Name: in vitro model of human cutaneous hypertrophic scarring using macromolecular crowding
Uploaded: 2020-05-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding at JoVE.com

この研究は、シンガポール科学技術庁「SPF 2013/004:皮膚生物学基礎研究」と「熱帯地方創傷ケアイノベーション」IAF-PP/2017(HBMS)H17/01/01/a0/009からの資金提供によって支えられました。著者らは、ポーラ・ベニー博士とマイケル・ラグナート博士からの助言と支援を感謝しています。

1. 細胞培養
<ol><li>10%の胎児子牛血清(FCS)および1%v/vペニシリン/ストレプトマイシン溶液(P/S)を含むダルベックコの修飾イーグル培地(DMEM)の非病理学組織(hNSF)に由来するhHSFおよび正常な皮膚線維芽細胞を5%CO/95%のインキュベーターで37°Cで維持する2。</li>
	<li>適切な会社からFicoll 70、Ficoll 400、およびアスコルビン酸を購入してください。</li>
</ol>2. MMC肥大性瘢痕モデル?...

<ol>
	<li>vander Veer, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+cellular+and+molecular+causes+of+hypertrophic+scar+formation.">Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation.</a> Burns. 35 (1), 15-29 (2009).</li><li>Linge, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+Scar+Cells+Fail+to+Undergo+a+Form+of+Apoptosis+Specific+to+Contractile+Collagen[mdash]The+Role+of+Tissue+Transglutaminase.">Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).</li><li>Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+remodeling+by+MMPs+during+wound+repair.">Matrix remodeling by MMPs during wound repair.</a> Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).</li><li>Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+in+patients+with+different+types+of+scars+and+keloids.">Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids.</a> Journal of Plastic, Reconstructive &amp; Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).</li><li>Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Implications+of+the+IL-6+Signaling+Pathway+in+Keloid+Pathogenesis.">Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).</li><li>Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+scar+formation+by+vascular+endothelial+growth+factor.">Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor.</a> Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).</li><li>Rashid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+use+for+polyvinylpyrrolidone+as+a+macromolecular+crowder+for+enhanced+extracellular+matrix+deposition+and+cell+proliferation.">Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).</li><li>Lago, J. C., Puzzi, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+aging+in+primary+human+dermal+fibroblasts.">The effect of aging in primary human dermal fibroblasts.</a> PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).</li><li>Cigognini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding+meets+oxygen+tension+in+human+mesenchymal+stem+cell+culture+-+A+step+closer+to+physiologically+relevant+in+vitro+organogenesis.">Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture - A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis.</a> Scientific Reports. 6, 30746 (2016).</li><li>Cuttle, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porcine+deep+dermal+partial+thickness+burn+model+with+hypertrophic+scarring.">A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring.</a> Burns. 32 (7), 806-820 (2006).</li><li>Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+potential+of+Shikonin+as+a+novel+hypertrophic+scar+treatment.">Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment.</a> Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shikonin+reduces+TGF-beta1-induced+collagen+production+and+contraction+in+hypertrophic+scar-derived+human+skin+fibroblasts.">Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts.</a> International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).</li><li>Werner, S., Krieg, T., Smola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocyte-Fibroblast+Interactions+in+Wound+Healing.">Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).</li></ol>

このプロトコルは、人間の皮瘢痕組織の改良された:scar-in-a-jar"in vitroモデルを最適化し、認証することを目的としています。これまでの研究では、ヒト肺線維芽細胞12、ヒト骨髄間葉幹細胞23、およびヒト真皮線維芽細胞23に対するMMC技術の応用が報告されており、デキストラン12、Ficoll12、および12<sup cla...

瘢痕組織は、組織修復の終点を表す。しかし、多くの個人、特に火傷や外傷1に苦しむ人では、瘢痕化が過剰であり、治癒した皮膚の形態および機能に望ましくない影響を及ぼす可能性がある。病理的(肥大性瘢痕およびケロイド)瘢痕形成の正確なメカニズムは十分には理解されていないが、創傷治癒時のコラーゲンの過剰な沈着が必須の寄与である2であることが実証された。
成長因子β1(TGF-β1)とα平滑筋アクチン(αSMA)の変換が肥大性瘢痕の形成において重要な役割を果たすのは十分に確立されている。証拠は、上昇したTGF-β1がSMADシグナル伝達経路3を調節することによってコラーゲンの過剰な沈着を直接刺激することを示唆している。また、αSMAは創傷治癒過程4において細胞収縮や再形成を調節することにより肥大性瘢痕形成に寄与することが分かった。インビトロおよびインビボモデルの適切な欠如は、瘢痕修復のための介入および治療法の開発と評価に対する大きな障害である。本研究の目的は、既存のMMC技術を利用して、新たな瘢痕関連の介入を評価するのに適した「生体内に似た」肥大性瘢痕モデルを構築することである。
体外の生体組織を再現する、科学界では何年もの間の目標となってきました。20世紀初頭のインビトロ技術の開発は、この目標を部分的に達成しました。現在のインビトロ技術は、胚細胞が暖かい生理食動物5で数日間生き残ることができるというルーの当初の実証からわずかに進化した。しかし、in vitroの方法論は、主に2次元で培養された単一細胞型に限定され、生体内の組織を正確に再現しない。細胞生化学、生理学、遺伝学を調べるのに役立ちますが、ネイティブ組織は3次元であり、複数の細胞タイプを組み込んでいます。単純な2次元インビトロシステムは、哺乳類細胞を、ネイティブの組織特異的なアーキテクチャが失われる高度に人工的な環境に供する6.これは細胞内および細胞外の事象に影響を及ぼし、細胞の形態、生理学、および行動7に異常をもたらす。
このプロトコルの背後にある関心は、肥大性瘢痕およびケロイドの開発および臨床管理にある。皮膚線維芽細胞が瘢痕組織に存在するコラーゲンの豊富な産生を主に担うことは定評があるが、2次元インビトロ系を用いて皮膚線維芽細胞を培養することは、生体内8で観察されたコラーゲンのターンオーバーを再現することができない。現代のインビトロ法は、生きている組織とは全く異なる環境である「温かい生理学」を依然として本質的に使用しています。生体内の組織は非常に混雑しており、タンパク質、核酸、リボヌクレオタンパク質、多糖類が総容積の5~40%を占めています。2つの分子が同時に同じ空間を占有することはできないので、利用可能な空きスペースはほとんどなく、水のほとんど完全な欠如9。
MMC技術は、細胞質ゾルおよび間質流体の熱力学的特性に影響を与える制約を課す。分子相互作用、受容体リガンドシグナル伝達複合体、酵素、およびオルガネラは、閉じ込められ、自由に相互作用することから制限される9.細胞内環境(すなわち、インタースティジウム)内の相互作用もまた制約される。最近の証拠は、混和溶液中の高濃度の不活性高分子が拡散を摂動し、物理的な関連、粘度および流体力学的特性10を摂動することを確認している。
興味深いことに、いくつかの一般的な混雑剤(すなわち、フィコール、デキストラン、ポリビニルピロリドン[PVP]、および4-スチレンスルホン酸ナトリウム[PSS])は、異なる細胞タイプおよび異なる設定に適用すると同等ではない。ある以前の研究では、FicollはPVPと比較して間葉系幹細胞の細胞毒性が低いことが報告されました。これらの結果は、その中性電荷と比較的小さい流体力学的半径11の結果であると解釈された。対照的に、第2の研究は、dextranがFicoll12と比較してヒト肺線維芽細胞によるコラーゲンI沈着を刺激するのにより効果的であることを発見した。我々自身の研究からのデータは、Ficollが肥大性瘢痕由来線維芽細胞によるコラーゲン沈着を増強するのに対し、PVPはこれらの細胞13に対して毒性があることを示唆している。
インビボ環境14では非常に混雑している間にコラーゲンへのプロコラーゲンの変換が速く、希釈された2次元培養系15では生物学的反応速度が遅れることが実証されている。ここでは、MMCを組み込んで、真皮線維症および瘢痕形成のより「インビボ様」モデルとしての役割を果たすように、in vitroプロトコルを最適化しました。一般的な2次元培養系とは対照的に、MMCでhHSFを栽培することは、コラーゲンの生合成および沈着を有意に刺激する13。特に、線維化の他の特徴(すなわち、マトリックスメタロプロテイナーゼ[MmPs]および炎症性サイトカインの発現の増加)も、この最適化されたMMCプロトコル13の下でも明らかである。この方法を用いて培養した場合、真皮細胞が生体内で測定した生理学的、生化学的、および機能的なパラメータを再現することが示される。
最適化されたMMC in vitroプロトコルは、肥大性瘢痕真皮および関係のない隣接する真皮から分離された真皮線維芽細胞によってコラーゲンおよび他のECMタンパク質の発現を評価するために使用されてきた。生体外のMMC環境で栽培した場合、hHSFが生体内の真皮肥大性瘢痕組織と同様に特定の特徴(すなわち、mRNA、生化学、生理学、および表現型)を発現することが観察されている。この証拠は、群集を選択し、体外栽培のためのMMC条件を最適化する際に、物理的および化学的特性が重要な考慮事項であることを示している。
原理の証明のために、MMCプロトコルは、シコニンとその類似体がアポトーシスを誘導する能力を定性的かつ定量的に評価するために、ここで適用される。これにより、真皮瘢痕13を管理するためのこれらの天然由来の伝統的な中国医学(TCM)化合物の潜在的な用途の評価が可能になる。それにもかかわらず、このインビトロMMCプロトコルのシンプルさ、費用対効果、適時性は、EU指令2010/63/EUおよび米国環境保護庁(EPA)による哺乳類の実験を排除するための最近の規制も満たしています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1337px;" width="1336">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">0.2 &#956;m filter</td>
			<td style="width:195px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">16534</td>
			<td style="width:537px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Alexa Fluor 680</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A-21076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Alexa Fluor 800</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A-11371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab5694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler )</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4351106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:195px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">#013-12061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">#A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Bradford protein assay</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen I primary antibody (for immunostaining)</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">6308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen I primary antibody (for western blot)</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab21286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen III primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab7778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen IV primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab6586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Direct Red 80</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>2610108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11996-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">6000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Ficoll 400</td>
			<td style="width:195px;">GE HealthCare</td>
			<td style="width:119px;">#17-0300-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Ficoll 70</td>
			<td style="width:195px;">GE HealthCare</td>
			<td style="width:119px;">#17-0310-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">GAPDH primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Goat Anti-Rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF)</td>
			<td style="width:195px;">Cell Research Corporation</td>
			<td style="width:119px;">106, 107, 108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">#1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-1 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab38929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-13 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab39012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-2 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab37150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-9 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab38898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">NanoDrop Microvolume Spectrophotometers</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">10484060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0321BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Odyssey blocking buffer</td>
			<td style="width:195px;">LI-COR Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">927&#8211;40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td style="width:195px;">LI-COR Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining)</td>
			<td style="width:195px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Penicillin/streptomycin solution (P/S)</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">PrimePCR Assays</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Protease inhibitor cocktail (PIC)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">PVP 360</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#PVP360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">PVP 40</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#PVP40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:195px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">#74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Sodium vanadate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">450022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Sodium vanadate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">SsoAdvanced universal SYBR green supermix</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">#172-5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Tween 20</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model of human cutaneous hypertrophic scarring using macromolecular crowding

生体内組織はタンパク質、核酸、リボヌクレオタンパク質、多糖類などによって非常に混雑することが示されています。次のプロトコルは、高分子群集(MMC)技術を適用して、体性ポリマー(群集機)をインビトロの細胞培養に添加することによってこの生理的混雑を模倣する。Ficollまたはデキストランをクラウダーとして使用した以前の研究は、MMC技術を使用してWI38およびWS-1細胞株におけるコラーゲンIおよびフィブロネクチンの発現が有意に増強されることを実証している。しかし、この技術は、一次肥大性瘢痕由来のヒト皮膚線維芽細胞(hHSF)において検証されていない。このプロトコルは、コラーゲンの過剰な沈着から肥大性瘢痕化が生じるため、hHSFを用いたMMC技術を適用することで、コラーゲンが豊富な体外肥肥性瘢痕モデルを構築することを目的としています。この最適化されたMMCモデルは、従来の2次元(2次元)細胞培養系と比較して、生体内瘢痕組織との類似性が高い点が示されている。さらに、動物モデルに比べて費用対効果が高く、時間効率が高く、倫理的に望ましいです。したがって、ここで報告される最適化モデルは、肥大性瘢痕関連研究のための高度な「生体内様」モデルを提供する。

各実験で三重サンプルを実施し、各実験を3人の個別の患者由来の細胞を用いて3倍ずつ繰り返した。データは、制御グループのパーセントで表されます。一方向の分散分析とTukeyの事後検定は、統計的差異を分析するために適用されました(*p 00.05)。
9%FVOでFicollを用いたMMC(分量占有率)は、hHSF13におけるコラーゲン及びコラーゲンI沈着の総13量を増?...

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In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

このプロトコルは、高分子群行の使用を用い、生体内条件に似たヒト肥大型瘢痕組織モデルを作成することを説明する。人間の皮膚線維芽細胞は、高分子環境で栽培すると、色型、生化学、生理学、および瘢痕組織に似た機能特性を示します。

高分子群集を用いたヒト皮萎縮性瘢痕化のインビトロモデル

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

高分子群集技術を用いて、細胞が生体内で経験する環境を模倣する個々のコラーゲン豊富なモデルを作成しました。皮膚は、私たちが既に体外で細胞を成長させるために使用している液体環境とは異なり、混雑した環境です。従来の単層細胞培養システムと比較して、このモデルは、細胞が生体内で経験する混雑した分子環境、特に豊富な細胞外マトリックスが液体水を置き換える瘢痕組織で再現する。肥大性瘢痕に加えて、この高分子群集化技術は、肺線維症などの細胞外マトリックスが豊富な研究に使用することができる。原稿の方向に従って瘢痕由来および正常な線維芽細胞を成長させる。その後、培地の1ミリリットルでウェルあたり50,000細胞で24ウェルプレートにそれらを播種します。プレートを摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。10%FCS DMEMにFicoll 70、Ficoll 400およびアスコルビン酸を混合することによって高分子の混雑またはMMC培地を準備する。水浴でメディアをインキュベートし、群集を溶液中に分散させます。その後、0.2マイクロメートルのフィルターでそれを殺菌する。使用済みメディアを繊維芽細胞から吸引し、作りたてのMMCメディアに置き換えます。細胞を摂氏37度で6日間インキュベートし、3日ごとにMMC培地を交換します。1ミリリットルの酢酸で200ミリリットルの蒸留脱イオン水に0.2グラムのダイレクトレッド80粉末を溶解してシリウスレッド溶液を調製します。細胞からMMC培地を吸引し、各井戸に300マイクロリットルのシリウスレッド溶液を加える。その後、細胞を培養器に90分間戻します。インキュベーション後、シリウスレッド溶液を水道水でそっとすすべし、プレートを一晩空気乾燥させます。翌日、シリウスレッドを各井戸に200マイクロリットルの水酸化モルナトリウムを加え、プレートを5~10分間振って抽出します。抽出した汚れの100マイクロリットルを透明な96ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダーで620ナノメートルで吸光度を測定します。200マイクロリットルのPBSで各井戸を洗い、10分間摂氏4度でメタノールで細胞を固定します。その後、ウェルに3%BSAを加え、室温で30分間プレートをインキュベートします。ブロッキング溶液を吸引し、各ウェルに抗コラーゲン1抗体の200マイクロリットルを加えます。プレートを90分間インキュベートします。その後、抗体を吸引し、1回の洗浄につき5分間PBSでウェルを3回洗浄する。ヤギ抗ウサギ-FITC二次抗体とDAPIの200マイクロリットルを各ウェルに加えます。プレートをアルミホイルで覆い、室温で30分間インキュベートします。二次抗体とDAPIを捨て、PBSでの化しを繰り返します。次に、顕微鏡下で直接蛍光を可視化します。PBSで細胞を2回洗浄した後、各ウェルに40マイクロリットルの溶菌バッファーを加え、ピペットチップで細胞層を削ります。次に、タンパク質のリセートをマイクロ遠心分離チューブに移し、タンパク質濃度を測定します。4~12%のビストリスタンパク質ゲルの各ウェルに10マイクログラムのタンパク質をロードし、200ボルトでSDS-PAGEを30分間実行します。終了したら、90ボルトで90分のウェスタンブロットを走らせるとニトロセルロース膜にタンパク質を移し、ゲルと膜との間に泡が形成されないように注意する。10ミリリットルのブロッキングバッファーで膜をブロックします。その後、一次抗体を摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、膜を0.1%TBS Tween 20で5回洗浄します。次に、種に適した二次抗体を室温で1時間インキュベートします。このスミッシュを繰り返し、イメージングシステムで蛍光を可視化します。市販のRNA抽出キットでRNA全体を精製した後、マイクロ体積分光光度計を用いてRNA濃度を測定します。次に、cDNA合成キットを使用して、最初の鎖DNA合成を行います。CDNAをSYBRグリーンスーパーミックスの10マイクロリットルと混合し、オリゴヌクレオチドプライマーであらかじめコーティングされたカスタム96ウェルプレートにサンプルを移します。水で1ウェルあたり20マイクロリットルに総容量を調整し、原稿の指示に従ってRT-PCRを実行します。肥大型瘢痕由来ヒト皮膚線維芽細胞の細胞密度は、PVPまたは対照を用いた場合と比較して、Ficollで培養した後に有意に増加した。9%の分量占有率でFicollを用いた高分子群集は、コラーゲン1を含むコラーゲンの堆積を他の製剤と比較して有意に増強した。定量分析により、さらに実証された。MMC環境で栽培された瘢痕由来線維芽細胞および正常な皮膚線維芽細胞は、コラーゲンに加えてECM種の発現を調節することを発見した。特に、母体メタロプロテイナーゼまたはMMPの発現が、天然組織と比較して肥厚性瘢痕組織に蓄積することが判明した。MMP2,9,13の発現は、高分子混成条件で培養された両細胞培養において有意にアップレギュレーションされている事が観察された。MMPは創傷治癒と瘢痕形成の間に重要な役割を果たし、ECMアセンブリおよびリモデリングを調節する。インターロイキン6と血管内皮増殖因子の合成は、ウェスタンブロットでは検出できなかった。しかし、RT-PCR分析は、インターロイキン6の発現が有意にアップレギュレートされ、血管内皮増殖因子の発現はMMC条件で栽培された線維芽細胞でダウンレギュレートされたことを明らかにした。このプロトコルを試みるとき、非常に少ないCO病原体を有する真皮線維芽細胞を選択することは非常に重要である。また、アスコルビン酸はMMC培地に不可欠な成分であることを覚えておいてください。特に、このMMCモデルにおけるコラーゲンの析出とアライメントの検出に関心があります。このインビトロモデルを生体内の在来瘢痕組織と比較するために、高度な顕微鏡技術を使用する予定です。我々は、他の人が補助的なモーダル組織の体外の真正性を改善するために、この高分子群集技術を使用することを奨励する。もちろん、高分子群集は、インビトロで病気や病理のモデルを再計算するためにも使用できます。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

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