Name: in vitro model of human cutaneous hypertrophic scarring using macromolecular crowding
Uploaded: 2020-05-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti dell'Agenzia per la Scienza, la Tecnologia e la Ricerca di Singapore "SPF 2013/004: Skin Biology Basic Research" e della "Wound Care Innovation for the Tropics" IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Gli autori riconoscono con gratitudine i consigli e l'assistenza del Dr. Paula Benny e del Dr. Michael Raghunath.

1. Cultura cellulare
<ol><li>Mantenere hHSF e normali fibroblasti dermici derivati da tessuto non patologico (hNSF) nel mezzo modificato dell'Aquila (DMEM) di Dulbecco contenente il 10% di siero di vitello fetale (FCS) e l'1% v/v di soluzione di penicillina/streptomicina (P/S) a 37 gradi centigradi in un incubatore con 5% di CO2/95%.</li>
	<li>Acquistare Ficoll 70, Ficoll 400 e acido ascorbico dalle società appropriate.</li>
</ol>2. Costruzione del modello MMC di cicatrici ipertrofice<...

<ol>
	<li>vander Veer, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+cellular+and+molecular+causes+of+hypertrophic+scar+formation.">Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation.</a> Burns. 35 (1), 15-29 (2009).</li><li>Linge, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+Scar+Cells+Fail+to+Undergo+a+Form+of+Apoptosis+Specific+to+Contractile+Collagen[mdash]The+Role+of+Tissue+Transglutaminase.">Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).</li><li>Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+aging+in+primary+human+dermal+fibroblasts.">The effect of aging in primary human dermal fibroblasts.</a> PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).</li><li>Cigognini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding+meets+oxygen+tension+in+human+mesenchymal+stem+cell+culture+-+A+step+closer+to+physiologically+relevant+in+vitro+organogenesis.">Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture - A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis.</a> Scientific Reports. 6, 30746 (2016).</li><li>Cuttle, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porcine+deep+dermal+partial+thickness+burn+model+with+hypertrophic+scarring.">A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring.</a> Burns. 32 (7), 806-820 (2006).</li><li>Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+potential+of+Shikonin+as+a+novel+hypertrophic+scar+treatment.">Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment.</a> Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shikonin+reduces+TGF-beta1-induced+collagen+production+and+contraction+in+hypertrophic+scar-derived+human+skin+fibroblasts.">Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts.</a> International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).</li><li>Werner, S., Krieg, T., Smola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocyte-Fibroblast+Interactions+in+Wound+Healing.">Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).</li></ol>

Questo protocollo mira a ottimizzare e autenticare un modello in vitro migliorato:scar-in-a-jar per il tessuto cicatriziale cutaneo umano. Studi precedenti hanno segnalato l'applicazione della tecnica MMC ai fibroblasti polmonari umani12, cellule staminali mesenchymiche del midollo osseo umano23e fibroblasti dermici umani23 utilizzando dextran12, Ficoll12e PVP23 come crowder. Nel...

Il tessuto cicatriziale rappresenta il punto finale della riparazione dei tessuti. Tuttavia, in molti individui, specialmente quelli che soffrono di ustioni o traumi1, le cicatrici possono essere eccessive e impongono effetti indesiderati sulla morfologia e sul funzionamento della pelle guarita. Anche se i meccanismi esatti di formazione di cicatrici patologiche (cicatrici ipertrofiche e cheloidi) non sono completamente compresi, l'eccessiva deposizione di collagene durante la guarigione delle ferite è stata dimostrata essere un contributo essenziale2.
È ben noto che la trasformazione del fattore di crescita beta 1 (TGF-1) e dell'actina muscolare liscia alfa (ZMA) svolge un ruolo chiave nella formazione di cicatrici ipertrofiche. L'evidenza suggerisce che l'elevato TGF-1 stimola direttamente l'eccessiva deposizione di collagene regolando il percorso di segnalazione SMAD3. Inoltre, è stato trovato che l'sMA contribuisce alla formazione di cicatrici ipertrofiche regolando la contrazione cellulare e la reetilizzazione nel processo di guarigione della ferita4. La mancanza di modelli in vitro e in vivo adatti è un grave ostacolo allo sviluppo e alla valutazione di interventi e terapie per la correzione delle cicatrici. Lo scopo di questo studio è quello di utilizzare la tecnica MMC esistente per costruire un modello di cicatrice ipertrofica "in vivo" adatto per la valutazione di nuovi ed emergenti interventi legati alla cicatrice.
Riprodurre tessuto vivente al di fuori del corpo è stato un obiettivo per anni nella comunità scientifica. Lo sviluppo di tecniche in vitro all'inizio del ventesimo secolo ha in parte raggiunto questo obiettivo. Le attuali tecniche in vitro si sono leggermente evolute rispetto alla dimostrazione originale di Roux che le cellule embrionali possono sopravvivere all'esagono per diversi giorni in calda salina5. Tuttavia, le metodologie in vitro sono per lo più limitate atipi di cellule singole coltivati in 2D e non ricapitolano accuratamente i tessuti in vivo. Sebbene siano utili per esaminare la biochimica cellulare, la fisiologia e la genetica, i tessuti nativi sono 3D e incorporano più tipi di cellule. I sistemi in vitro 2D semplici sottopongano le cellule dei mammiferi ad ambienti altamente artificiali in cui l'architettura nativa specifica del tessuto viene persa6 . A sua volta, questo colpisce eventi intracellulari ed extracellulari, con conseguente morfologia cellulare anormale, fisiologia e comportamento7.
L'interesse alla base di questo protocollo sta nello sviluppo e nella gestione clinica di cicatrici e cheloidi ipertrofi. Mentre è ben noto che i fibroblasti dermici sono in gran parte responsabili dell'abbondante produzione di collageni presenti nel tessuto cicatriziale, coltivando fibroblasti dermici utilizzando sistemi 2D in vitro non riesce a riprodurre il turnover di collagene osservato in vivo8. I metodi in vitro contemporanei usano ancora essenzialmente la "calda salina", un ambiente completamente diverso da quello dei tessuti viventi. I tessuti in vivo sono estremamente affollati, con proteine, acidi nucleici, ribonucleoproteine e polisaccaridi, che occupano il 5-40% del volume totale. Poiché non ci sono due molecole che possono occupare lo stesso spazio allo stesso tempo, c'è poco spazio libero disponibile e una quasi completa assenza di acqua libera9.
La tecnica MMC impone vincoli che influenzano le proprietà termodinamiche del citosol e dei fluidi interstiziali. Le interazioni molecolari, i complessi di segnalazione recettore-ligando, gli enzimi e gli organelli sono confinati e limitati dall'interazione libera9. Anche le interazioni all'interno dell'ambiente pericellulare (cioè l'interstizio) sono vincolate. Recenti evidenze confermano che alte concentrazioni di macromolecole ineret in soluzioni affollate perturbno la diffusione, l'associazione fisica, la viscosità e le proprietà idrodinamiche10.
È interessante notare che diversi agenti di affollamento popolari (ad esempio, Ficoll, dextran, poliviglierino-PVP] e sodio 4-styrenesulfonate [PSS]) non sono equivalenti se applicati a diversi tipi di cellule e in diverse impostazioni. In uno studio precedente, Ficoll è stato segnalato per essere meno citotossico per le cellule staminali mesenchymiche rispetto al PVP. Questi risultati sono stati interpretati come la conseguenza della sua carica neutra e del raggio idrodinamico relativamente piccolo11. Al contrario, un secondo studio ha trovato che dextran è più efficace nello stimolare il collagene I deposizione da fibroblasti polmonari umani rispetto a Ficoll12. I dati del nostro studio suggeriscono che Ficoll migliora la deposizione di collagene da fibroblasti ipertrofici derivati da cicatrici, mentre il PVP è tossico per queste cellule13.
È stato dimostrato che la conversione del procollagene al collagene è più veloce in un ambiente in vivo molto affollato14, mentre il tasso di reazioni biologiche è ritardato in un sistema di coltura 2D diluito15. Abbiamo ottimizzato il protocollo in vitro qui, incorporando MMC per mostrare la coltivazione di fibroblasti dermici che servono come un modello più "in vivo" per la fibrosi dermica e la formazione di cicatrici. In contrasto con il sistema di coltura 2D comune, coltivare hHSF con MMC stimola significativamente la biosintesi e la deposizione di collagene13. In particolare, altre caratteristiche della fibrosi (cioè una maggiore espressione delle metalloproteine di matrice [MMP] e delle citochine infiammatorie) sono evidenti anche in questo protocollo MMC ottimizzato13. Quando coltivate con questo metodo, si ha dimostrato che le cellule dermiche ricapitolano i parametri fisiologici, biochimici e funzionali misurati in vivo.
Il protocollo MMC in vitro ottimizzato è stato utilizzato per valutare l'espressione del collagene e di altre proteine ECM da fibroblasti dermici isolati da dermi cicatrici ipertrofi e dermi sconnessi adiacenti non coinvolti. Quando viene coltivato in ambienti MMC in vitro, è stato osservato che hHSF esprimono determinate caratteristiche (ad esempio, mRNA, biochimica, fisiologia e fenotipo) simili al tessuto lecito ipertrofico dermifico in vivo. Le prove indicano che le proprietà fisiche e chimiche sono considerazioni importanti quando si selezionano i crowder e si ottimizzano le condizioni MMC per la coltivazione in vitro.
Per il proof-of-principle, il protocollo MMC viene qui applicato per valutare qualitativamente e quantitativamente la capacità di Shikonin e dei suoi analoghi di indurre l'apoptosi. Ciò consente di valutare le potenziali applicazioni di questi composti di medicina tradizionale cinese (TCM) derivati naturalmente per la gestione delle cicatrici dermiche13. Nonostante ciò, la semplicità, l'efficacia in termini di costi e la tempestività di questo protocollo MMC in vitro soddisfano anche le recenti normative volte ad eliminare la sperimentazione nei mammiferi da parte della direttiva UE 2010/63/EU e dell'Agenzia per la protezione dell'ambiente degli Stati Uniti (EPA).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1337px;" width="1336">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">0.2 &#956;m filter</td>
			<td style="width:195px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">16534</td>
			<td style="width:537px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Alexa Fluor 680</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A-21076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Alexa Fluor 800</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A-11371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab5694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler )</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4351106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:195px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">#013-12061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">#A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Bradford protein assay</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen I primary antibody (for immunostaining)</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">6308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen I primary antibody (for western blot)</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab21286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen III primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab7778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen IV primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab6586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Direct Red 80</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>2610108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11996-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">6000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Ficoll 400</td>
			<td style="width:195px;">GE HealthCare</td>
			<td style="width:119px;">#17-0300-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Ficoll 70</td>
			<td style="width:195px;">GE HealthCare</td>
			<td style="width:119px;">#17-0310-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">GAPDH primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Goat Anti-Rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF)</td>
			<td style="width:195px;">Cell Research Corporation</td>
			<td style="width:119px;">106, 107, 108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">#1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-1 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab38929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-13 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab39012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-2 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab37150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-9 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab38898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">NanoDrop Microvolume Spectrophotometers</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">10484060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0321BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Odyssey blocking buffer</td>
			<td style="width:195px;">LI-COR Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">927&#8211;40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td style="width:195px;">LI-COR Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining)</td>
			<td style="width:195px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Penicillin/streptomycin solution (P/S)</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">PrimePCR Assays</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Protease inhibitor cocktail (PIC)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">PVP 360</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#PVP360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">PVP 40</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#PVP40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:195px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">#74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Sodium vanadate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">450022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Sodium vanadate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">SsoAdvanced universal SYBR green supermix</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">#172-5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Tween 20</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model of human cutaneous hypertrophic scarring using macromolecular crowding

È stato dimostrato che i tessuti in vivo sono molto affollati da proteine, acidi nucleici, ribonucleoproteine, polisaccharide, ecc. Il seguente protocollo applica una tecnica di crowding macromolecolare (MMC) per imitare questo affollamento fisiologico attraverso l'aggiunta di polimeri neutri (crowders) alle colture cellulari in vitro. Studi precedenti che utilizzano Ficoll o dextran come crowder dimostrano che l'espressione del collagene I e della fibronectina nelle linee cellulari WI38 e WS-1 è notevolmente migliorata utilizzando la tecnica MMC. Tuttavia, questa tecnica non è stata convalidata nei fibroblasti cutanei umani ipertrofici primari (hHSF). Poiché le cicatrici ipertrofiche derivano dall'eccessiva deposizione di collagene, questo protocollo mira a costruire un modello di cicatrice ipertrotro ricco di collagene applicando la tecnica MMC con hHSFs. Questo modello MMC ottimizzato ha dimostrato di possedere più somiglianze con il tessuto cicatriziale in vivo rispetto ai tradizionali sistemi di coltura cellulare 2-D. Inoltre, è conveniente, efficiente in termini di tempo ed eticamente desiderabile rispetto ai modelli animali. Pertanto, il modello ottimizzato riportato qui offre un modello avanzato "in vivo" per studi ipertrofici correlati alle cicatrici.

Sono stati eseguiti campioni triplicati in ogni esperimento e ogni esperimento è stato ripetuto 3 volte utilizzando cellule di tre singoli pazienti. I dati sono espressi come percentuali del gruppo di controllo. Il test post-hoc di ANOVA e Tukey è stato applicato unidirezionale per analizzare le differenze statistiche(p .0,05).
MMC utilizzando Ficoll al 9% FVO (occupazione del volume frazionario) migliora la quantità totale di collagene e collagene I deposizione in hHSF<sup class="...

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In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

Questo protocollo descrive l'uso dell'affollamento macromolecolare per creare un modello di tessuto ipertrocico umano in vitro che assomiglia in condizioni di vivo. Quando coltivati in un ambiente macromolecolare affollato, i fibroblasti della pelle umana presentano fenotipi, biochimica, fisiologia e caratteristiche funzionali simili al tessuto cicatriziale.

In vitro Modello di umano cutaneous ipertrofico cicatrici utilizzando Macromolecular Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Abbiamo creato un modello individuale ricco di collagene per imitare l'ambiente che le cellule sperimentano in vivo utilizzando la tecnica di affollamento macromolecolare. La pelle è un ambiente affollato, a differenza dell'ambiente liquido che già usiamo per far crescere le cellule in vitro. Rispetto al tradizionale sistema di coltura cellulare monostrato, questo modello ricrea l'ambiente molecolare affollato che le cellule sperimentano in vivo, specialmente nei tessuti cicatriziali dove l'abbondante matrice extracellulare sposta l'acqua liquida.Oltre alle cicatrici ipertrofiche, questa tecnica di affollamento macromolecolare può essere utilizzata per studi in cui la matrice extracellulare è abbondante, come la fibrosi polmonare. Coltiva fibroblasti normali e derivati dalle cicatrici secondo le indicazioni manoscritte. Quindi seminarli in 24 piastre di pozzo a 50.000 cellule per pozzo in un millilitro di mezzo.Incubare la piastra durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Preparare l'affollamento macromolecolare o i supporti MMC mescolando Ficoll 70, Ficoll 400 e acido ascorbico in 10%FCS DMEM. Incubare i media in un bagno d'acqua per disperdere gli crowder nella soluzione.Quindi sterilizzarlo con un filtro da 0,2 micrometri. Aspirare il supporto trascorso dai fibroblasti e sostituirlo con supporti MMC appena realizzati. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per sei giorni, cambiando il supporto MMC ogni tre giorni.Preparare una soluzione Sirius Red sciogliendo 0,2 grammi di polvere Direct Red 80 in 200 millilitri di acqua deionizzata distillata con un millilitro di acido acetico. Aspirare il supporto MMC dalle cellule e aggiungere 300 microlitri di soluzione Sirius Red ad ogni pozzo. Quindi riportare le cellule nell'incubatrice per 90 minuti.Dopo l'incubazione, sciacquare delicatamente la soluzione Sirius Red con acqua del rubinetto e lasciare asciugare l'aria durante la notte. Il giorno successivo, estrarre il Sirius Red aggiungendo 200 microlitri di idrossido di sodio molare 0,1 in ogni pozzo e scuotendo la piastra per cinque-10 minuti. Trasferire 100 microlitri della macchia estratta in una piastra trasparente da 96 pozza e misurare l'assorbanza a 620 nanometri con un lettore di micro lastre.Lavare ogni bene con 200 microlitri di PBS e fissare le cellule con metanolo a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Quindi aggiungere il 3%BSA ai pozzi e incubare la piastra per 30 minuti a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione di blocco e aggiungere 200 microlitri di anticorpo anti-collagene ad ogni pozzo.Incubare il piatto per 90 minuti. Quindi aspirare l'anticorpo E lavare i pozzi tre volte con PBS per cinque minuti per lavaggio. Aggiungere 200 microlitri di anticorpo secondario Goat Anti-Rabbit-FITC e DAPI ad ogni pozzo.Coprire la piastra con un foglio di alluminio e incubarla per 30 minuti a temperatura ambiente. Scartare l'anticorpo secondario e il DAPI e ripetere i lavaggi con PBS. Quindi visualizzare la fluorescenza direttamente al microscopio.Dopo aver lavato le celle due volte con PBS, aggiungere 40 microlitri di tampone di lysis in ogni pozzo e raschiare lo strato cellulare con una punta di pipetta. Quindi trasferire il lisato proteico in tubi di micro centrifuga per misurare la concentrazione proteica. Caricare 10 microgrammi di proteine in ogni pozzo di un gel proteico da quattro a 12%Bis-Tris ed eseguire SDS-PAGE a 200 volt per 30 minuti.Al termine, trasferire la proteina in una membrana di nitrocellulosa eseguendo una macchia occidentale a 90 volt per 90 minuti, facendo attenzione ad evitare la formazione di bolle tra il gel e la membrana. Bloccare la membrana con 10 millilitri di tampone di blocco. Quindi incubarlo con anticorpi primari a quattro gradi Celsius durante la notte.Il giorno successivo, lavare la membrana cinque volte con 0,1 percento TBS Tween 20 per cinque minuti per lavaggio. Quindi incubare la membrana con un anticorpo secondario appropriato per una specie per un'ora a temperatura ambiente. Ripetere i lavaggi e visualizzare la fluorescenza con un sistema di imaging.Dopo aver purificato l'RNA totale con un kit di estrazione dell'RNA commerciale, misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro a micro volume. Quindi utilizzare un kit di sintesi cDNA per eseguire una sintesi del DNA del primo filamento. Mescolare il cDNA con 10 microlitri di SYBR Green Supermix e trasferire i campioni su una piastra di pozzo 96 personalizzata pre-rivestita con primer oligonucleotidi.Regolare il volume totale a 20 microlitri per pozzo con acqua ed eseguire RT-PCR in base alle indicazioni manoscritte. La densità cellulare dei fibroblasti della pelle umana derivati da cicatrici ipertrofiche è aumentata significativamente dopo la coltivazione con Ficoll rispetto all'uso del PVP o del controllo. L'affollamento macromolecolare con Ficoll a un'occupazione del volume frazionato del 9% ha notevolmente migliorato la deposizione di collagene, incluso quello di collagene, rispetto ad altre formulazioni.Ciò è stato ulteriormente dimostrato con un'analisi quantitativa. Sono stati trovati fibroblasti derivati dalle cicatrici e normali fibroblasti dermici coltivati in ambienti MMC per regolare l'espressione delle specie ECM oltre al collagene. In particolare, è stata riscontrata un'elevata espressione di metalloproteinasi matriciali o MMP nei tessuti cicatriziali ipertrofi rispetto ai tessuti nativi.È stato osservato che l'espressione di MMP2, nove e 13 era significativamente regolata in entrambe le colture cellulari coltivate in condizioni di affollamento macromolecolare. Gli MMP svolgono un ruolo importante durante la guarigione delle ferite e la formazione di cicatrici, regolando l'assemblaggio e il rimodellamento dell'ECM. La sintesi dell'interleuchina sei e del fattore di crescita endoteliale vascolare non era rilevabile in una macchia occidentale.Ma l'analisi RT-PCR ha rivelato che l'espressione dell'interleuchina sei era significativamente regolata, mentre l'espressione del fattore di crescita endoteliale vascolare era down-regolata nei fibroblasti coltivati in condizioni MMC. Quando si tenta questo protocollo, è molto importante scegliere fibroblasti dermici che hanno pochissimi agenti patogeni co. Dobbiamo anche tenere presente che l'acido ascorbico è un ingrediente essenziale nel mezzo MMC.Siamo particolarmente interessati a rilevare ulteriormente la deposizione e l'allineamento del collagene in questo modello MMC. Abbiamo in programma di utilizzare tecniche microscopiche avanzate per confrontare questo modello in vitro con tessuti cicatriziali nativi in vivo. Incoraggiamo gli altri a utilizzare questa tecnica di affollamento macromolecolare per migliorare l'autenticità in vitro dei tessuti modali ausiliari.Naturalmente, l'affollamento macromolecolare può anche essere utilizzato per ricalcolare modelli di malattia e patologia in vitro.

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