Name: in vitro model of human cutaneous hypertrophic scarring using macromolecular crowding
Uploaded: 2020-05-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door financiering van het Singaporese Agentschap voor Wetenschap, Technologie en Onderzoek "SPF 2013/004: Skin Biology Basic Research" en de "Wound Care Innovation for the Tropics" IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. De auteurs dankbaar erkennen advies en hulp van Dr Paula Benny en Dr Michael Raghunath.

1. Celcultuur
<ol><li>Handhaaf hHSF's en normale dermale fibroblasten afkomstig van niet-pathologisch weefsel (hNSFs) in dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) met 10% foetaal kalfsserum (FCS) en 1% v/v penicilline/streptomycineoplossing (P/S) bij 37°C in een couveuse met 5% CO2/95% lucht.</li>
	<li>Koop Ficoll 70, Ficoll 400 en ascorbinezuur van de juiste bedrijven.</li>
</ol>2. Bouw van MMC hypertrofisch littekenmodel
<ol><li>Zaad de hHSFs of hNSFs (50.000/well) in een 2...

<ol>
	<li>vander Veer, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+cellular+and+molecular+causes+of+hypertrophic+scar+formation.">Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation.</a> Burns. 35 (1), 15-29 (2009).</li><li>Linge, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+Scar+Cells+Fail+to+Undergo+a+Form+of+Apoptosis+Specific+to+Contractile+Collagen[mdash]The+Role+of+Tissue+Transglutaminase.">Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).</li><li>Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+TGF-beta+family+in+wound+healing,+burns+and+scarring:+a+review.">The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review.</a> International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).</li><li>Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+correlation+of+in+vivo+burn+scar+contraction+with+the+level+of+alpha-smooth+muscle+actin+expression.">The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression.</a> Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).</li><li>Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle-depleted+fetal+bovine+and+human+sera+have+reduced+capacity+to+support+cell+growth.">Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373 (2015).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Kapalczynska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures.">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).</li><li>Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+enhancement+of+collagen+matrix+formation+and+crosslinking+for+applications+in+tissue+engineering:+a+preliminary+study.">In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study.</a> Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).</li><li>Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+macromolecular+crowding+can+do+to+a+protein.">What macromolecular crowding can do to a protein.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).</li><li>Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+macromolecular+crowding+to+enhance+extracellular+matrix+deposition+and+its+remodeling+in+vitro+for+tissue+engineering+and+cell-based+therapies.">Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).</li><li>Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+Crowding+Directs+Extracellular+Matrix+Organization+and+Mesenchymal+Stem+Cell+Behavior.">Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior.</a> PloS one. 7 (5), 37904 (2012).</li><li>Chen, C. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Scar-in-a-Jar:+studying+potential+antifibrotic+compounds+from+the+epigenetic+to+extracellular+level+in+a+single+well.">The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well.</a> British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+"macromolecular+crowding"+in+vitro+to+investigate+the+naphthoquinones+shikonin,+naphthazarin+and+related+analogues+for+the+treatment+of+dermal+scars.">Application of "macromolecular crowding" in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars.</a> Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).</li><li>Canty, E. G., Kadler, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procollagen+trafficking,+processing+and+fibrillogenesis.">Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis.</a> Journal of Cell Science. 118, 1341-1353 (2005).</li><li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+for+Excluded+Volume+Interaction+between+an+Unfolded+Protein+and+Rigid+Macromolecular+Cosolutes:+Macromolecular+Crowding+and+Protein+Stability+Revisited.">Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).</li><li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linearization+of+the+bradford+protein+assay.">Linearization of the bradford protein assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (38), e1918 (2010).</li><li>Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+RNeasy+Mini+Kit+to+obtain+high-quality+total+RNA+from+sessile+cells+of+Staphylococcus+aureus.">Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus.</a> Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).</li><li>Xue, M., Jackson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Matrix+Reorganization+During+Wound+Healing+and+Its+Impact+on+Abnormal+Scarring.">Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring.</a> Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).</li><li>Rohani, M. G., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+remodeling+by+MMPs+during+wound+repair.">Matrix remodeling by MMPs during wound repair.</a> Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).</li><li>Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+in+patients+with+different+types+of+scars+and+keloids.">Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids.</a> Journal of Plastic, Reconstructive &amp; Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).</li><li>Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Implications+of+the+IL-6+Signaling+Pathway+in+Keloid+Pathogenesis.">Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).</li><li>Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+scar+formation+by+vascular+endothelial+growth+factor.">Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor.</a> Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).</li><li>Rashid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+use+for+polyvinylpyrrolidone+as+a+macromolecular+crowder+for+enhanced+extracellular+matrix+deposition+and+cell+proliferation.">Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).</li><li>Lago, J. C., Puzzi, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+aging+in+primary+human+dermal+fibroblasts.">The effect of aging in primary human dermal fibroblasts.</a> PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).</li><li>Cigognini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding+meets+oxygen+tension+in+human+mesenchymal+stem+cell+culture+-+A+step+closer+to+physiologically+relevant+in+vitro+organogenesis.">Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture - A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis.</a> Scientific Reports. 6, 30746 (2016).</li><li>Cuttle, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porcine+deep+dermal+partial+thickness+burn+model+with+hypertrophic+scarring.">A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring.</a> Burns. 32 (7), 806-820 (2006).</li><li>Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+potential+of+Shikonin+as+a+novel+hypertrophic+scar+treatment.">Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment.</a> Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shikonin+reduces+TGF-beta1-induced+collagen+production+and+contraction+in+hypertrophic+scar-derived+human+skin+fibroblasts.">Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts.</a> International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).</li><li>Werner, S., Krieg, T., Smola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocyte-Fibroblast+Interactions+in+Wound+Healing.">Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).</li></ol>

Dit protocol is gericht op het optimaliseren en verifiëren van een verbeterd :scar-in-a-jar" in vitro model voor menselijk huidlittekenweefsel. Eerdere studies hebben gemeld de toepassing van MMC techniek om menselijke longfibroblasten12, menselijke beenmerg mesenchymale stamcellen23, en menselijke dermale fibroblasten23 met behulp van dextran12, Ficoll12, en PVP23 als crowders....

Littekenweefsel vertegenwoordigt het eindpunt van weefselherstel. Echter, bij veel individuen, vooral die lijden aan brandwonden of trauma1, littekens kan worden overdreven en ongewenste effecten op te leggen aan de morfologie en het functioneren van genezen huid. Hoewel de exacte mechanismen van pathologische (hypertrofische littekens en keloïden) littekenvorming niet volledig worden begrepen, is aangetoond dat overmatige afzetting van collageen tijdens wondgenezing een essentiële bijdrage is2.
Het is algemeen vastgesteld dat het transformeren van groeifactor bèta 1 (TGF-β1) en alfa gladde spieractine (αSMA) een belangrijke rol spelen bij de vorming van hypertrofische littekens. Er zijn aanwijzingen dat verhoogde TGF-β1 overmatige afzetting van collageen direct stimuleert via het reguleren van het SMAD-signaleringstraject3. Bovendien is αSMA gevonden om bij te dragen aan hypertrofische littekenvorming door het reguleren van celcontractie en reepithelialisatie in het wondgenezingsproces4. Het ontbreken van geschikte in vitro en in vivo modellen is een belangrijke belemmering voor het ontwikkelen en evalueren van interventies en therapieën voor littekensanering. Het doel van deze studie is om de bestaande MMC-techniek te gebruiken om een "in vivo-achtig" hypertrofisch littekenmodel te construeren dat geschikt is voor het evalueren van nieuwe en opkomende littekengerelateerde interventies.
Het reproduceren van levend weefsel buiten het lichaam is al jaren een doel in de wetenschappelijke gemeenschap. De ontwikkeling van in vitro technieken in het begin van de twintigste eeuw heeft dit doel gedeeltelijk bereikt. De huidige in vitro technieken zijn licht geëvolueerd uit roux's oorspronkelijke demonstratie dat embryonale cellen ex vivo meerdere dagen kunnen overleven in warme zoutlijn5. Echter, in vitro methodologieën zijn meestal beperkt tot eencellige types geteeld in 2-D en niet nauwkeurig recapituleren weefsels in vivo. Hoewel nuttig voor het onderzoeken van celbiochemie, fysiologie en genetica, inheemse weefsels zijn 3-D en bevatten meerdere celtypes. Eenvoudige 2-D in vitro systemen onderwerpen zoogdiercellen aan zeer kunstmatige omgevingen waarin native weefselspecifieke architectuur verloren gaat6. Op zijn beurt beïnvloedt dit intracellulaire en extracellulaire voorvallen, wat resulteert in abnormale celmorfologie, fysiologie en gedrag7.
De interesse achter dit protocol ligt in de ontwikkeling en het klinisch beheer van hypertrofische littekens en keloïden. Hoewel het algemeen bekend is dat huidfibroblasten grotendeels verantwoordelijk zijn voor de overvloedige productie van collageen aanwezig in littekenweefsel, het cultiveren van huidfibroblasten met behulp van 2-D in vitro systemen niet aan de omzet van collageen waargenomen in vivo8te reproduceren . Hedendaagse in vitro methoden nog steeds in wezen gebruik maken van "warme zoutwater", een omgeving die totaal verschilt van die in levende weefsels. Weefsels in vivo zijn extreem druk, met eiwitten, nucleïnezuren, ribonucleoproteïnen en polysachariden, die 5%-40% van het totale volume innemen. Aangezien geen twee moleculen tegelijkertijd dezelfde ruimte kunnen innemen, is er weinig vrije ruimte beschikbaar en een bijna volledige afwezigheid van vrij water9.
De MMC-techniek legt beperkingen op die de thermodynamische eigenschappen van cytosol en interstitiële vloeistoffen beïnvloeden. Moleculaire interacties, receptor-ligand signalering complexen, enzymen, en organellen zijn beperkt en beperkt van de interactie vrij9. Interacties binnen de pericellulaire omgeving (d.w.z. interstitium) zijn ook beperkt. Recent bewijs bevestigt dat hoge concentraties van inerte macromoleculen in overvolle oplossingen diffusie, fysieke associatie, viscositeit en hydrodynamische eigenschappen10.
Interessant is dat verschillende populaire crowding agenten (dat wil zeggen, Ficoll, dextran, polyvinylpyrrolidone [PVP], en natrium 4-styrenesulfonate [PSS]) zijn niet gelijkwaardig wanneer toegepast op verschillende celtypes en in verschillende instellingen. In een eerdere studie, Ficoll werd gemeld dat minder cytotoxische voor mesenchymale stamcellen in vergelijking met PVP. Deze resultaten werden geïnterpreteerd als het gevolg van de neutrale lading en de relatief kleine hydrodynamische straal11. In tegenstelling, een tweede studie bleek dat dextran is effectiever in het stimuleren van collageen I afzetting door menselijke longfibroblasten in vergelijking met Ficoll12. Gegevens uit onze eigen studie suggereert dat Ficoll verbetert collageen depositie door hypertrofische litteken-afgeleide fibroblasten, terwijl PVP is giftig voor deze cellen13.
Het is aangetoond dat de omzetting van procollageen naar collageen sneller is in een zeer drukke in vivo omgeving14, terwijl de snelheid van biologische reacties wordt vertraagd in een verdund 2D-cultuursysteem15. We hebben het in vitro protocol hier geoptimaliseerd, waarbij MMC is opgenomen om de teelt van dermale fibroblasten te laten zien die dienen als een meer "in vivo-achtig" model voor huidfibrose en littekenvorming. In tegenstelling tot het gemeenschappelijke 2D-kweeksysteem stimuleert het cultiveren van hHSFs met MMC de biosynthese en depositie van collageen aanzienlijk13. Met name andere kenmerken van fibrose (d.w.z. verhoogde expressie van matrixmetalloproteinases [MSP's] en ontstekingscytokines) zijn ook zichtbaar onder dit geoptimaliseerde MMC-protocol13. Wanneer ze met deze methode worden gekweekt, wordt aangetoond dat huidcellen de fysiologische, biochemische en functionele parameters recapituleren die in vivo worden gemeten.
De geoptimaliseerde MMC in vitro protocol is gebruikt om de expressie van collageen en andere ECM eiwitten te evalueren door dermale fibroblasten geïsoleerd van hypertrofische littekendermis en niet-betrokken aangrenzende dermis. Wanneer gekweekt in MMC-omgevingen in vitro, is geconstateerd dat hHSFs bepaalde kenmerken uitdrukken (d.w.z. mRNA, biochemie, fysiologie en fenotype) vergelijkbaar met huidhypertrofisch littekenweefsel in vivo. Het bewijs geeft aan dat fysische en chemische eigenschappen belangrijke overwegingen zijn bij het selecteren van crowders en het optimaliseren van MMC-omstandigheden voor teelt in vitro.
Voor proof-of-principle wordt het MMC-protocol hier toegepast om het vermogen van Shikonin en zijn analogen om apoptose te induceren kwalitatief en kwantitatief te evalueren. Dit maakt evaluatie van de potentiële toepassingen van deze natuurlijk afgeleide traditionele Chinese geneeskunde (TCM) verbindingen voor het beheer van dermale littekens13. Niettegenstaande voldoet de eenvoud, kosteneffectiviteit en actualiteit van dit in vitro MMC-protocol ook aan recente voorschriften om experimenten bij zoogdieren door de EU-richtlijn 2010/63/EU en het Amerikaanse Environmental Protection Agency (EPA) uit te bannen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1337px;" width="1336">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">0.2 &#956;m filter</td>
			<td style="width:195px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">16534</td>
			<td style="width:537px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Alexa Fluor 680</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A-21076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Alexa Fluor 800</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A-11371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab5694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler )</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4351106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:195px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">#013-12061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">#A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Bradford protein assay</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen I primary antibody (for immunostaining)</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">6308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen I primary antibody (for western blot)</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab21286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen III primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab7778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen IV primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab6586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Direct Red 80</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>2610108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11996-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">6000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Ficoll 400</td>
			<td style="width:195px;">GE HealthCare</td>
			<td style="width:119px;">#17-0300-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Ficoll 70</td>
			<td style="width:195px;">GE HealthCare</td>
			<td style="width:119px;">#17-0310-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">GAPDH primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Goat Anti-Rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF)</td>
			<td style="width:195px;">Cell Research Corporation</td>
			<td style="width:119px;">106, 107, 108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">#1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-1 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab38929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-13 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab39012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-2 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab37150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-9 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab38898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">NanoDrop Microvolume Spectrophotometers</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">10484060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0321BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Odyssey blocking buffer</td>
			<td style="width:195px;">LI-COR Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">927&#8211;40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td style="width:195px;">LI-COR Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining)</td>
			<td style="width:195px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Penicillin/streptomycin solution (P/S)</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">PrimePCR Assays</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Protease inhibitor cocktail (PIC)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">PVP 360</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#PVP360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">PVP 40</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#PVP40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:195px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">#74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Sodium vanadate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">450022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Sodium vanadate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">SsoAdvanced universal SYBR green supermix</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">#172-5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Tween 20</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model of human cutaneous hypertrophic scarring using macromolecular crowding

Het is aangetoond dat in vivo weefsels zijn zeer druk door eiwitten, nucleïnezuren, ribonucleoproteïnen, polysachariden, enz. Het volgende protocol past een macromoleculaire crowding (MMC) techniek toe om deze fysiologische verdringing na te bootsen door de toevoeging van neutrale polymeren (crowders) aan celculturen in vitro. Eerdere studies met behulp van Ficoll of dextran als crowders tonen aan dat de expressie van collageen I en fibronectine in WI38 en WS-1 cellijnen aanzienlijk worden verbeterd met behulp van de MMC-techniek. Deze techniek is echter niet gevalideerd in primaire hypertrofische litteken-afgeleide menselijke huid fibroblasten (hHSFs). Aangezien hypertrofische littekens het gevolg zijn van de overmatige afzetting van collageen, is dit protocol bedoeld om een collageenrijk in vitro hypertrofisch littekenmodel te construeren door de MMC-techniek toe te passen met hHSFs. Dit geoptimaliseerde MMC-model vertoont meer overeenkomsten met in vivo littekenweefsel in vergelijking met traditionele 2-dimensionale (2D) celkweeksystemen. Bovendien is het kosteneffectief, tijdefficiënt en ethisch wenselijk in vergelijking met diermodellen. Daarom biedt het hier gerapporteerde geoptimaliseerde model een geavanceerd "in vivo-achtig" model voor hypertrofische littekengerelateerde studies.

Drievoud monsters werden uitgevoerd in elk experiment, en elk experiment werd herhaald 3x met behulp van cellen van drie individuele patiënten. Gegevens worden uitgedrukt als percentages van de controlegroep. One-way ANOVA en Tukey's post-hoc test werden toegepast om statistische verschillen te analyseren (*p , 0,05).
MMC met behulp van Ficoll op 9% VVB (fractionele volume bezetting) verbetert de totale hoeveelheid collageen en collageen I depositie in hHSF13....

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding at JoVE.com

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

Dit protocol beschrijft het gebruik van macromoleculaire verdringing om een in vitro menselijk hypertrofisch littekenweefselmodel te creëren dat lijkt op in vivo omstandigheden. Wanneer gecultiveerd in een drukke macromoleculaire omgeving, menselijke huid fibroblasten vertonen fenotypes, biochemie, fysiologie, en functionele kenmerken die lijken op littekenweefsel.

In Vitro Model van de mens cutaneous hypertrofische littekens met behulp van macromoleculaire crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

We creëerden een individueel collageenrijk model om de omgeving na te bootsen die cellen in vivo ervaren met behulp van de macromoleculaire verdringingstechniek. Huid is een drukke omgeving, in tegenstelling tot de vloeibare omgeving die we al gebruiken om cellen in vitro te kweken. Vergeleken met de traditionele monolayer cel cultuur systeem, dit model reconstrueert de drukke moleculaire omgeving die cellen ervaren in vivo, vooral in littekenweefsel waar overvloedige extracellulaire matrix verdringt vloeibaar water.Naast hypertrofische littekens kan deze macromoleculaire verdringingstechniek worden gebruikt voor studies waarbij de extracellulaire matrix overvloedig aanwezig is, zoals longfibrose. Groeien litteken-afgeleide en normale fibroblasten volgens manuscript richtingen. Dan zaad ze in 24 goed platen op 50.000 cellen per put in een milliliter van medium.Incubeer de plaat 's nachts op 37 graden Celsius en 5%kooldioxide. Bereid macromoleculaire verdringing of MMC-media voor door Ficoll 70, Ficoll 400 en ascorbinezuur te mengen tot 10%FCS DMEM. De media in een waterbad uitbroeden om de crowders in de oplossing te verspreiden.Steriliseer het vervolgens met een filter van 0,2 micrometer. Aspirate de gebruikte media van de fibroblasten en vervang het door vers gemaakte MMC media. Incubeer de cellen op 37 graden Celsius gedurende zes dagen, het veranderen van de MMC media om de drie dagen.Bereid een Sirius Red oplossing door het oplossen van 0,2 gram Direct Red 80 poeder in 200 milliliter gedestilleerd water met een milliliter azijnzuur. Aspirate de MMC media uit de cellen en voeg 300 microliter van Sirius Red oplossing aan elke put. Breng de cellen vervolgens 90 minuten terug naar de couveuse.Na de incubatie spoel je de Sirius Red-oplossing voorzichtig af met kraanwater en laat je de plaat 's nachts drogen. Op de volgende dag, extract de Sirius Red door het toevoegen van 200 microliters van 0,1 molaire natriumhydroxide in elke put en schudden van de plaat gedurende vijf tot 10 minuten. Breng 100 microliter van de geëxtraheerde vlek over in een transparante 96 putplaat en meet de absorptie op 620 nanometer met een microplaatlezer.Was elk goed met 200 microliters PBS en bevestig de cellen met methanol op vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Voeg vervolgens 3%BSA toe aan de putten en broed de plaat 30 minuten uit bij kamertemperatuur. Aspirate de blokkerende oplossing en voeg 200 microliter anti-collageen een antilichaam aan elke put.Broed de plaat 90 minuten in. Spoel dan het antilichaam aan en was de putten drie keer met PBS gedurende vijf minuten per wasbeurt. Voeg 200 microliters van Goat Anti-Rabbit-FITC Secondary Antibody en DAPI toe aan elke put.Bedek de plaat met aluminiumfolie en broed deze 30 minuten uit bij kamertemperatuur. Gooi het secundaire antilichaam en DAPI weg en herhaal de wasbeurten met PBS. Visualiseer vervolgens de fluorescentie direct onder een microscoop.Na het wassen van de cellen twee keer met PBS, voeg 40 microliters van lyse buffer in elke put en schraap de cellaag met een pipet tip. Breng vervolgens het eiwitlysaat over in microcentrifugebuizen om de eiwitconcentratie te meten. Laad 10 microgram eiwit in elke put van een vier tot 12%Bis-Tris eiwitgel en voer SDS-PAGE uit op 200 volt gedurende 30 minuten.Breng het eiwit na het einde over op een nitrocellulosemembraan door gedurende 90 minuten een westelijke vlek op 90 volt te laten lopen, waarbij u ervoor zorgt dat bellenvorming tussen de gel en het membraan wordt vermeden. Blokkeer het membraan met 10 milliliter blokkeerbuffer. Dan uitbroeden met primaire antilichamen op vier graden Celsius 's nachts.Op de volgende dag, was het membraan vijf keer met 0,1 procent TBS Tween 20 voor vijf minuten per wasbeurt. Vervolgens broeden het membraan met een soort-geschikte secundaire antilichaam gedurende een uur bij kamertemperatuur. Herhaal de wasbeurten en visualiseer fluorescentie met een beeldvormingssysteem.Na het zuiveren van het totale RNA met een commerciële RNA-extractiekit, meet u de RNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer voor microvolumes. Gebruik vervolgens een cDNA synthese kit om een eerste streng DNA synthese uit te voeren. Meng de cDNA met 10 microliters van SYBR Green Supermix en breng de monsters over naar een aangepaste 96 putplaat voorgecoat met oligonucleotide primers.Pas het totale volume aan op 20 microliter per put met water en voer RT-PCR uit volgens de handbeschrijvingen van het manuscript. Celdichtheid van hypertrofische litteken-afgeleide menselijke huid fibroblasten aanzienlijk toegenomen na het kweken met Ficoll in vergelijking met het gebruik van PVP of de controle. Macromoleculaire verdringing met Ficoll bij 9% fractionele volume bezetting aanzienlijk versterkt de afzetting van collageen, met inbegrip van collageen een, in vergelijking met andere formuleringen.Dit werd verder aangetoond met kwantitatieve analyse. Scar-afgeleide fibroblasten en normale huidfibroblasten gekweekt in MMC omgevingen bleken de expressie van ECM soorten te reguleren in aanvulling op collageen. Met name, een verhoogde expressie van matrix metalloproteinases of MMP's bleek te accumuleren in hypertrofische littekenweefsels in vergelijking met inheemse weefsels.Opgemerkt werd dat de expressie van MMP2, negen en 13 waren aanzienlijk up-geregeld in beide celculturen gecultiveerd in macromoleculaire verdringing voorwaarden. MMP's spelen een belangrijke rol bij wondgenezing en littekenvorming, het reguleren van ECM-assemblage en remodellering. Synthese van interleukine zes en vasculaire endotheel groeifactor was niet op te sporen in een westelijke vlek.Maar RT-PCR analyse bleek dat de expressie van interleukine zes was aanzienlijk up-gereguleerd, terwijl de expressie van vasculaire endotheel groeifactor was down-gereguleerd in fibroblasten gecultiveerd in MMC voorwaarden. Bij het proberen van dit protocol, is het zeer belangrijk om huidfibroblasten die zeer weinig CO-pathogenen hebben kiezen. We moeten ook in gedachten houden dat ascorbinezuur is een essentieel ingrediënt in het MMC medium.We zijn vooral geïnteresseerd in het verder detecteren van de collageendepositie en uitlijning in dit MMC-model. We zijn van plan om geavanceerde microscopische technieken te gebruiken om dit in vitro model te vergelijken met inheemse littekenweefsels in vivo. We moedigen anderen aan om deze macromoleculaire verdringingstechniek te gebruiken om de in vitro authenticiteit van de bijkomende modale weefsels te verbeteren.Natuurlijk kan macromoleculaire verdringing ook worden gebruikt om modellen van ziekte en pathologie in vitro te herberekenen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Het visualiseren van Eiwitten en macromoleculaire complexen door Negative Stain EM: van Grid Voorbereiding op Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Anatomische Reconstructies van de Mens Cardiac veneuze systeem met contrastdetectie computertomografie van perfusie-vaste Monsters

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell Co-cultuur Patterning gebruiken waterige tweefasensysteem Systems

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering van een Menselijke 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro celcultuurmodel voor Toxic Geïnhaleerd chemische testen

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een 3D Tissue-engineered Human Slokdarmkanker Mucosale Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Test op oogirritatie (EIT) voor Risico oog irriterende stoffen met gereconstrueerde humane Cornea-achtige Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Verbetering van 2D- en 3D-Skin<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellen Met behulp van macromoleculaire Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluïdische Flow Chambers behulp Gereconstitueerde Blood voor Model hemostase en bloedplaatjestransfusie<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Model van het Muizen tussenwervelschijf

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...