiş ve rafine edilmiştir. Bu protokol, hızlı veri toplanmasına, yetişkin hayvanlara göre daha az fiziksel ...

Kan üretimi (hematopoez) ilk olarak erken embriyoda başlayan önemli bir gelişim sürecidir. Bu süreç doğrudan mezodermden ilkel kırmızı kan hücreleri ve makrofajlar üreterek başlar ve daha sonra hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin (HSPC) üretimine doğru kayar. Çok güçlü olan bu kök hücreler, organizmadaki olgun kan hücrelerinin tüm çeşitlerini oluşturur. Kendini yenileyebilen sistem, bu HSPC'ler aracılığıyla sürekli olarak yenileniyor. Bu süreç gelişimin erken dönemlerinde başlarken, hematopoez hayvanın yaşamı için devam eder, vücudun uzak bölgelerine oksijen taşıma, yaralanma sonrası kanamayı durdurma ve vücudu enfeksiyondan koruma yeteneği sağlar. Bu karmaşık sistemin gelişimi, gelişim sırasında zamansal ve mekansal olarak kontrol edilir ve kan hücresi üretimindeki herhangi bir pertürbasyon organizma için felaket olabilir, bu da anemi, trombositopeni, lökopeni ve lösemi ile sonuçlanır.
Hematopoetik araştırmalar için kullanılan popüler bir hayvan modeli zebra balığıdır (Danio rerio) çünkü insanlara kıyasla benzer kan gelişimine sahiptirler. Aslında, hematopoez sırasında kullanılan genlerin ve moleküler yolların çoğu omurgalı evrim boyunca korunur ve zebra balıklarını inceleyerek insan genleri hakkında bilgi edinmemizi sağlar. Daha da önemlisi, zebra balığı embriyoları vücut dışında gelişir ve 7 gün içinde hematopoetik sistemin kısa sürede doğrudan görselleştirilmesini sağlayan en olgun kan hücresi tiplerini üretmiştir. Zebra balıkları ayrıca, araştırmacıların kısa bir zaman diliminde daha fazla sayıda numune gözlemlemelerini sağlayan ve tekrarlanabilir veriler üretmek için de önemli olan son derece fecund'dur. Zebra balığının kısa nesil süresi ve dış gelişimi, mutajensis çalışmaları1, 2 , 3,4, 5ve ilaç taraması 6,7,8,9,10sırasında daha kolay manipülasyon ve gözlem sağlar. Bu, insan kan bozuklukları için umut verici terapötik bileşiklerden oluşan bir panelin hızlı ve verimli bir şekilde test edilmesine izin verir.
Daha da önemlisi, zebra balıkları da genetik olarak uygundur ve genom sıralanır ve açıklamalır. Bu çekiş kabiliyeti morfotino- (MO-) aracılı nakavt ve CRISPR aracılı genetik ablasyon gibi ters genetik tekniklerin gerçekleştirilebilmesini sağlar. Zebra balıkları ayrıca ileri genetik ekranları gerçekleştirmek için bir model olarak yararlarını kanıtlamıştır; omurgalı kan oluşumunda rol oynayan birçok temel gen ve yol bu şekilde keşfedilmiştir. Zebra balıklarında kan hücrelerini gözlemlemek için çok sayıda yöntem de geliştirilmiştir. Geleneksel histolojik boyama teknikleri mevcut olmakla birlikte, kana özgü transkriptler için yerinde hibridizasyon yapmak da mümkündür. Daha da önemlisi, floresan proteinlerin soyuna özgü promotörler tarafından ifade edildiği ve belirli kan hücrelerinin floresan proteinlerle etiketlenmesine izin verdiği çok sayıda transgenik balık hattı da mevcuttur11. Bu, araştırmacıların zaman içinde canlı bir organizmada kan hücresi kökeni, genişlemesi ve regülasyonunun güncel gözlemini gerçekleştirmelerini sağlar.
Genel olarak, hematopoetik sistemin korunması, transgenik çizgilerin varlığı ve kolay gelişimi, kolay görselleştirme ve kısa nesil süre zebra balığını ekonomik, hızlı ve uyarlanabilir bir hematopoez modeli haline getirmiştir. Zebra balığı araştırmacıları için mevcut tekniklerin araç kutusunu geliştirmek için, embriyolardaki kan hücrelerinin sayısını sağlam bir şekilde kalibre etmek için bu tahlilini geliştirdik. Yöntem, transgenik hayvanların sindirilmesini ve floresan kan hücreleri için akış sitometrisinin gerçekleştirilmesidir. Bu şekilde, mutant hayvanlardan kan hücreleri, MO ve CRISPR modifikasyonunun etkisi ve küçük moleküllerin etkisi hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde nicel olarak analiz edilebilir. Bu tahliller, kan hücrelerini numaralandırmanın kullanıcı dostu ve ekonomik yollarıdır ve zaman içinde nesillerinin, çoğalmalarının ve bakımlarının incelenmesine izin verir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml MCF tube</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm Polystyrene easygrip Petri dish</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria Fusion flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiolthreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14080-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 500 mL</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone PBS (1x)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>sh30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Librease</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>dissociation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>11459643001</td>
			<td>dechorionation protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red Dead Cell Stain</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using flow cytometry to detect and quantitate altered blood formation in the developing zebrafish

Omurgalı hayvanlarda olgun kanı oluşturan hücre soylarının çeşitliliği hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin (HSPC' ler) farklılaşmasından kaynaklanmaktadır. Bu, organizmaların ömrü boyunca meydana gelen kritik bir süreçtir ve embriyogenez sırasında söz konusu moleküler yolların bozulması uzun vadeli felaket sonuçlar doğurabilir. Çok sayıda nedenden dolayı, zebra balığı (Danio rerio) hematopoez çalışmak için örnek bir organizma haline gelmiştir. Zebra balığı embriyoları dışarıdan gelişir ve 7 gün postfertilizasyon (dpf) ile yaşamları boyunca devam edecek kesin kan hücrelerinin alt tiplerinin çoğunu üretmiş olurlar. Hematopoetik hücrelerin sayısını değerlendirmek için, esas olarak spesifik histolojik lekeler, in situ hibridizasyon teknikleri ve floresan proteinlerin ekspresyonunu yönlendiren kan hücresine özgü promotörleri kullanan transgenik hayvanların mikroskopisi kullanılarak tahliller geliştirilmiştir. Bununla birlikte, çoğu boyama tahlilleri ve yerinde hibridizasyon teknikleri mevcut kan hücrelerinin sayısını doğru bir şekilde miktarlandırmaz; yalnızca hücre sayılarındaki büyük farklılıklar kolayca görselleştirilir. Transgenik hayvanların kullanılması ve floresan veya konfokal mikroskopisi olan bireylerin analiz edilmesi yapılabilir, ancak bu tahlillerin niceliği manuel olarak saymaya veya her ikisi de hata yapabilen pahalı görüntüleme yazılımı kullanmaya dayanır. Kan hücresi sayılarını değerlendirmek için ek yöntemlerin geliştirilmesi ekonomik, daha hızlı olacaktır ve hatta CRISPR aracılı genetik modifikasyonun, morfoino aracılı transkript azaltmanın ve hematopoezleri büyük ölçekte etkileyen ilaç bileşiklerinin etkisini hızlı bir şekilde değerlendirmek için otomatikleştirilebilir. Kan hücrelerini nicelleştirmek için yapılan bu yeni test, tüm zebra balığı embriyolarının ayrıştırularak ve floresan etiketli kan hücrelerinin miktarının analiz edilmesiyle gerçekleştirilir. Bu tahliller, embriyogenez sırasında kan hücresi üretimi, genişlemesi ve düzenlenmesinden sorumlu moleküler yolların aydınlatılmasına izin vermelidir, bu da araştırmacıların kan hastalıkları sırasında değiştirilen yeni faktörleri ve omurgalı hematopoezlerin evrimi sırasında gerekli yolları daha fazla keşfetmelerini sağlayacaktır.

Embriyonik zebra balıklarında kırmızı kan hücrelerini numaralandırmak için, lcr:GFP16 embriyoları pbs, 7.0 ng/nL ism1 MO veya 7.0 ng/nL ism1 MO ile tek hücreli aşamada enjekte edildi 7.0 ng ism1 mRNA12. 48 hpf'de sindirildiler ve akış sitometrisi analizine tabi tutuldular. Her örnekten GFP+ kırmızı kan hücrelerinin yüzdesini analiz ettikten sonra (her örnek rastgele seçilen ...

Watch this Scientific Journal Video about Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish at JoVE.com

Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

Bu tahlil, embriyonik zebra balığı geliştirmede hematopoetik hücreleri miktarlandırmak için basit bir yöntemdir. Ayrışmış zebra balıklarından alınan kan hücreleri akış sitometrisi analizine tabi tutulur. Bu, mutant hayvanlarda ve genetik modifikasyondan sonra kan kusurlarının tespit edilmesine izin verir.

Gelişmekte Olan Zebra Balıklarında Değiştirilmiş Kan Oluşumunu Tespit Etmek ve Nicel hale Getirmek için Akış Sitometrisini Kullanma

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...

Bu protokol önemlidir, çünkü gelişmekte olan bir balıktaki genlerin devrilmesine ve aşırı ifade edilmesine ve bu aşağı akış etkilerinin kan hücreleri üzerindeki nicelliğini sağlar. Bu protokol hızlı, gerçekleştirilmesi kolay, ekonomik ve uygun enstrümantasyona erişimle otomatikleştirilmesi kolaydır. Bu prosedürü laboratuvarda lisans araştırmacısı kristen Rueb gösterecektir.Döllenme embriyolarından sonra beş ila 200, 48 saat arasında plastik 10 santimetrelik bir Petri kabına transfer ederek başlayın. Embriyonun alt kenara batması için kabı eğin ve tabaktan mümkün olduğunca fazla E3 ortamı çıkarın. Daha sonra embriyolara 500 mikrolitre kaynatma proteaz ekleyin.Oda sıcaklığında beş dakika sonra, tüm embriyoları plakanın alt kenarına tekrar ucun ve kabın kenarına hafifçe dokunun, embriyoların korozyonlarını tamamen çıkarmak için plakanın altına hafifçe sürtünmesine izin verin. Bir sıkma şişesi kullanarak proteazı seyreltmek ve embriyoların yerleşmesine izin vermek için yaklaşık 20 mililitre E3 ortamı ekleyin. Daha sonra ortamı deklare edin ve embriyoları proteazın tüm izlerini gidermek için gösterildiği gibi taze ortamla üç kez daha durulayın.Embriyoları ayrışmaya hazırlamak için, beş ila 10 embriyoyu bir, 1,5 mililitre mikro santrifüj tüpüne aktarmak ve aktarılan E3 ortamını aspire etmek için bir P1000 pipet kullanın. Daha sonra embriyonik zebra balığına E3 ortamında bir mililitre 10 milimolar DTT ekleyin ve mukus kaplamasını çıkarmak için mikrosantrifüj tüpünü oda sıcaklığında 30 dakika yatay bir konuma yerleştirin. Embriyo ayrışması için, DTT tedavi edilen embriyoları yıkama başına kalsiyum ve magnezyum ile desteklenmiş bir mililitre DPBS ile üç kez yıkayın.Kalsiyum ve magnezyum ile desteklenmiş 500 mikrolitre DPBS ve mililitre başına beş miligram beş mikrolitre eklemeden önce, ayrışma proteaz. Daha sonra örnekleri 37 santigrat derecede yatay bir yörüngesel çalkalayıcıda dakikada 185 devirde 60 dakika kuluçkaya yatırın. Embriyoları periyodik olarak kontrol ettiğinizden emin olun, böylece onları fazla sindirmeyin.Bazı katı dokulara sahip tamamen homojen olmayan bir örnek gözlenebildiğinde, embriyoları bir P1000 pipeti ile numune tamamen dağılana kadar tritüre edin. Ayrışmış zebra balığı embriyonik hücrelerini akış sitometrisi için hazırlamak için, tüm hücre örneğini 35 mikrometre hücre süzgeç kapağı ile beş mililitre polistiren yuvarlak alt tüpün üst rezervuarına aktarın. Kapağı kalsiyum veya magnezyum olmadan dört mililitre PBS ile durulayın ve hücreleri santrifüjleme ile peletlayın.Daha sonra hücreleri tüp başına kalsiyum ve magnezyum olmadan 500 mikrolitre PBS'de yeniden biriktirin. Zebra balığı embriyonik hücrelerinin akış sitometrik analizi için, her tüpe bir ila bin kırmızı ölü hücre lekesi seyreltme eklemeden önce hücre süspansiyonlarını hafifçe girdaplayın. Ölü hücre lekesini uyguladıktan sonraki 30 dakika içinde atık tankını boşaltın, kılıf tankını uygun çözelti ile doldurun ve akış sitometresinin akışkan sistemini başlatın.Analiz yazılımında, beş çizim yapın ve ilk çizimi öne doğru ve yan dağılım ölçülecek şekilde ayarlayın. İleri dağılımını doğrusal, yan dağılımını logaritmik olarak ayarlayın. İkinci çizimi, ileri dağılım genişliğine karşı ileri dağılım yüksekliğini ve üçüncü çizimi dağılım yüksekliği ile yan dağılım genişliğini ölçmek için ayarlayın.X eksenindeki kırmızı ölü hücre lekesini ölçmek için dördüncü çizimi ayarlayın ve ölü hücrelerden canlı ayrımcılığına izin vermek için y ekseninde yan dağılım. Beşinci arsa, seçim flororore ölçmek için ayarlanmalıdır. Tüm çizimler ayarlandığında, örneği sitometreye yükleyin ve hücrelerin hızlı bir şekilde tükenmemesi için akış hızını azaltın.Hücre popülasyonunun büyük kısmının net bir şekilde gözlemlenebilmesi için ileri ve yan dağılım ayarlarını yapın ve hücre popülasyonunun etrafına bir kapı çizin. Bu kapı hücrelerini etiketle. Hücrelere kapılı ikinci nokta çizimi ile, ileri saçılım üzerindeki kapı ve çiftleri dışlamak için yan dağılım singlet'ları.Dördüncü çizimde, kırmızı ölü hücre lekesi ayarlarını açıkça negatif bir popülasyon olacak şekilde ayarlayın. Bu hücrelerin etrafına bir kapı çizin ve bu kapıyı canlı hücreler olarak etiketle. Beşinci çizimde, canlı hücrelere kapı verin ve pozitif hücrelerin etrafına bir kapı çizin, ardından en az 25.000 canlı hücre olayı toplayan her örneği çalıştırın.Tüm numuneler analiz edildiğinde, akışkanları kapatmak, kılıf tankını doldurmak ve atık tankını boşaltmak için kapatma prosedürünü izleyin. Her embriyonik zebra balığı örneğinden GFP pozitif kırmızı kan hücrelerinin yüzdesi analiz edildikten sonra, tüm kontrol grubunun ortalaması hesaplanabilir. Genellikle, ortalama bir olarak ayarlanır ve yüzdelerin tümü bu referans noktasından hesaplanır.Bu temsili analizde, ISM1 transkriptinin spesifik bir morfoin ile azaltılmasının, döllenme embriyolarından sonraki 48 saat içinde mevcut GFP pozitif kırmızı kan hücrelerinin sayısını azalttığı belirlenmiştir. ISM1 morfotino seviyelerindeki bu azalmayı eksojen mRNA ile kurtarmak, kırmızı kan hücrelerinin sayısını normale döndürür. Numunelerde uygun sindirim çok önemlidir.Aşırı sindirirseniz veya az sindirirseniz, doğru sonuçları alamazsınız. Bir faks makinesi varsa, araştırmacılar in vitro kültür, RNA dizilimi ve nicel RT-PCR için sıralayarak kan hücrelerini toplayabilirler.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği<em&gt; Xenopus</em&gt; Böbrek

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Akım Sitometresi ile Fare Embriyosunda Eritromiyeloid Progenitörlerin Ve Döllerinin Belirlenmesi

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Yalıtımlı ve Akış Sitometrisi ile Pankreas mezenkim ve Hücreler Analizi

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Kordon Kanından Oluşan İndüklü Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrojenik Pellet Oluşumu

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Zebra balığı embriyo geliştirilmesinde bir Vitro tahlil hematopoetik kök ve yaratıcı Quantitate gelişimi (HSPCs) hücreleri

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Hematopoetik kök hücre transplantasyonu myelodisplastik sendromu kökeni değerlendirmek için kullanımı

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Kalsiyum akını, gözenek oluşumu ve P2X7 reseptörleri yetişkin nöral progenitör hücreler tarafından fagositoz araştırmak için gerçek zamanlı canlı hücre Akış Sitometresi

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Zebrabalığı Embriyolarında Situ Hibridizasyon ve IPSC-EC'lerde Tüp Oluşumu Nda Endoglin'in Vasküler Gelişimdeki Rolünü İncelemek İçin Tam Montaj

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...