Name: in vitro model of human cutaneous hypertrophic scarring using macromolecular crowding
Uploaded: 2020-05-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Singapores Agency for Science, Technology and Research "SPF 2013/004: Skin Biology Basic Research" og "Wound Care Innovation for the Tropics" IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Forfatterne anerkjenner takknemlig råd og hjelp fra Dr. Paula Benny og Dr. Michael Raghunath.

1. Cellekultur
<ol><li>Vedlikehold hHSFs og normale dermal fibroblaster avledet fra ikke-patologisk vev (hNSFs) i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) som inneholder 10% føtal kalv serum (FCS) og 1% v / v penicillin / streptomycin løsning (P / S) ved 37 ° C i en inkubator med 5% CO2/ 95% luft.</li>
	<li>Kjøp Ficoll 70, Ficoll 400 og askorbinsyre fra de aktuelle selskapene.</li>
</ol>2. Bygging av MMC hypertrofisk arrmodell
<ol><li>Frø hHSFs eller hNSFs (50.000/well) inn i ...

<ol>
	<li>vander Veer, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+cellular+and+molecular+causes+of+hypertrophic+scar+formation.">Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation.</a> Burns. 35 (1), 15-29 (2009).</li><li>Linge, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+Scar+Cells+Fail+to+Undergo+a+Form+of+Apoptosis+Specific+to+Contractile+Collagen[mdash]The+Role+of+Tissue+Transglutaminase.">Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).</li><li>Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+TGF-beta+family+in+wound+healing,+burns+and+scarring:+a+review.">The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review.</a> International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).</li><li>Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+correlation+of+in+vivo+burn+scar+contraction+with+the+level+of+alpha-smooth+muscle+actin+expression.">The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression.</a> Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).</li><li>Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle-depleted+fetal+bovine+and+human+sera+have+reduced+capacity+to+support+cell+growth.">Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373 (2015).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Kapalczynska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures.">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).</li><li>Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+enhancement+of+collagen+matrix+formation+and+crosslinking+for+applications+in+tissue+engineering:+a+preliminary+study.">In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study.</a> Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).</li><li>Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+macromolecular+crowding+can+do+to+a+protein.">What macromolecular crowding can do to a protein.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).</li><li>Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+macromolecular+crowding+to+enhance+extracellular+matrix+deposition+and+its+remodeling+in+vitro+for+tissue+engineering+and+cell-based+therapies.">Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).</li><li>Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+Crowding+Directs+Extracellular+Matrix+Organization+and+Mesenchymal+Stem+Cell+Behavior.">Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior.</a> PloS one. 7 (5), 37904 (2012).</li><li>Chen, C. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Scar-in-a-Jar:+studying+potential+antifibrotic+compounds+from+the+epigenetic+to+extracellular+level+in+a+single+well.">The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well.</a> British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+"macromolecular+crowding"+in+vitro+to+investigate+the+naphthoquinones+shikonin,+naphthazarin+and+related+analogues+for+the+treatment+of+dermal+scars.">Application of "macromolecular crowding" in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars.</a> Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).</li><li>Canty, E. G., Kadler, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procollagen+trafficking,+processing+and+fibrillogenesis.">Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis.</a> Journal of Cell Science. 118, 1341-1353 (2005).</li><li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+for+Excluded+Volume+Interaction+between+an+Unfolded+Protein+and+Rigid+Macromolecular+Cosolutes:+Macromolecular+Crowding+and+Protein+Stability+Revisited.">Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).</li><li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linearization+of+the+bradford+protein+assay.">Linearization of the bradford protein assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (38), e1918 (2010).</li><li>Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+RNeasy+Mini+Kit+to+obtain+high-quality+total+RNA+from+sessile+cells+of+Staphylococcus+aureus.">Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus.</a> Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).</li><li>Xue, M., Jackson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Matrix+Reorganization+During+Wound+Healing+and+Its+Impact+on+Abnormal+Scarring.">Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring.</a> Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).</li><li>Rohani, M. G., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+remodeling+by+MMPs+during+wound+repair.">Matrix remodeling by MMPs during wound repair.</a> Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).</li><li>Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+in+patients+with+different+types+of+scars+and+keloids.">Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids.</a> Journal of Plastic, Reconstructive &amp; Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).</li><li>Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Implications+of+the+IL-6+Signaling+Pathway+in+Keloid+Pathogenesis.">Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).</li><li>Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+scar+formation+by+vascular+endothelial+growth+factor.">Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor.</a> Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).</li><li>Rashid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+use+for+polyvinylpyrrolidone+as+a+macromolecular+crowder+for+enhanced+extracellular+matrix+deposition+and+cell+proliferation.">Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).</li><li>Lago, J. C., Puzzi, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+aging+in+primary+human+dermal+fibroblasts.">The effect of aging in primary human dermal fibroblasts.</a> PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).</li><li>Cigognini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding+meets+oxygen+tension+in+human+mesenchymal+stem+cell+culture+-+A+step+closer+to+physiologically+relevant+in+vitro+organogenesis.">Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture - A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis.</a> Scientific Reports. 6, 30746 (2016).</li><li>Cuttle, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porcine+deep+dermal+partial+thickness+burn+model+with+hypertrophic+scarring.">A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring.</a> Burns. 32 (7), 806-820 (2006).</li><li>Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+potential+of+Shikonin+as+a+novel+hypertrophic+scar+treatment.">Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment.</a> Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shikonin+reduces+TGF-beta1-induced+collagen+production+and+contraction+in+hypertrophic+scar-derived+human+skin+fibroblasts.">Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts.</a> International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).</li><li>Werner, S., Krieg, T., Smola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocyte-Fibroblast+Interactions+in+Wound+Healing.">Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).</li></ol>

Denne protokollen tar sikte på å optimalisere og autentisere en forbedret :arr-i-en-krukke" in vitro modell for menneskelig kutan arrvev. Tidligere studier har rapportert anvendelsen av MMC teknikk til humanlungefibroblaster12, human benmarg mesenchymal stamceller23, og menneskelige dermal fibroblaster23 ved hjelp av dextran12, Ficoll12, og PVP23 som crowders. I studien som ble...

Arrvev representerer endepunktet for vevreparasjon. Men hos mange individer, spesielt de som lider av brannskader eller traumer1, kan arrdannelse være overdreven og pålegge uønskede effekter på morfologiog funksjon av helbredet hud. Selv om de eksakte mekanismene for patologiske (hypertrofiske arr og keloider) arrdannelse ikke er fullt ut forstått, har overdreven avsetning av kollagen under sårheling vist seg å være et viktig bidrag2.
Det er veletablert at transformere vekstfaktor beta 1 (TGF-β1) og alfa glatt muskel actin (αSMA) spille viktige roller i dannelsen av hypertrofiske arr. Bevis tyder på at forhøyet TGF-β1 direkte stimulerer overdreven avsetning av kollagen via regulere SMAD signalvei3. I tillegg har αSMA blitt funnet å bidra til hypertrofisk arrdannelse ved å regulere cellesammentrekning og reepithelialisering i sårhelingsprosessen4. Mangelen på egnede in vitro- og in vivo-modeller er et stort hinder for å utvikle og evaluere intervensjoner og terapier for arrutbedring. Målet med denne studien er å bruke den eksisterende MMC-teknikken til å konstruere en "in vivo-lignende" hypertrofisk arrmodell som er egnet for evaluering av nye og nye arrrelaterte intervensjoner.
Reprodusere levende vev utenfor kroppen har vært et mål i årevis i det vitenskapelige samfunnet. Utviklingen av in vitro teknikker i begynnelsen av det tjuende århundre delvis oppnådd dette målet. Nåværende in vitro teknikker har litt utviklet seg fra Roux opprinnelige demonstrasjon at embryonale celler kan overleve ex vivo i flere dager i varm saltvann5. In vitro-metodene er imidlertid for det meste begrenset til enkeltcelletyper dyrket i 2D og rekapitulerer ikke nøyaktig vev in vivo. Mens nyttig for å undersøke celle biokjemi, fysiologi, og genetikk, innfødte vev er 3D og innlemme flere celletyper. Enkle 2D in vitro systemer utsette pattedyr celler til svært kunstige miljøer der innfødt vev-spesifikk arkitektur er tapt6. I sin tur påvirker dette intracellulære og ekstracellulære hendelser, noe som resulterer i unormal cellemorfologi, fysiologi og atferd7.
Interessen bak denne protokollen ligger i utvikling og klinisk forvaltning av hypertrofiske arr og keloider. Mens det er veletablert at dermal fibroblaster er i stor grad ansvarlig for rikelig produksjon av kollagen er tilstede i arrvev, dyrke dermal fibroblaster ved hjelp av 2-D in vitro systemer ikke klarer å reprodusere omsetningen av kollagen observert i vivo8. Moderne in vitro metoder fortsatt i hovedsak bruke "varm saltvann", et miljø helt forskjellig fra det i levende vev. Vev in vivo er ekstremt overfylt, med proteiner, nukleinsyrer, ribonucleoproteiner og polysakkarider, opptar 5%-40% av det totale volumet. Som ingen to molekyler kan okkupere samme plass samtidig, er det lite ledig plass tilgjengelig og et nesten fullstendig fravær av fritt vann9.
MMC-teknikken pålegger begrensninger som påvirker de termodynamiske egenskapene til cytosol og interstitielle væsker. Molekylære interaksjoner, reseptor-ligand signalering komplekser, enzymer, og organeller er begrenset og begrenset fra å samhandle fritt9. Interaksjoner i det pericellulære miljøet (dvs. interstitium) er også begrenset. Nyere bevis bekrefter at høye konsentrasjoner av inerte makromolekyler i overfylte løsninger perturb diffusjon, fysisk tilknytning, viskositet og hydrodynamiske egenskaper10.
Interessant, flere populære trengselagenter (dvs. Ficoll, dextran, polyvinylpyrrolidon [PVP], og natrium 4-styrensulfonat [PSS]) er ikke like når det brukes på forskjellige celletyper og i forskjellige innstillinger. I en tidligere studie ble Ficoll rapportert å være mindre cytotoksisk for mesenchymale stamceller sammenlignet med PVP. Disse resultatene ble tolket som konsekvensen av den nøytrale ladningen og relativt liten hydrodynamisk radius11. I motsetning fant en annen studie at dextran er mer effektiv i å stimulere kollagen jeg deponerer av humane lungefibroblaster sammenlignet med Ficoll12. Data fra vår egen studie tyder på at Ficoll forbedrer kollagenavsetning ved hypertrofisk arravledede fibroblaster, mens PVP er giftig for disse cellene13.
Det har blitt vist at konvertering av prokolen til kollagen er raskere i et svært overfylt in vivo-miljø14, mens frekvensen av biologiske reaksjoner er forsinket i et fortynnet 2D-kultursystem15. Vi har optimalisert in vitro-protokollen her, og innlemmer MMC for å vise dyrking av dermal fibroblaster som fungerer som en mer "in vivo-lignende" modell for dermal fibrose og arrdannelse. I motsetning til det vanlige 2D-kultursystemet stimulerer dyrking av hHSFs med MMC biosyntesen og avsetningen av kollagen betydelig13. Spesielt andre egenskaper av fibrose (dvs. økt uttrykk for matrise metalloproteinaser [MMPs] og proinflammatoriske cytokiner) er også tydelig under denne optimaliserte MMC-protokollen13. Når dyrket ved hjelp av denne metoden, er det vist at dermal celler rekapitulere fysiologiske, biokjemiske og funksjonelle parametere målt i vivo.
Den optimaliserte MMC in vitro-protokollen har blitt brukt til å evaluere uttrykket av kollagen og andre ECM-proteiner ved dermal fibroblaster isolert fra hypertrofisk arrdermis og uinvolvert tilstøtende dermis. Når dyrket i MMC miljøer in vitro, Det har blitt observert at hHSFs uttrykke visse egenskaper (dvs. mRNA, biokjemi, fysiologi, og fenotype) ligner dermal hypertrofisk arrvev i vivo. Bevisene indikerer at fysiske og kjemiske egenskaper er viktige hensyn når du velger crowders og optimaliserer MMC-forhold for dyrking in vitro.
For proof-of-principle brukes MMC-protokollen her for å kvalitativt og kvantitativt evaluere Shikonins evne og dets analoger til å indusere apoptose. Dette tillater evaluering av de potensielle anvendelsene av disse naturlig avledede tradisjonellkinesisk medisin (TCM) forbindelser for å administrere dermal arrdannelse13. Til tross for at enkelheten, kostnadseffektiviteten og aktualiteten til denne in vitro MMC-protokollen også tilfredsstiller nylige forskrifter for å eliminere eksperimentering hos pattedyr i EU-direktivet 2010/63/EU og US Environmental Protection Agency (EPA).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1337px;" width="1336">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">0.2 &#956;m filter</td>
			<td style="width:195px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">16534</td>
			<td style="width:537px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Alexa Fluor 680</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A-21076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Alexa Fluor 800</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A-11371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab5694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler )</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4351106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:195px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">#013-12061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">#A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Bradford protein assay</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen I primary antibody (for immunostaining)</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">6308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen I primary antibody (for western blot)</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab21286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen III primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab7778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen IV primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab6586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Direct Red 80</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>2610108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11996-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">6000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Ficoll 400</td>
			<td style="width:195px;">GE HealthCare</td>
			<td style="width:119px;">#17-0300-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Ficoll 70</td>
			<td style="width:195px;">GE HealthCare</td>
			<td style="width:119px;">#17-0310-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">GAPDH primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Goat Anti-Rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF)</td>
			<td style="width:195px;">Cell Research Corporation</td>
			<td style="width:119px;">106, 107, 108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">#1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-1 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab38929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-13 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab39012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-2 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab37150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-9 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab38898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">NanoDrop Microvolume Spectrophotometers</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">10484060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0321BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Odyssey blocking buffer</td>
			<td style="width:195px;">LI-COR Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">927&#8211;40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td style="width:195px;">LI-COR Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining)</td>
			<td style="width:195px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Penicillin/streptomycin solution (P/S)</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">PrimePCR Assays</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Protease inhibitor cocktail (PIC)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">PVP 360</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#PVP360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">PVP 40</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#PVP40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:195px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">#74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Sodium vanadate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">450022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Sodium vanadate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">SsoAdvanced universal SYBR green supermix</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">#172-5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Tween 20</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model of human cutaneous hypertrophic scarring using macromolecular crowding

Det har vist seg at in vivo vev er svært overfylt av proteiner, nukleinsyrer, ribonucleoproteiner, polysakkarider, etc. Følgende protokoll bruker en makromolekylær trengsel (MMC) teknikk for å etterligne denne fysiologiske trengsel gjennom tillegg av nøytrale polymerer (crowders) til cellekulturer in vitro. Tidligere studier som bruker Ficoll eller dextran som crowders viser at uttrykket av kollagen I og fibronectin i WI38 og WS-1 cellelinjer er betydelig forbedret ved hjelp av MMC-teknikken. Denne teknikken er imidlertid ikke validert i primær hypertrofisk arr-avledet human hudfibroblaster (hHSFs). Som hypertrofisk arrdannelse oppstår fra overdreven avsetning av kollagen, har denne protokollen som mål å konstruere en kollagenrik in vitro hypertrofisk arrmodell ved å bruke MMC-teknikken med hHSFs. Denne optimaliserte MMC-modellen har vist seg å ha flere likheter med in vivo arrvev sammenlignet med tradisjonelle 2-dimensjonale (2D) cellekultursystemer. I tillegg er det kostnadseffektivt, tidseffektivt og etisk ønskelig sammenlignet med dyremodeller. Derfor tilbyr den optimaliserte modellen som er rapportert her, en avansert "in vivo-lignende" modell for hypertrofisk arrrelaterte studier.

Triplicate prøver ble utført i hvert eksperiment, og hvert eksperiment ble gjentatt 3x ved hjelp av celler fra tre individuelle pasienter. Data uttrykkes som prosenter av kontrollgruppen. Enveis ANOVA og Tukeys posthoc-test ble brukt for å analysere statistiske forskjeller (*p 20,05).
MMC ved bruk av Ficoll ved 9 % FVO (fraksjonelt volumbelegg) forbedrer den totale mengden kollagen og kollagen jeg deponerer i hHSF13. Som illustrert i fig...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding at JoVE.com

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

Denne protokollen beskriver bruken av makromolekylær trengsel for å skape en in vitro menneskelig hypertrofisk arrvevsmodell som ligner på vivo-forhold. Når dyrket i en overfylt makromolekylærmiljø, menneskelig hud fibroblaster viser fenotyper, biokjemi, fysiologi, og funksjonelle egenskaper som ligner arrvev.

I Vitro Modell av Human Kutan Hypertrofisk Arrdannelse ved hjelp av makromolekylær trengsel

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Vi laget en individuell kollagenrik modell for å etterligne miljøet som cellene opplever in vivo ved hjelp av makromolekylær trengselteknikk. Hud er et overfylt miljø, i motsetning til det flytende miljøet som vi allerede bruker til å dyrke celler in vitro. Sammenlignet med det tradisjonelle monolayer celle kultursystemet, gjenskaper denne modellen det overfylte molekylære miljøet som cellene opplever in vivo, spesielt i arrvev hvor rikelig ekstracellulær matrise fortrenger flytende vann.Foruten hypertrofiske arr kan denne makromolekylære trengselteknikken brukes til studier der den ekstracellulære matrisen er rikelig, for eksempel lungefibrose. Vokse arr-avledet og normale fibroblaster i henhold til manuskript retninger. Deretter frø dem inn i 24 brønnplater på 50.000 celler per brønn i en milliliter medium.Inkuber platen over natten ved 37 grader Celsius og 5%karbondioksid. Forbered makromolekylær trengsel eller MMC-medier ved å blande Ficoll 70, Ficoll 400 og askorbinsyre i 10% FCS DMEM. Inkuber media i et vannbad for å spre crowders inn i løsningen.Steriliser den deretter med et 0,2 mikrometerfilter. Aspirer de brukte mediene fra fibroblastene og erstatt det med nyoppdyde MMC-medier. Inkuber cellene ved 37 grader Celsius i seks dager, og endre MMC-mediet hver tredje dag.Forbered en Sirius Red-løsning ved å oppløse 0,2 gram Direct Red 80 pulver i 200 milliliter destillert deionisert vann med en milliliter eddiksyre. Aspirer MMC-mediet fra cellene og legg til 300 mikroliter Sirius Red-løsning til hver brønn. Deretter returnerer cellene til inkubatoren i 90 minutter.Etter inkubasjonen skyller du forsiktig Sirius Red-oppløsningen med vann fra springen og lar platen lufttørke over natten. På neste dag trekker du sirius rød ut ved å legge til 200 mikroliter med 0,1 molarnatriumhydroksid i hver brønn og riste platen i fem til 10 minutter. Overfør 100 mikroliter av den ekstraherte flekken til en gjennomsiktig 96 brønnplate og mål absorbansen ved 620 nanometer med en mikroplateleser.Vask hver brønn med 200 mikroliter PBS og fest cellene med metanol ved fire grader Celsius i 10 minutter. Tilsett deretter 3% BSA til brønnene og inkuber platen i 30 minutter ved romtemperatur. Aspirer blokkeringsløsningen og tilsett 200 mikroliter antikollagen ett antistoff til hver brønn.Inkuber platen i 90 minutter. Deretter aspirerer antistoffet og vask brønnene tre ganger med PBS i fem minutter per vask. Tilsett 200 mikroliter geit anti-kanin-FITC sekundært antistoff og DAPI til hver brønn.Dekk platen med aluminiumsfolie og inkuber den i 30 minutter ved romtemperatur. Kast det sekundære antistoffet og DAPI og gjenta vaskene med PBS. Deretter visualiserer fluorescensen direkte under et mikroskop.Etter å ha vasket cellene to ganger med PBS, legg til 40 mikroliter lysisbuffer i hver brønn og skrap cellelaget med en pipettespiss. Overfør deretter proteinet lysate til mikro sentrifugerør for å måle proteinkonsentrasjonen. Legg 10 mikrogram protein i hver brønn av en fire til 12% Bis-Tris proteingel og utfør SDS-PAGE på 200 volt i 30 minutter.Når du er ferdig, overfør proteinet til en nitrocellulosemembran ved å kjøre en vestlig flekk på 90 volt i 90 minutter, og vær forsiktig for å unngå bobledannelse mellom gelen og membranen. Blokker membranen med 10 milliliter blokkerende buffer. Deretter inkubere det med primære antistoffer ved fire grader Celsius over natten.På neste dag vasker du membranen fem ganger med 0,1 prosent TBS Tween 20 i fem minutter per vask. Inkuber deretter membranen med et artstilpasset sekundært antistoff i en time ved romtemperatur. Gjenta vaskene og visualiser fluorescens med et bildebehandlingssystem.Etter å ha renset den totale RNA med et kommersielt RNA-ekstraksjonssett, måler du RNA-konsentrasjonen ved hjelp av et mikrovolumspektrofotometer. Bruk deretter et cDNA-syntesesett til å utføre en første tråd DNA-syntese. Bland cDNA med 10 mikroliter SYBR Green Supermix og overfør prøvene til en tilpasset 96 brønnplate pre-belagt med oligonukleotid primere.Juster det totale volumet til 20 mikroliter per brønn med vann og kjør RT-PCR i henhold til manuskriptretninger. Celletettheten av hypertrofiske arravledede humane hudfibroblaster økte betydelig etter at ficoll ble kultivert sammenlignet med bruk av PVP eller kontrollen. Makromolekylær trengsel med Ficoll på 9% brøkdel volum belegg betydelig forbedret avsetning av kollagen, inkludert kollagen en, sammenlignet med andre formuleringer.Dette ble videre demonstrert med kvantitativ analyse. Arravledede fibroblaster og normale dermale fibroblaster dyrket i MMC-miljøer ble funnet å regulere uttrykket av ECM-arter i tillegg til kollagen. Spesielt, et forhøyet uttrykk for matrise metalloproteinaser eller MMPs ble funnet å samle seg i hypertrofisk arr vev sammenlignet med innfødte vev.Det ble observert at uttrykket for MMP2, ni og 13 var betydelig oppregulert i begge cellekulturer dyrket i makromolekylære trengselforhold. MmPs spiller en viktig rolle under sårheling og arrdannelse, regulere ECM montering og ombygging. Syntese av interleukin seks og vaskulær endotelvekstfaktor var umulig å oppdage i en vestlig flekk.Men RT-PCR analyse viste at uttrykket av interleukin seks var betydelig oppregulert, mens uttrykket for vaskulær endotelvekstfaktor var nedregulert i fibroblaster dyrket i MMC forhold. Når du prøver denne protokollen, er det svært viktig å velge dermal fibroblaster som har svært få CO-patogener. Vi må også huske på at askorbinsyre er en viktig ingrediens i MMC-mediet.Vi er spesielt interessert i ytterligere å oppdage kollagen deponering og justering i denne MMC-modellen. Vi planlegger å bruke avanserte mikroskopiske teknikker for å sammenligne denne in vitro-modellen med innfødte arrvev in vivo. Vi oppfordrer andre til å bruke denne makromolekylære trengselteknikken for å forbedre in vitro-ektheten av hjelpemodalvevet.Selvfølgelig kan makromolekylær trengsel også brukes til å beregne modeller av sykdom og patologi in vitro.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Visualisere Proteiner og makromolekylær komplekser ved Negative Stain EM: fra Grid Forberedelse til Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Anatomiske rekonstruksjoner av Human Cardiac venøse systemet ved hjelp av kontrast-computertomografi av Perfusjons-fast Prøver

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell Co-kultur Mønster med vandig tofasesystemer

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering av en menneskelig 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhalert Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produksjon, karakterisering og potensielle bruk av en 3D Tissue-konstruert Menneskelig Esophageal slimhinnene Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øyeirritasjonstest (EIT) for fareidentifikasjon for Eye irriterende kjemikalier som bruker Rekonstruert Menneskelig Hornhinnen lignende Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Forbedre 2D- og 3D-Skin<em&gt; In Vitro</em&gt; Modeller Bruke makromolekylær gruppering

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Bruke Rekonstituert Blood Model Hemostase og platetransfusjon<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell av Murine mellomvirvelskive

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...