Name: in vitro model of human cutaneous hypertrophic scarring using macromolecular crowding
Uploaded: 2020-05-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af midler fra Singapores Agentur for Videnskab, Teknologi og Forskning "SPF 2013/004: Skin Biology Basic Research" og "Wound Care Innovation for tropics" IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Forfatterne taknemmeligt anerkende råd og bistand fra Dr. Paula Benny og Dr. Michael Raghunath.

1. Cellekultur
<ol><li>HHSFs og normale dermal fibroblaster, der stammer fra ikke-patologisk væv (hNSFs) i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM), der indeholder 10% føtal kalveserum (FCS) og 1% v/v penicillin/streptomycinopløsning (P/S) ved 37°C i en kuvøse med 5% CO2/95% luft.</li>
	<li>Køb Ficoll 70, Ficoll 400, og ascorbinsyre fra de relevante virksomheder.</li>
</ol>2. Opførelse af MMC hypertrofisk ar model
<ol><li>HHSF'er eller hNSF'er (50.000/brønd) frøs i en 24...

<ol>
	<li>vander Veer, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+cellular+and+molecular+causes+of+hypertrophic+scar+formation.">Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation.</a> Burns. 35 (1), 15-29 (2009).</li><li>Linge, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+Scar+Cells+Fail+to+Undergo+a+Form+of+Apoptosis+Specific+to+Contractile+Collagen[mdash]The+Role+of+Tissue+Transglutaminase.">Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).</li><li>Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+TGF-beta+family+in+wound+healing,+burns+and+scarring:+a+review.">The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review.</a> International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).</li><li>Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+correlation+of+in+vivo+burn+scar+contraction+with+the+level+of+alpha-smooth+muscle+actin+expression.">The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression.</a> Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).</li><li>Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle-depleted+fetal+bovine+and+human+sera+have+reduced+capacity+to+support+cell+growth.">Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373 (2015).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Kapalczynska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures.">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).</li><li>Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+enhancement+of+collagen+matrix+formation+and+crosslinking+for+applications+in+tissue+engineering:+a+preliminary+study.">In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study.</a> Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).</li><li>Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+macromolecular+crowding+can+do+to+a+protein.">What macromolecular crowding can do to a protein.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).</li><li>Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+macromolecular+crowding+to+enhance+extracellular+matrix+deposition+and+its+remodeling+in+vitro+for+tissue+engineering+and+cell-based+therapies.">Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).</li><li>Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+Crowding+Directs+Extracellular+Matrix+Organization+and+Mesenchymal+Stem+Cell+Behavior.">Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior.</a> PloS one. 7 (5), 37904 (2012).</li><li>Chen, C. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Scar-in-a-Jar:+studying+potential+antifibrotic+compounds+from+the+epigenetic+to+extracellular+level+in+a+single+well.">The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well.</a> British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+"macromolecular+crowding"+in+vitro+to+investigate+the+naphthoquinones+shikonin,+naphthazarin+and+related+analogues+for+the+treatment+of+dermal+scars.">Application of "macromolecular crowding" in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars.</a> Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).</li><li>Canty, E. G., Kadler, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procollagen+trafficking,+processing+and+fibrillogenesis.">Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis.</a> Journal of Cell Science. 118, 1341-1353 (2005).</li><li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+for+Excluded+Volume+Interaction+between+an+Unfolded+Protein+and+Rigid+Macromolecular+Cosolutes:+Macromolecular+Crowding+and+Protein+Stability+Revisited.">Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).</li><li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linearization+of+the+bradford+protein+assay.">Linearization of the bradford protein assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (38), e1918 (2010).</li><li>Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+RNeasy+Mini+Kit+to+obtain+high-quality+total+RNA+from+sessile+cells+of+Staphylococcus+aureus.">Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus.</a> Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).</li><li>Xue, M., Jackson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Matrix+Reorganization+During+Wound+Healing+and+Its+Impact+on+Abnormal+Scarring.">Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring.</a> Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).</li><li>Rohani, M. G., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+remodeling+by+MMPs+during+wound+repair.">Matrix remodeling by MMPs during wound repair.</a> Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).</li><li>Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+in+patients+with+different+types+of+scars+and+keloids.">Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids.</a> Journal of Plastic, Reconstructive &amp; Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).</li><li>Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Implications+of+the+IL-6+Signaling+Pathway+in+Keloid+Pathogenesis.">Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).</li><li>Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+scar+formation+by+vascular+endothelial+growth+factor.">Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor.</a> Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).</li><li>Rashid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+use+for+polyvinylpyrrolidone+as+a+macromolecular+crowder+for+enhanced+extracellular+matrix+deposition+and+cell+proliferation.">Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).</li><li>Lago, J. C., Puzzi, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+aging+in+primary+human+dermal+fibroblasts.">The effect of aging in primary human dermal fibroblasts.</a> PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).</li><li>Cigognini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding+meets+oxygen+tension+in+human+mesenchymal+stem+cell+culture+-+A+step+closer+to+physiologically+relevant+in+vitro+organogenesis.">Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture - A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis.</a> Scientific Reports. 6, 30746 (2016).</li><li>Cuttle, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porcine+deep+dermal+partial+thickness+burn+model+with+hypertrophic+scarring.">A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring.</a> Burns. 32 (7), 806-820 (2006).</li><li>Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+potential+of+Shikonin+as+a+novel+hypertrophic+scar+treatment.">Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment.</a> Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shikonin+reduces+TGF-beta1-induced+collagen+production+and+contraction+in+hypertrophic+scar-derived+human+skin+fibroblasts.">Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts.</a> International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).</li><li>Werner, S., Krieg, T., Smola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocyte-Fibroblast+Interactions+in+Wound+Healing.">Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).</li></ol>

Denne protokol har til formål at optimere og godkende en forbedret : ar-i-en-krukke "in vitro model for menneskelige kutanarvæv. Tidligere undersøgelser har rapporteret anvendelsen af MMC teknik til mennesker lunge fibroblaster12, menneskelige knoglemarv mesenkymale stamceller23, og menneskelige dermal fibroblaster23 ved hjælp af dextran12, Ficoll12, og PVP23 som crowders. I ...

Arvæv repræsenterer slutpunktet for vævreparation. Men, i mange individer, især dem, der lider af forbrændinger eller traumer1, ardannelse kan være overdreven og pålægge uønskede virkninger på morfologi og funktion af helbredt hud. Selv om de nøjagtige mekanismer for patologiske (hypertrofiske ar og keloids) ardannelse ikke er fuldt forstået, overdreven aflejring af kollagen under sårheling har vist sig at være et væsentligt bidrag2.
Det er veletableret, at omdanne vækstfaktor beta 1 (TGF-β1) og alpha glat muskel actin (αSMA) spiller centrale roller i dannelsen af hypertrofiske ar. Tyder på, at forhøjet TGF-β1 direkte stimulerer overdreven aflejring af kollagen via regulering af SMAD signalering vej3. Desuden har αSMA vist sig at bidrage til hypertrofisk ardannelse ved at regulere cellesammentrækning og reepithelialisering i sårhelingsprocessen4. Manglen på egnede in vitro- og in vivo-modeller er en væsentlig hindring for at udvikle og evaluere interventioner og behandlingsformer for aroprydning. Formålet med denne undersøgelse er at udnytte den eksisterende MMC teknik til at konstruere en "in vivo-lignende" hypertrofisk ar model, der er egnet til evaluering af nye og nye ar-relaterede interventioner.
Gengivelse levende væv uden for kroppen har været et mål i årevis i det videnskabelige samfund. Udviklingen af in vitro-teknikker i begyndelsen af det tyvende århundrede nåede til dels dette mål. Nuværende in vitro teknikker har lidt udviklet sig fra Roux oprindelige demonstration af, at embryonale celler kan overleve ex vivo i flere dage i varmt saltvand5. In vitro-metoder er dog for det meste begrænset til enkeltcelletyper, der dyrkes i 2D, og desammenfatter ikke nøjagtigt væv in vivo. Mens nyttige for at undersøge celle biokemi, fysiologi, og genetik, indfødte væv er 3-D og indarbejde flere celletyper. Simple 2D in vitro-systemer udsætter pattedyrceller for meget kunstige miljøer, hvor den oprindelige vævsspecifikke arkitektur går tabt6. Til gengæld påvirker dette intracellulære og ekstracellulære hændelser, hvilket resulterer i unormal cellemorfologi, fysiologi og adfærd7.
Interessen bag denne protokol ligger i udvikling og klinisk forvaltning af hypertrofiske ar og keloider. Selv om det er veletableret, at dermal fibroblaster er i vid udstrækning ansvarlig for den rigelige produktion af kollagener til stede i arvæv, dyrke dermal fibroblaster ved hjælp af 2-D in vitro-systemer undlader at reproducere omsætningen af kollagen observeret i vivo8. Moderne in vitro metoder stadig hovedsagelig bruge "varm saltvand", et miljø helt forskellig fra det i levende væv. Væv in vivo er ekstremt overfyldt, med proteiner, nukleinsyrer, ribonukleoproteiner, og polysaccharider, besætter 5%-40% af den samlede volumen. Da der ikke er to molekyler, der kan besætte den samme plads på samme tid, er der ikke meget ledig plads til rådighed og en næsten fuldstændig mangel på frit vand9.
MMC-teknikken pålægger begrænsninger, der påvirker cytosol- og interstitielle væskers termodynamiske egenskaber. Molekylære interaktioner, receptor-ligand signalering komplekser, enzymer, og organeller er begrænset fra at interagere frit9. Interaktioner inden for det pericellulære miljø (dvs. interstitium) er også begrænset. Nylige beviser bekræfter, at høje koncentrationer af inerte makromolekyler i overfyldte opløsninger perturb diffusion, fysisk association, viskositet og hydrodynamiske egenskaber10.
Interessant, flere populære fortrængning agenter (dvs. Ficoll, dextran, polyvinylpyrrolidon [PVP], og natrium 4-styrensulfonat [PSS]) er ikke ækvivalente, når de anvendes på forskellige celletyper og i forskellige indstillinger. I en tidligere undersøgelse blev Ficoll rapporteret at være mindre cytotoksisk for mesenkymale stamceller sammenlignet med PVP. Disse resultater blev fortolket som en følge af denneutrale ladning og den relativt lille hydrodynamiske radius11. I modsætning hertil viste en anden undersøgelse, at dextran er mere effektiv til at stimulere kollagen jeg aflejring er aflejring af menneskerlungefibroblaster i forhold til Ficoll12. Data fra vores egen undersøgelse tyder på, at Ficoll forbedrer kollagen aflejring af hypertrofisk ar-afledte fibroblaster, mens PVP er giftigt for disse celler13.
Det er blevet påvist , at omdannelsen af procollagen til kollagen er hurtigere i et meget overfyldt in vivo-miljø14, mens antallet af biologiske reaktioner er forsinket i et fortyndet 2D-kultursystem15. Vi har optimeret in vitro-protokollen her, der omfatter MMC at vise dyrkning af dermal fibroblaster tjener som en mere "in vivo-lignende" model for dermal fibrose og ar dannelse. I modsætning til den fælles 2-D kultur system, dyrke hHSFs med MMC stimulerer biosyntese og aflejring af kollagen betydeligt13. Især andre karakteristika ved fibrose (dvs. øget ekspression af matrix metalloproteinaser [MMPs] og proinflammatoriske cytokiner) er også tydelige under denne optimerede MMC protokol13. Når det dyrkes ved hjælp af denne metode, er det påvist, at dermale celler opsummerer de fysiologiske, biokemiske og funktionelle parametre målt in vivo.
Den optimerede MMC in vitro protokol er blevet brugt til at evaluere ekspressionen af kollagen og andre ECM proteiner ved dermal fibroblaster isoleret fra hypertrofisk ar dermis og uinvolveret tilstødende dermis. Når det dyrkes i MMC miljøer in vitro, er det blevet observeret, at hHSFs udtrykke visse egenskaber (dvs. mRNA, biokemi, fysiologi, og fænotype) svarende til dermal hypertrofisk arvæv i vivo. Beviserne tyder på, at fysiske og kemiske egenskaber er vigtige overvejelser, når man vælger crowdere og optimereMMC betingelser for dyrkning in vitro.
For proof-of-princip, MMC protokollen anvendes her til kvalitativt og kvantitativt vurdere evne Shikonin og dens analoger til at fremkalde apoptose. Dette gør det muligt at vurdere de potentielle anvendelser af disse naturligt afledte traditionel kinesisk medicin (TCM) forbindelser til forvaltning af dermal ardannelse13. Uanset, at enkelheden, omkostningseffektiviteten og aktualiteten af denne in vitro MMC-protokol også opfylder de seneste regler for at eliminere forsøg med pattedyr i HENHOLD til EU-direktiv 2010/63/EU og DET Amerikanske Miljøbeskyttelsesagentur (EPA).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1337px;" width="1336">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">0.2 &#956;m filter</td>
			<td style="width:195px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">16534</td>
			<td style="width:537px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Alexa Fluor 680</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A-21076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Alexa Fluor 800</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A-11371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab5694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler )</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4351106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:195px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">#013-12061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">#A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Bradford protein assay</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen I primary antibody (for immunostaining)</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">6308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen I primary antibody (for western blot)</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab21286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen III primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab7778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen IV primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab6586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Direct Red 80</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>2610108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11996-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">6000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Ficoll 400</td>
			<td style="width:195px;">GE HealthCare</td>
			<td style="width:119px;">#17-0300-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Ficoll 70</td>
			<td style="width:195px;">GE HealthCare</td>
			<td style="width:119px;">#17-0310-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">GAPDH primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Goat Anti-Rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF)</td>
			<td style="width:195px;">Cell Research Corporation</td>
			<td style="width:119px;">106, 107, 108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">#1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-1 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab38929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-13 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab39012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-2 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab37150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-9 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab38898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">NanoDrop Microvolume Spectrophotometers</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">10484060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0321BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Odyssey blocking buffer</td>
			<td style="width:195px;">LI-COR Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">927&#8211;40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td style="width:195px;">LI-COR Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining)</td>
			<td style="width:195px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Penicillin/streptomycin solution (P/S)</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">PrimePCR Assays</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Protease inhibitor cocktail (PIC)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">PVP 360</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#PVP360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">PVP 40</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#PVP40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:195px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">#74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Sodium vanadate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">450022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Sodium vanadate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">SsoAdvanced universal SYBR green supermix</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">#172-5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Tween 20</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model of human cutaneous hypertrophic scarring using macromolecular crowding

Det har vist sig, at in vivo væv er meget overfyldt af proteiner, nukleinsyrer, ribonukleoproteiner, polysaccharider, osv. Følgende protokol anvender en makromolekylær fortrængning (MMC) teknik til at efterligne denne fysiologiske fortrængning gennem tilsætning af neutrale polymerer (crowders) til cellekulturer in vitro. Tidligere undersøgelser ved hjælp af Ficoll eller dextran som crowders viser, at udtrykket af kollagen I og fibronectin i WI38 og WS-1 cellelinjer er væsentligt forbedret ved hjælp af MMC teknik. Men, denne teknik er ikke blevet valideret i primære hypertrofiske ar-afledte menneskelige hud fibroblaster (hHSFs). Som hypertrofisk ardannelse opstår fra overdreven aflejring af kollagen, denne protokol har til formål at konstruere en kollagen-rige i vitro hypertrofisk ar model ved at anvende MMC teknik med hHSFs. Denne optimerede MMC model har vist sig at have flere ligheder med in vivo arvæv sammenlignet med traditionelle 2-dimensionelle (2-D) cellekultur systemer. Desuden er det omkostningseffektivt, tidseffektivt og etisk ønskeligt i forhold til dyremodeller. Derfor, den optimerede model rapporteret her tilbyder en avanceret "in vivo-lignende" model for hypertrofisk ar-relaterede undersøgelser.

Der blev udført treeksemplarer af prøver i hvert forsøg, og hvert eksperiment blev gentaget 3x ved hjælp af celler fra tre individuelle patienter. Data udtrykkes som procenter af kontrolgruppen. Envejs ANOVA og Tukey's post-hoc test blev anvendt til at analysere statistiske forskelle (*p ; 0,05).
MMC ved hjælp af Ficoll på 9% FVO (fraktioneret volumen belægning) øger den samlede mængde af kollagen og kollagen jeg deposition i hHSF13. Som illustreret i ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding at JoVE.com

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

Denne protokol beskriver brugen af makromolekylær fortrængning til at skabe en in vitro human hypertrofisk arvæv model, der ligner in vivo betingelser. Når de dyrkes i et overfyldt makromolekylært miljø, udviser hudfibroblaster fænotyper, biokemi, fysiologi og funktionelle egenskaber, der ligner arvæv.

In Vitro Model af Human Kutan hypertrofisk ardannelse ved hjælp af makromolekylære fortrængning

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Vi har skabt en individuel kollagen-rige model til at efterligne det miljø, som celler oplever in vivo ved hjælp af den makromolekylære fortrængning teknik. Hud er et overfyldt miljø, i modsætning til det flydende miljø, som vi allerede bruger til at dyrke celler in vitro. Sammenlignet med det traditionelle monolagcellekultursystem genskaber denne model det overfyldte molekylære miljø, som celler oplever in vivo, især i arvæv, hvor rigelig ekstracellulær matrix fortrænger flydende vand.Udover hypertrofiske ar, denne makromolekylære fortrængning teknik kan bruges til undersøgelser, hvor den ekstracellulære matrix er rigelig, såsom lungefibrose. Vokse ar-afledte og normale fibroblaster i henhold til manuskript retninger. Derefter frø dem i 24 brøndplader på 50, 000 celler pr brønd i en milliliter medium.Inkuber pladen natten over ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Forbered makromolekylære fortrængning eller MMC medier ved at blande Ficoll 70, Ficoll 400 og ascorbinsyre i 10% FCS DMEM. Inkuber medierne i et vandbad for at sprede crowders ind i løsningen.Derefter steriliseres det med et 0,2 mikrometerfilter. Aspirere de brugte medier fra fibroblaster og erstatte det med frisklavet MMC medier. Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius i seks dage, ændre MMC medierne hver tredje dag.Forbered en Sirius Red opløsning ved at opløse 0,2 gram Direkte Rød 80 pulver i 200 milliliter destilleret deioniseret vand med en milliliter eddikesyre. Fremsugning MMC medierne fra cellerne og tilsæt 300 mikroliter af Sirius Red løsning til hver brønd. Vend derefter cellerne tilbage til kuvøsen i 90 minutter.Efter inkubationen skylles Sirius Røde opløsning forsigtigt med vand fra hanen, og pladen luftes natten over. Den næste dag udvindes Sirius Red ved at tilsætte 200 mikroliter 0,1 molarnatriumhydroxid i hver brønd og ryste pladen i fem til 10 minutter. Overfør 100 mikroliter af den ekstraherede plet i en gennemsigtig 96 brøndplade, og mål absorbansen ved 620 nanometer med en mikropladelæser.Vask hver brønd med 200 mikroliter PBS og fastgør cellerne med methanol ved fire grader Celsius i 10 minutter. Derefter tilsættes 3% BSA til brøndene og inkubere pladen i 30 minutter ved stuetemperatur. Inspirer blokeringsopløsningen og tilsæt 200 mikroliter anti-kollagen et antistof til hver brønd.Indkube pladen i 90 minutter. Derefter aspirere antistoffet og vask brøndene tre gange med PBS i fem minutter pr vask. Tilføj 200 mikroliter ged anti-kanin-FITC sekundært antistof og DAPI til hver brønd.Dæk pladen med aluminiumsfolie og inkuber den i 30 minutter ved stuetemperatur. Det sekundære antistof og DAPI kasseres, og vaskene gentages med PBS. Derefter visualisere fluorescens direkte under et mikroskop.Efter vask af cellerne to gange med PBS tilsættes 40 mikroliter lysisbuffer i hver brønd og skrabe cellelaget med en pipettespids. Overfør derefter proteinlysatet til mikrocentrifugerør for at måle proteinkoncentrationen. Læg 10 mikrogram protein i hver brønd af en fire til 12% Bis-Tris protein gel og udføre SDS-PAGE på 200 volt i 30 minutter.Når du er færdig, overføre proteinet til en nitrocellulose membran ved at køre en vestlig skamplet på 90 volt i 90 minutter, idet du skal passe på at undgå bobledannelse mellem gelen og membranen. Bloker membranen med 10 milliliter blokerebuffer. Derefter inkubere det med primære antistoffer ved fire grader Celsius natten over.Den næste dag vaskes membranen fem gange med 0,1 procent TBS Tween 20 i fem minutter pr. vask. Derefter inkuberes membranen med et artssvarende sekundært antistof i en time ved stuetemperatur. Gentag vaskene og visualisere fluorescens med et billedsystem.Efter rensning af det samlede RNA med et kommercielt RNA-ekstraktionssæt måles RNA-koncentrationen ved hjælp af et mikrovolumenspektrofotometer. Brug derefter en cDNA syntese kit til at udføre en første streng DNA syntese. Bland cDNA med 10 mikroliter af SYBR Green Supermix og overføre prøverne til en brugerdefineret 96 godt plade forbelagt med oligonukleotid primere.Juster det samlede volumen til 20 mikroliter pr. brønd med vand og kør RT-PCR i henhold til manuskriptretninger. Celletætheden af hypertrofisk ar-afledte menneskelige hud fibroblaster signifikant steget efter dyrkning med Ficoll sammenlignet med ved hjælp af PVP eller kontrol. Makromolekylær fortrængning med Ficoll på 9% fraktioneret volumen belægning betydeligt forbedret aflejring af kollagen, herunder kollagen en, sammenlignet med andre formuleringer.Dette blev yderligere påvist med kvantitativ analyse. Ar-afledte fibroblaster og normale dermale fibroblaster dyrket i MMC miljøer blev fundet til at regulere udtrykket af ECM arter ud over kollagen. Især, en forhøjet udtryk for matrix metalloproteinaser eller MMPs blev fundet at akkumulere i hypertrofisk arvæv i forhold til indfødte væv.Det blev bemærket, at udtrykket MMP2, ni og 13 var betydeligt up-reguleret i begge cellekulturer dyrket i makromolekylære fortrængning betingelser. MMPs spiller en vigtig rolle under sårheling og ardannelse, regulering af ECM samling og remodeling. Syntese af interleukin seks og vaskulær endotelvækstfaktor var målbart i en vestlig skamplet.Men RT-PCR analyse viste, at udtrykket af interleukin seks var betydeligt up-reguleret, mens udtrykket af vaskulære endotel vækstfaktor var nedreguleret i fibroblaster dyrket i MMC betingelser. Når du forsøger denne protokol, Er det meget vigtigt at vælge dermal fibroblaster, der har meget få CO patogener. Vi skal også huske på, at ascorbinsyre er en vigtig ingrediens i MMC-mediet.Vi er især interesseret i yderligere at opdage kollagen deposition og tilpasning i denne MMC model. Vi planlægger at bruge avancerede mikroskopiske teknikker til at sammenligne denne in vitro model med indfødte arvæv in vivo. Vi opfordrer andre til at bruge denne makromolekylære fortrængning teknik til at forbedre in vitro ægtheden af de accessoriske modal væv.Selvfølgelig kan makromolekylær fortrængning også bruges til at genberegne modeller af sygdom og patologi in vitro.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Visualisere Proteiner og makromolekylære Komplekser af negative Stain EM: fra Grid Forberedelse til Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Anatomiske rekonstruktioner af Human Cardiac Venøs System ved hjælp Kontrast-computertomografi af Perfusion-faste Prøver

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Celle co-kultur Patterning hjælp Vandige tofasesystemer

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering af et menneske 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro-cellekultur Model for Toxic Inhaleret Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produktion, karakterisering og potentielle anvendelse af en 3D-Tissue-manipuleret humant Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øjenirritation Test (EIT) for Hazard Identifikation af Eye Irriterer Kemikalier hjælp rekonstrueret human Cornea-lignende Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Forbedring 2D og 3D Skin<em&gt; In vitro</em&gt; Modeller Brug Macromolecular Fortrængning

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikrofluid Flow Chambers Brug Rekonstitueret Blood til Model Hæmostase og trombocytinfusion<em&gt; In vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In vitro</em&gt; Orgel Kultur Model af muse diskusprolaps

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...