Name: in vitro model of human cutaneous hypertrophic scarring using macromolecular crowding
Uploaded: 2020-05-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der Singapurer Agentur für Wissenschaft, Technologie und Forschung "SPF 2013/004: Skin Biology Basic Research" und der "Wound Care Innovation for the Tropics" IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009 unterstützt. Die Autoren danken Ihnen bei Dr. Paula Benny und Dr. Michael Raghunath.

1. Zellkultur
<ol><li>Bewahren Sie hHSFs und normale dermale Fibroblasten aus nichtpathologischem Gewebe (hNSFs) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) auf, das 10% fetales Kalbsserum (FCS) und 1% v/v Penicillin/Streptomycin-Lösung (P/S) bei 37°C in einem Inkubator mit 5%CO2/95%Luft enthält.</li>
	<li>Kaufen Sie Ficoll 70, Ficoll 400 und Ascorbinsäure von den entsprechenden Unternehmen.</li>
</ol>2. Konstruktion des hypertrophen Narbenmodells MMC
<ol><li>Säen Sie die hH...

<ol>
	<li>vander Veer, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+cellular+and+molecular+causes+of+hypertrophic+scar+formation.">Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation.</a> Burns. 35 (1), 15-29 (2009).</li><li>Linge, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+Scar+Cells+Fail+to+Undergo+a+Form+of+Apoptosis+Specific+to+Contractile+Collagen[mdash]The+Role+of+Tissue+Transglutaminase.">Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).</li><li>Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Kapalczynska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures.">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).</li><li>Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. 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Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Scar-in-a-Jar:+studying+potential+antifibrotic+compounds+from+the+epigenetic+to+extracellular+level+in+a+single+well.">The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well.</a> British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+"macromolecular+crowding"+in+vitro+to+investigate+the+naphthoquinones+shikonin,+naphthazarin+and+related+analogues+for+the+treatment+of+dermal+scars.">Application of "macromolecular crowding" in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars.</a> Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).</li><li>Canty, E. G., Kadler, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procollagen+trafficking,+processing+and+fibrillogenesis.">Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis.</a> Journal of Cell Science. 118, 1341-1353 (2005).</li><li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+for+Excluded+Volume+Interaction+between+an+Unfolded+Protein+and+Rigid+Macromolecular+Cosolutes:+Macromolecular+Crowding+and+Protein+Stability+Revisited.">Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).</li><li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linearization+of+the+bradford+protein+assay.">Linearization of the bradford protein assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (38), e1918 (2010).</li><li>Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. 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A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+scar+formation+by+vascular+endothelial+growth+factor.">Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor.</a> Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).</li><li>Rashid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+use+for+polyvinylpyrrolidone+as+a+macromolecular+crowder+for+enhanced+extracellular+matrix+deposition+and+cell+proliferation.">Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).</li><li>Lago, J. C., Puzzi, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+aging+in+primary+human+dermal+fibroblasts.">The effect of aging in primary human dermal fibroblasts.</a> PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).</li><li>Cigognini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding+meets+oxygen+tension+in+human+mesenchymal+stem+cell+culture+-+A+step+closer+to+physiologically+relevant+in+vitro+organogenesis.">Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture - A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis.</a> Scientific Reports. 6, 30746 (2016).</li><li>Cuttle, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porcine+deep+dermal+partial+thickness+burn+model+with+hypertrophic+scarring.">A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring.</a> Burns. 32 (7), 806-820 (2006).</li><li>Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+potential+of+Shikonin+as+a+novel+hypertrophic+scar+treatment.">Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment.</a> Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shikonin+reduces+TGF-beta1-induced+collagen+production+and+contraction+in+hypertrophic+scar-derived+human+skin+fibroblasts.">Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts.</a> International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).</li><li>Werner, S., Krieg, T., Smola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocyte-Fibroblast+Interactions+in+Wound+Healing.">Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).</li></ol>

Dieses Protokoll zielt darauf ab, ein verbessertes In-vitro-Modell von :scar-in-a-jar für menschliches Kutanennarbengewebe zu optimieren und zu authentifizieren. Frühere Studien haben die Anwendung der MMC-Technik auf menschliche Lungen-Fibroblasten12, menschliche Knochenmark mesenchymale Stammzellen23und menschliche dermale Fibroblasten23 mit Dextran12, Ficoll12und PVP23 als C...

Narbengewebe stellt den Endpunkt der Gewebereparatur dar. Jedoch, bei vielen Personen, vor allem diejenigen, die an Verbrennungen oder Trauma1leiden, Narbenbildung kann übermäßig sein und unerwünschte Auswirkungen auf die Morphologie und Funktion der geheilten Haut. Obwohl die genauen Mechanismen der pathologischen (hypertrophen Narben und Keloide) Narbenbildung nicht vollständig verstanden werden, hat sich gezeigt, dass übermäßige Ablagerung von Kollagen während der Wundheilung ein wesentlicher Beitrag2ist.
Es ist allgemein bekannt, dass die Transformation des Wachstumsfaktors Beta 1 (TGF-1) und alpha-glatter Muskelaktin (SMA) eine Schlüsselrolle bei der Bildung von hypertrophen Narben spielen. Es gibt Hinweise darauf, dass erhöhte TGF-Nr. 1 direkt die übermäßige Ablagerung von Kollagen durch Regulierung des SMAD-Signalwegs3stimuliert. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass SMA zur hypertrophen Narbenbildung beiträgt, indem die Zellkontraktion und Reepithelisierung im Wundheilungsprozess reguliertwird 4. Das Fehlen geeigneter In-vitro- und In-vivo-Modelle ist ein großes Hindernis für die Entwicklung und Bewertung von Interventionen und Therapien zur Narbensanierung. Ziel dieser Studie ist es, die bestehende MMC-Technik zu nutzen, um ein "in vivo-ähnliches" hypertrophes Narbenmodell zu konstruieren, das sich für die Bewertung neuartiger und aufkommender Narbeninterventionen eignet.
Die Reproduktion von lebendem Gewebe außerhalb des Körpers ist seit Jahren ein Ziel in der wissenschaftlichen Gemeinschaft. Mit der Entwicklung von In-vitro-Techniken im frühen 20. Jahrhundert wurde dieses Ziel teilweise erreicht. Aktuelle In-vitro-Techniken haben sich leicht aus Roux' ursprünglicher Demonstration entwickelt, dass embryonale Zellen ex vivo für mehrere Tage in warmer Saline überleben können5. In-vitro-Methoden sind jedoch meist auf Einzelzelltypen beschränkt, die in 2D kultiviert werden, und rekapitulieren Gewebe in vivo nicht genau. Während nützlich für die Untersuchung der Zellbiochemie, Physiologie, und Genetik, native Gewebe sind 3-D und enthalten mehrere Zelltypen. Einfache 2-D-In-vitro-Systeme unterwerfen Säugetierzellen hochgradig künstlichen Umgebungen, in denen die native gewebespezifische Architektur verloren geht6. Dies wiederum wirkt sich auf intrazelluläre und extrazelluläre Ereignisse aus, was zu abnormaler Zellmorphologie, Physiologie undVerhalten7 führt.
Das Interesse hinter diesem Protokoll liegt in der Entwicklung und dem klinischen Management von hypertrophen Narben und Keloiden. Während es allgemein bekannt ist, dass dermale Fibroblasten in hohem Maße für die reichliche Produktion von Kollagen enden, die im Narbengewebe vorhanden sind, gelingt es bei der Kultivierung dermaler Fibroblasten mit 2-D-In-vitro-Systemen nicht, den Umsatz von Kollagen zu reproduzieren, das in vivo8beobachtet wurde. Zeitgenössische In-vitro-Methoden verwenden nach wie vor im Wesentlichen "warme Saline", eine Umgebung, die sich völlig von der in lebenden Geweben unterscheidet. Gewebe in vivo sind extrem überfüllt, mit Proteinen, Nukleinsäuren, Ribonukleoproteinen und Polysacchariden, die 5% –40% des Gesamtvolumens einnehmen. Da keine zwei Moleküle den gleichen Raum gleichzeitig einnehmen können, gibt es wenig freien Raum und eine fast vollständige Abwesenheit von freiem Wasser9.
Die MMC-Technik setzt Einschränkungen auf, die die thermodynamischen Eigenschaften von Zytosol und interstitiellen Flüssigkeiten beeinflussen. Molekulare Wechselwirkungen, Rezeptor-Ligand-Signalkomplexe, Enzyme und Organellen sind beschränkt und von der freien Interaktion eingeschränkt9. Wechselwirkungen innerhalb der perizellulären Umgebung (d. h. Interstitium) sind ebenfalls eingeschränkt. Jüngste Erkenntnisse bestätigen, dass hohe Konzentrationen von inerten Makromolekülen in überfüllten Lösungen Diffusion, physikalische Assoziation, Viskosität und hydrodynamische Eigenschaften stören10.
Interessanterweise sind mehrere beliebte Crowding-Agenten (z.B. Ficoll, Dextran, Polyvinylpyrrolidon [PVP] und Natrium 4-Styrenesulfonat [PSS]) nicht gleichwertig, wenn sie auf verschiedene Zelltypen und in unterschiedlichen Einstellungen angewendet werden. In einer früheren Studie, Ficoll wurde berichtet, dass weniger zytotoxisch für mesenchymale Stammzellen im Vergleich zu PVP. Diese Ergebnisse wurden als Folge ihrer neutralen Ladung und des relativ kleinen hydrodynamischen Radius11interpretiert. Im Gegensatz dazu ergab eine zweite Studie, dass Dextran effektiver bei der Stimulierung der Kollagen-I-Abscheidung durch menschliche Lungenfibroblasten im Vergleich zu Ficoll12ist. Daten aus unserer eigenen Studie deuten darauf hin, dass Ficoll die Kollagenablagerung durch hypertrophe Narbe-abgeleitete Fibroblasten verbessert, während PVP für diese Zellen toxisch ist13.
Es wurde gezeigt, dass die Umwandlung von Prokollagen zu Kollagen in einer stark überfüllten in vivo Umgebung14schneller ist, während die Rate der biologischen Reaktionen in einem verdünnten 2D-Kultursystem verzögert wird15. Wir haben hier das In-vitro-Protokoll optimiert und MMC integriert, um die Kultivierung von dermalen Fibroblasten zu zeigen, die als "in vivo-ähnliches" Modell für dermale Fibrose und Narbenbildung dienen. Im Gegensatz zum gemeinsamen 2-D-Kultursystem stimuliert die Kultivierung von hHSFs mit MMC die Biosynthese und Ablagerung von Kollagen signifikant13. Insbesondere sind unter diesem optimierten MMC-Protokoll13auch andere Merkmale der Fibrose (d.h. erhöhte Expression von Matrixmetalloproteinasen [MMPs] und proinflammatorischen Zytokinen) zu erkennen. Bei der Kultivieren mit dieser Methode wird gezeigt, dass dermale Zellen die physiologischen, biochemischen und funktionellen Parameter rekapitulieren, die in vivo gemessen werden.
Das optimierte MMC-In-vitro-Protokoll wurde verwendet, um die Expression von Kollagen und anderen ECM-Proteinen durch dermale Fibroblasten zu bewerten, die aus hypertrophen Narbendermisen und unbeteiligten angrenzenden Dermis isoliert wurden. Bei der Kultiviertheit in MMC-Umgebungen in vitro wurde beobachtet, dass hHSFs bestimmte Eigenschaften (z. B. mRNA, Biochemie, Physiologie und Phänotyp) ähnlich wie dermale hypertrophe Narbengewebe in vivo exprimieren. Die Beweise deuten darauf hin, dass physikalische und chemische Eigenschaften wichtige Überlegungen bei der Auswahl von Crowdern und der Optimierung der MMC-Bedingungen für den Anbau in vitro sind.
Zum Proof-of-Prinzip wird hier das MMC-Protokoll angewendet, um die Fähigkeit von Shikonin und seinen Analoga, Apoptose zu induzieren, qualitativ und quantitativ zu bewerten. Dies ermöglicht die Bewertung der möglichen Anwendungen dieser natürlich abgeleiteten traditionellen chinesischen Medizin (TCM) Verbindungen für die Verwaltung dermal Narben13. Ungeachtet der Einfachheit, Kostenwirksamkeit und Aktualität dieses In-vitro-MMC-Protokolls erfüllt es auch die jüngsten Vorschriften zur Beseitigung von Säugetierexperimenten durch die EU-Richtlinie 2010/63/EU und die US-Umweltbehörde EPA.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1337px;" width="1336">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">0.2 &#956;m filter</td>
			<td style="width:195px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">16534</td>
			<td style="width:537px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Alexa Fluor 680</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A-21076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Alexa Fluor 800</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A-11371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab5694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler )</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4351106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:195px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">#013-12061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">#A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Bradford protein assay</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen I primary antibody (for immunostaining)</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">6308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen I primary antibody (for western blot)</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab21286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen III primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab7778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen IV primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab6586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Direct Red 80</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>2610108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11996-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">6000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Ficoll 400</td>
			<td style="width:195px;">GE HealthCare</td>
			<td style="width:119px;">#17-0300-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Ficoll 70</td>
			<td style="width:195px;">GE HealthCare</td>
			<td style="width:119px;">#17-0310-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">GAPDH primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Goat Anti-Rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF)</td>
			<td style="width:195px;">Cell Research Corporation</td>
			<td style="width:119px;">106, 107, 108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">#1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-1 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab38929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-13 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab39012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-2 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab37150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-9 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab38898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">NanoDrop Microvolume Spectrophotometers</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">10484060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0321BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Odyssey blocking buffer</td>
			<td style="width:195px;">LI-COR Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">927&#8211;40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td style="width:195px;">LI-COR Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining)</td>
			<td style="width:195px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Penicillin/streptomycin solution (P/S)</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">PrimePCR Assays</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Protease inhibitor cocktail (PIC)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">PVP 360</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#PVP360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">PVP 40</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#PVP40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:195px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">#74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Sodium vanadate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">450022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Sodium vanadate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">SsoAdvanced universal SYBR green supermix</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">#172-5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Tween 20</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model of human cutaneous hypertrophic scarring using macromolecular crowding

Es hat sich gezeigt, dass In-vivo-Gewebe stark von Proteinen, Nukleinsäuren, Ribonukleoproteinen, Polysacchariden usw. überfüllt sind. Das folgende Protokoll wendet eine makromolekulare Crowding-Technik (MMC) an, um diese physiologische Verdrängung durch die Zugabe von neutralen Polymeren (Crowdern) zu Zellkulturen in vitro nachzuahmen. Frühere Studien mit Ficoll oder Dextran als Crowder zeigen, dass die Expression von Kollagen I und Fibronectin in WI38 und WS-1 Zelllinien mit der MMC-Technik deutlich verbessert werden. Diese Technik wurde jedoch nicht bei primären hypertrophen Narben-abgeleiteten menschlichen Hautfibroblasten (hHSFs) validiert. Da hypertrophe Narbenbildung aus der übermäßigen Ablagerung von Kollagen entsteht, zielt dieses Protokoll darauf ab, ein kollagenreiches in vitro hypertrophes Narbenmodell zu konstruieren, indem die MMC-Technik mit hHSFs angewendet wird. Dieses optimierte MMC-Modell hat nachweislich mehr Ähnlichkeiten mit in vivo Narbengewebe als herkömmliche 2-dimensionale (2-D) Zellkultursysteme. Darüber hinaus ist es im Vergleich zu Tiermodellen kostengünstig, zeiteffizient und ethisch wünschenswert. Daher bietet das hier beschriebene optimierte Modell ein fortschrittliches "in vivo-ähnliches" Modell für hypertrophe Narbenstudien.

In jedem Experiment wurden dreifache Proben durchgeführt, und jedes Experiment wurde 3x mit Zellen von drei einzelnen Patienten wiederholt. Die Daten werden als Prozentsätze der Kontrollgruppe ausgedrückt. Einweg-ANOVA und Tukeys Post-hoc-Test wurden zur Analyse statistischer Unterschiede (*p n 0,05) angewendet.
MMC mit Ficoll bei 9% FVO (Fractional Volume Occupancy) erhöht die Gesamtmenge an Kollagen und Kollagen I Ablagerung in hHSF13. Wie in <strong clas...

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In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von makromolekularem Crowding, um ein in vitro menschliches hypertrophes Narbengewebemodell zu erstellen, das in vivo-Bedingungen ähnelt. Wenn sie in einer überfüllten makromolekularen Umgebung kultiviert werden, weisen menschliche Hautfibroblasten Phänotypen, Biochemie, Physiologie und funktionelle Eigenschaften auf, die Narbengewebe ähneln.

In Vitro Modell der menschlichen kutanen hypertrophen Narbenbildung mit makromolekularer Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Wir haben ein individuelles Collagen-reiches Modell entwickelt, um die Umgebung zu imitieren, die Zellen in vivo mit der makromolekularen Crowding-Technik erleben. Haut ist eine überfüllte Umgebung, im Gegensatz zu der flüssigen Umgebung, die wir bereits verwenden, um Zellen in vitro zu züchten. Im Vergleich zum traditionellen monolayern Zellkultursystem stellt dieses Modell die überfüllte molekulare Umgebung wieder her, die Zellen in vivo erleben, insbesondere in Narbengeweben, wo reichlich extrazelluläre Matrix flüssiges Wasser verdrängt.Neben hypertrophen Narben kann diese makromolekulare Crowding-Technik für Studien verwendet werden, bei denen die extrazelluläre Matrix reichlich vorhanden ist, wie lungenfibrose. Wachsen Sie Narben abgeleitete und normale Fibroblasten nach Manuskriptrichtungen. Dann säen Sie sie in 24 Brunnenplatten bei 50.000 Zellen pro Brunnen in einem Milliliter Medium.Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Bereiten Sie makromolekulare Crowding- oder MMC-Medien vor, indem Sie Ficoll 70, Ficoll 400 und Ascorbinsäure in 10%FCS DMEM mischen. Inkubieren Sie die Medien in einem Wasserbad, um die Gedränge in die Lösung zu zerstreuen.Dann sterilisieren Sie es mit einem 0,2 Mikrometer-Filter. Die verbrauchten Medien von den Fibroblasten abscheine und durch frisch hergestellte MMC-Medien ersetzen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für sechs Tage, und wechseln Sie alle drei Tage die MMC-Medien.Bereiten Sie eine Sirius Red Lösung vor, indem Sie 0,2 Gramm Direct Red 80 Pulver in 200 Milliliter destilliertem deionisiertem Wasser mit einem Milliliter Essigsäure auflösen. Aspirieren Sie die MMC-Medien aus den Zellen und fügen Sie 300 Mikroliter Sirius Red Lösung zu jedem Brunnen hinzu. Dann geben Sie die Zellen für 90 Minuten in den Inkubator zurück.Nach der Inkubation die Sirius Red Lösung vorsichtig mit Leitungswasser abspülen und die Platte über Nacht trocknen lassen. Am nächsten Tag extrahieren Sie den Sirius Red, indem Sie 200 Mikroliter 0,1 Mol-Natriumhydroxid in jeden Brunnen geben und die Platte fünf bis zehn Minuten schütteln. Übertragen Sie 100 Mikroliter des extrahierten Flecks in eine transparente 96-Wellplatte und messen Sie die Absorption bei 620 Nanometern mit einem Mikroplattenleser.Waschen Sie jeden Brunnen mit 200 Mikroliter PBS und fixieren Sie die Zellen mit Methanol bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Dann fügen Sie 3%BSA zu den Brunnen und inkubieren Sie die Platte für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie die Blockierlösung und fügen Sie 200 Mikroliter Antikollagen einen Antikörper zu jedem Brunnen hinzu.Inkubieren Sie die Platte für 90 Minuten. Dann den Antikörper absaugen Und die Brunnen dreimal mit PBS für fünf Minuten pro Wäsche waschen. Fügen Sie 200 Mikroliter Ziegen-Anti-Rabbit-FITC Sekundärantikörper und DAPI zu jedem Brunnen hinzu.Bedecken Sie die Platte mit Aluminiumfolie und bebrüten Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den sekundären Antikörper und DAPI, und wiederholen Sie die Wähfe mit PBS. Dann visualisieren Sie die Fluoreszenz direkt unter dem Mikroskop.Nachdem Sie die Zellen zweimal mit PBS gewaschen haben, fügen Sie 40 Mikroliter Lysepuffer in jeden Brunnen ein und kratzen Sie die Zellschicht mit einer Pipettenspitze. Dann übertragen Sie das Proteinlysat in Mikrozentrifugenröhrchen, um die Proteinkonzentration zu messen. 10 Mikrogramm Protein in jeden Brunnen eines vier bis zwölf Prozent bis-Tris-Proteingels laden und 30 Minuten lang SDS-PAGE bei 200 Volt ausführen.Übertragen Sie das Protein nach Fertigstellung auf eine Nitrocellulosemembran, indem Sie 90 Minuten lang einen westlichen Blot bei 90 Volt laufen lassen, wobei Darauf geachtet wird, blasenbildung zwischen Gel und Membran zu vermeiden. Blockieren Sie die Membran mit 10 Milliliter Blockierpuffer. Dann inkubieren Sie es mit primären Antikörpern bei vier Grad Celsius über Nacht.Am nächsten Tag die Membran fünfmal mit 0,1 Prozent TBS Tween 20 für fünf Minuten pro Wäsche waschen. Dann die Membran mit einem artgerechten Sekundärantikörper für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Wiederholen Sie die Wässer und visualisieren Sie die Fluoreszenz mit einem Bildgebungssystem.Nach der Reinigung der gesamten RNA mit einem kommerziellen RNA-Extraktionskit messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Mikrovolumenspektrophotometer. Verwenden Sie dann ein cDNA-Synthese-Kit, um eine erste Strang-DNA-Synthese durchzuführen. Mischen Sie die cDNA mit 10 Mikroliter SYBR Green Supermix und übertragen Sie die Proben auf eine benutzerdefinierte 96 Well Platte, die mit Oligonukleotid-Primern vorbeschichtet ist.Stellen Sie das Gesamtvolumen auf 20 Mikroliter pro Brunnen mit Wasser ein und führen Sie RT-PCR nach Manuskriptanweisungen aus. Die Zelldichte von hypertrophen Narben-abgeleiteten menschlichen Haut-Fibroblasten erhöhte sich nach der Kultivierung mit Ficoll signifikant im Vergleich zur Verwendung von PVP oder der Kontrolle. Makromolekulare Überfüllung mit Ficoll bei 9%Fraktionsvolumenbelegung verbesserte die Ablagerung von Kollagen, einschließlich Kollagen, im Vergleich zu anderen Formulierungen signifikant.Dies wurde durch quantitative Analysen weiter demonstriert. Narben-abgeleitete Fibroblasten und normale dermale Fibroblasten, die in MMC-Umgebungen angebaut werden, regulierten zusätzlich zu Kollagen auch die Expression von ECM-Arten. Insbesondere wurde eine erhöhte Expression von Matrix-Metalloproteinasen oder MMPs gefunden, die sich in hypertrophen Narbengeweben im Vergleich zu nativen Geweben ansammelten.Es wurde beobachtet, dass die Expression von MMP2, neun und 13 in beiden Zellkulturen, die in makromolekularen Gedränge kultiviert wurden, signifikant hochreguliert war. MMPs spielen eine wichtige Rolle bei der Wundheilung und Narbenbildung, die Regulierung der ECM-Montage und des Umbaus. Die Synthese von Interleukin sechs und vaskulären endotheliale Wachstumsfaktor war nicht nachweisbar in einem westlichen Blot.Aber RT-PCR-Analyse ergab, dass die Expression von Interleukin sechs war deutlich up-reguliert, während die Expression der vaskulären endotheliale Wachstumsfaktor war down-reguliert in Fibroblasten in MMC Bedingungen kultiviert. Beim Versuch dieses Protokolls ist es sehr wichtig, dermale Fibroblasten zu wählen, die nur sehr wenige CO-Erreger haben. Wir müssen auch bedenken, dass Ascorbinsäure ein wesentlicher Bestandteil im MMC-Medium ist.Wir sind besonders daran interessiert, die Kollagenablagerung und -ausrichtung in diesem MMC-Modell weiter zu erkennen. Wir planen, fortschrittliche mikroskopische Techniken zu verwenden, um dieses In-vitro-Modell mit nativen Narbengeweben in vivo zu vergleichen. Wir ermutigen andere, diese makromolekulare Crowding-Technik zu verwenden, um die In-vitro-Authentizität der Hilfs-Modalgewebe zu verbessern.Natürlich kann makromolekulare Verdrängung auch verwendet werden, um Modelle von Krankheit und Pathologie in vitro neu zu berechnen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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