Name: in vitro model of human cutaneous hypertrophic scarring using macromolecular crowding
Uploaded: 2020-05-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding at JoVE.com

Эта работа была поддержана финансированием из Сингапура Агентство по науке, технологиям и исследованиям "SPF 2013/004: Биология кожи Основные исследования" и "Wound Care Инновации для тропиков" IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Авторы с благодарностью признают советы и помощь д-ра Паулы Бенни и д-ра Майкла Рагхунатха.

1. Культура клеток
<ol><li>Поддержание hHSFs и нормальных кожных фибробластов, полученных из непатологических тканей (hNSFs) в модифицированной среде Орла Dulbecco (DMEM), содержащей 10% фетальной икроножной сыворотки (FCS) и21% v/v пенициллин/стрептомицин раствор (P/S) при 37-C в инторе с 5%</li>
	<li>Купить Fic...

<ol>
	<li>vander Veer, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+cellular+and+molecular+causes+of+hypertrophic+scar+formation.">Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation.</a> Burns. 35 (1), 15-29 (2009).</li><li>Linge, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+Scar+Cells+Fail+to+Undergo+a+Form+of+Apoptosis+Specific+to+Contractile+Collagen[mdash]The+Role+of+Tissue+Transglutaminase.">Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).</li><li>Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+TGF-beta+family+in+wound+healing,+burns+and+scarring:+a+review.">The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review.</a> International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).</li><li>Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+correlation+of+in+vivo+burn+scar+contraction+with+the+level+of+alpha-smooth+muscle+actin+expression.">The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression.</a> Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).</li><li>Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle-depleted+fetal+bovine+and+human+sera+have+reduced+capacity+to+support+cell+growth.">Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373 (2015).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Kapalczynska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures.">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).</li><li>Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+enhancement+of+collagen+matrix+formation+and+crosslinking+for+applications+in+tissue+engineering:+a+preliminary+study.">In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study.</a> Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).</li><li>Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+macromolecular+crowding+can+do+to+a+protein.">What macromolecular crowding can do to a protein.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).</li><li>Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+macromolecular+crowding+to+enhance+extracellular+matrix+deposition+and+its+remodeling+in+vitro+for+tissue+engineering+and+cell-based+therapies.">Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).</li><li>Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+Crowding+Directs+Extracellular+Matrix+Organization+and+Mesenchymal+Stem+Cell+Behavior.">Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior.</a> PloS one. 7 (5), 37904 (2012).</li><li>Chen, C. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Scar-in-a-Jar:+studying+potential+antifibrotic+compounds+from+the+epigenetic+to+extracellular+level+in+a+single+well.">The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well.</a> British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+"macromolecular+crowding"+in+vitro+to+investigate+the+naphthoquinones+shikonin,+naphthazarin+and+related+analogues+for+the+treatment+of+dermal+scars.">Application of "macromolecular crowding" in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars.</a> Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).</li><li>Canty, E. G., Kadler, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procollagen+trafficking,+processing+and+fibrillogenesis.">Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis.</a> Journal of Cell Science. 118, 1341-1353 (2005).</li><li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+for+Excluded+Volume+Interaction+between+an+Unfolded+Protein+and+Rigid+Macromolecular+Cosolutes:+Macromolecular+Crowding+and+Protein+Stability+Revisited.">Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).</li><li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linearization+of+the+bradford+protein+assay.">Linearization of the bradford protein assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (38), e1918 (2010).</li><li>Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+RNeasy+Mini+Kit+to+obtain+high-quality+total+RNA+from+sessile+cells+of+Staphylococcus+aureus.">Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus.</a> Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).</li><li>Xue, M., Jackson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Matrix+Reorganization+During+Wound+Healing+and+Its+Impact+on+Abnormal+Scarring.">Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring.</a> Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).</li><li>Rohani, M. G., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+remodeling+by+MMPs+during+wound+repair.">Matrix remodeling by MMPs during wound repair.</a> Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).</li><li>Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+in+patients+with+different+types+of+scars+and+keloids.">Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids.</a> Journal of Plastic, Reconstructive &amp; Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).</li><li>Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Implications+of+the+IL-6+Signaling+Pathway+in+Keloid+Pathogenesis.">Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).</li><li>Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+scar+formation+by+vascular+endothelial+growth+factor.">Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor.</a> Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).</li><li>Rashid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+use+for+polyvinylpyrrolidone+as+a+macromolecular+crowder+for+enhanced+extracellular+matrix+deposition+and+cell+proliferation.">Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).</li><li>Lago, J. C., Puzzi, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+aging+in+primary+human+dermal+fibroblasts.">The effect of aging in primary human dermal fibroblasts.</a> PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).</li><li>Cigognini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding+meets+oxygen+tension+in+human+mesenchymal+stem+cell+culture+-+A+step+closer+to+physiologically+relevant+in+vitro+organogenesis.">Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture - A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis.</a> Scientific Reports. 6, 30746 (2016).</li><li>Cuttle, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porcine+deep+dermal+partial+thickness+burn+model+with+hypertrophic+scarring.">A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring.</a> Burns. 32 (7), 806-820 (2006).</li><li>Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+potential+of+Shikonin+as+a+novel+hypertrophic+scar+treatment.">Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment.</a> Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shikonin+reduces+TGF-beta1-induced+collagen+production+and+contraction+in+hypertrophic+scar-derived+human+skin+fibroblasts.">Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts.</a> International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).</li><li>Werner, S., Krieg, T., Smola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocyte-Fibroblast+Interactions+in+Wound+Healing.">Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).</li></ol>

Этот протокол направлен на оптимизацию и аутентификации улучшенной модели in-scar-in-a-jar для человеческой кожной рубцовой ткани. Предыдущие исследования сообщили о применении метода MMC для человека фибробластов легких12, человеческий костный мозг мезенхимальных стволовых кле...

Рубцовая ткань представляет собой конечную точку восстановления тканей. Тем не менее, у многих людей, особенно тех, кто страдает от ожогов или травм1, рубцы могут быть чрезмерными и налагать нежелательное воздействие на морфологию и функционирование исцелил кожи. Хотя точные механизмы патологических (гипертрофические рубцы и келоиды) образование рубцов не до конца изучены, чрезмерное осаждение коллагена во время заживления ран было продемонстрировано, чтобы быть существенным вкладом2.
Хорошо известно, что преобразование фактора роста бета 1 (TGF-No1) и альфа-гладкий мышечный актин (ЗСМА) играют ключевую роль в формировании гипертрофированного рубцов. Фактические данные свидетельствуют о том, что повышенный TGF-No1 непосредственно стимулирует чрезмерное осаждение коллагена через регулирование сигнального пути SMAD3. Кроме того, было установлено, что ЗСМА способствует гипертрофическому образованию рубцов, регулируя сокращение клеток и репиттелилиализацию в процессе заживления ран4. Отсутствие подходящих моделей in vitro и in vivo является основным препятствием на пути разработки и оценки мероприятий и методов лечения рубцов. Цель этого исследования заключается в использовании существующей техники MMC для создания "виво-как" гипертрофические рубцовая модель, которая подходит для оценки новых и возникающих рубцов, связанных с вмешательствами.
Воспроизводство живой ткани вне тела было целью в течение многих лет в научном сообществе. Развитие методов in vitro в начале ХХ века частично достигло этой цели. Текущие методы in vitro слегка эволюционировали от первоначальной демонстрации Ру, что эмбриональные клетки могут выжить ex vivo в течение нескольких дней в теплом сольнике5. Тем не менее, методологии in vitro в основном ограничиваются одноклеточными типами, культивируемыми в 2-D, и не точно переизглажают ткани in vivo. Хотя полезно для изучения биохимии клеток, физиологии и генетики, родные ткани 3-D и включают несколько типов клеток. Простые 2-D системы in vitro подвергают клетки млекопитающих высокоискусственной среде, в которой родная ткань-специфическая архитектура теряется6. В свою очередь, это влияет на внутриклеточные и внеклеточные события, в результате чего аномальные морфологии клеток, физиологии и поведения7.
Интерес к этому протоколу лежит в разработке и клиническом ведении гипертрофированными рубцов и келоидов. Хотя хорошо установлено, что дермальные фибробласты в значительной степени ответственны за обильное производство коллагенов, присутствующих в рубцовой ткани, культивирование кожных фибробластов с использованием 2-D в пробирке систем не может воспроизвести оборот коллагена наблюдается в vivo8. Современные методы in vitro по-прежнему по существу используют "теплый солин", среду, полностью отличающаяся от среды в живых тканях. Ткани in vivo чрезвычайно переполнены, с белками, нуклеиновыми кислотами, рибонуклеопротеитами и полисахаридами, занимающими 5%-40% от общего объема. Поскольку ни одна из двух молекул не может занимать одно и то же пространство одновременно, свободного пространства мало и почти полное отсутствие свободной воды9.
Метод MMC налагает ограничения, влияющие на термодинамические свойства цитозола и интерстициальных жидкостей. Молекулярные взаимодействия, рецептор-лиганд сигнальные комплексы, ферменты и органеллы ограничены и ограничены от свободного взаимодействия9. Взаимодействия в периклеарной среде (т.е. интерститиум) также ограничены. Последние данные подтверждают, что высокие концентрации инертных макромолекулов в переполненных растворах возмущения диффузии, физической ассоциации, вязкости и гидродинамических свойств10.
Интересно, что несколько популярных агентов скученности (нат., Ficoll, dextran, polyvinylpyrrolidone »PVP» и натрий 4-styrenesulfonate »PSS») не эквивалентны при применении к различным типам клеток и в различных условиях. В одном предыдущем исследовании, Фиколл, как сообщается, менее цитотоксических для мезенхимальных стволовых клеток по сравнению с PVP. Эти результаты были интерпретированы как следствие его нейтрального заряда и относительно небольшого гидродинамического радиуса11. В отличие от этого, второе исследование показало, что декектин является более эффективным в стимулировании коллагена Я осаждения человека фибробластов легких по сравнению с Ficoll12. Данные нашего собственного исследования показывают, что Фиколл усиливает осаждение коллагена гипертрофированными рубцовами фибробластов, в то время как PVP является токсичным для этих клеток13.
Было продемонстрировано, что преобразование проколлагена в коллаген быстрее в очень переполненном in vivo окружающей среды14, в то время как скорость биологических реакций задерживается в разбавленной 2-D культуры системы15. Мы оптимизировали протокол in vitro здесь, включая MMC, чтобы показать выращивание кожных фибробластов, служащих в качестве более "виво-подобной" модели дермального фиброза и образования рубцов. В отличие от общей 2-D культуры системы, культивирование hHSFs с MMC стимулирует биосинтез и осаждение коллагена значительно13. Примечательно, что в этом оптимизированном протоколе MMC13проявляются и другие характеристики фиброза (т.е. повышенная экспрессия матричных металлопротеиназ и провоспалительных цитокинов). При выращивании с помощью этого метода, показано, что дермальные клетки резюмируют физиологические, биохимические и функциональные параметры, измеренные в vivo.
Оптимизированный протокол MMC in vitro был использован для оценки экспрессии коллагена и других белков ECM дермическими фибробластами, изолированными от гипертрофических рубцовой дермы и невовлеченной смежной дермы. При выращивании в средах MMC in vitro было отмечено, что hHSFs выражают определенные характеристики (т.е. мРНК, биохимия, физиология и фенотип), похожие на дермальные гипертрофические рубцовые ткани in vivo. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что физические и химические свойства являются важными соображениями при выборе сеулеров и оптимизации условий MMC для выращивания в пробирке.
Для доказательства принципа здесь применяется протокол MMC для качественной и количественной оценки способности Шиконина и его аналогов вызывать апоптоз. Это позволяет оценить потенциальные применения этих естественно полученных традиционной китайской медицины (TCM) соединений для управления кожные рубцы13. Несмотря на это, простота, рентабельность и своевременность этого протокола in vitro MMC также удовлетворяет недавние правила по ликвидации экспериментов на млекопитающих директивой ЕС 2010/63/EU и Агентством по охране окружающей среды США (EPA).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1337px;" width="1336">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">0.2 &#956;m filter</td>
			<td style="width:195px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">16534</td>
			<td style="width:537px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Alexa Fluor 680</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A-21076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Alexa Fluor 800</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A-11371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab5694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler )</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4351106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:195px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">#013-12061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">#A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Bradford protein assay</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen I primary antibody (for immunostaining)</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">6308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen I primary antibody (for western blot)</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab21286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen III primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab7778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen IV primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab6586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Direct Red 80</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>2610108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11996-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">6000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Ficoll 400</td>
			<td style="width:195px;">GE HealthCare</td>
			<td style="width:119px;">#17-0300-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Ficoll 70</td>
			<td style="width:195px;">GE HealthCare</td>
			<td style="width:119px;">#17-0310-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">GAPDH primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Goat Anti-Rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF)</td>
			<td style="width:195px;">Cell Research Corporation</td>
			<td style="width:119px;">106, 107, 108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">#1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-1 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab38929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-13 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab39012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-2 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab37150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-9 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab38898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">NanoDrop Microvolume Spectrophotometers</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">10484060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0321BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Odyssey blocking buffer</td>
			<td style="width:195px;">LI-COR Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">927&#8211;40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td style="width:195px;">LI-COR Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining)</td>
			<td style="width:195px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Penicillin/streptomycin solution (P/S)</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">PrimePCR Assays</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Protease inhibitor cocktail (PIC)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">PVP 360</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#PVP360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">PVP 40</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#PVP40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:195px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">#74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Sodium vanadate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">450022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Sodium vanadate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">SsoAdvanced universal SYBR green supermix</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">#172-5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Tween 20</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model of human cutaneous hypertrophic scarring using macromolecular crowding

Было показано, что ткани in vivo очень переполнены белками, нуклеиновыми кислотами, рибонуклеопротеитами, полисахаридами и т.д. Следующий протокол применяет макромолекулярную методика скученности (MMC), чтобы имитировать эту физиологическую скученность через добавление нейтральных полимеров (краудеров) к клеточным культурам in vitro. Предыдущие исследования с использованием Ficoll или dextran в качестве краудтеров показывают, что выражение коллагена I и фибронектина в линиях клеток WI38 и WS-1 значительно усиливается с помощью метода MMC. Тем не менее, этот метод не был проверен в первичных гипертрофических рубцов полученных человеческих фибробластов кожи (hHSFs). Как гипертрофические рубцы возникает из-за чрезмерного осаждения коллагена, этот протокол направлен на создание коллагена богатых в пробирке гипертрофической модели рубца, применяя технику MMC с hHSFs. Эта оптимизированная модель MMC, как было показано, обладает большим сходством с рубцовой тканью in vivo по сравнению с традиционными 2-мерными (2-D) системами клеточной культуры. Кроме того, это экономически эффективным, экономичным и этически желательным по сравнению с животными моделями. Таким образом, оптимизированная модель сообщила здесь предлагает передовые "виво-как" модель для гипертрофических рубцов, связанных исследований.

Трипликатные образцы были выполнены в каждом эксперименте, и каждый эксперимент был повторен 3x с использованием клеток из трех отдельных пациентов. Данные выражаются в процентах контрольной группы. Для анализа статистических различий были применены односторонние ANOVA и пост-специальн...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding at JoVE.com

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

Этот протокол описывает использование макромолекулярной скученности для создания в пробирке человеческой гипертрофической модели рубцовой ткани, которая напоминает условия in vivo. При выращивании в переполненной макромолекулярной среде фибробласты кожи человека демонстрируют фенотипы, биохимию, физиологию и функциональные характеристики, напоминающие рубцовую ткань.

В vitro Модель человека кожные гипертрофические рубцы с помощью макромолекулярной crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Мы создали индивидуальную модель, богатую коллагеном, чтобы имитировать окружающую среду, которую клетки испытывают in vivo, используя макромолекулярную технику скучения. Кожа является переполненной среде, в отличие от жидкой среды, что мы уже используем для выращивания клеток в пробирке. По сравнению с традиционной системой культуры монослойных клеток, эта модель воссоздает переполненную молекулярную среду, которую клетки испытывают in vivo, особенно в рубцовых тканях, где обильная внеклеточная матрица вытесняет жидкую воду.Помимо гипертрофических рубцов, этот макромолекулярный метод скученности может быть использован для исследований, где внеклеточная матрица в изобилии, таких как легочный фиброз. Выращиваем шрамы и нормальные фибробласты в соответствии с рукописными указаниями. Затем семя их в 24 хорошо пластин на 50000 клеток на колодец в один миллилитр среды.Инкубировать пластину на ночь при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе. Подготовка макромолекулярной скученности или MMC средств массовой информации путем смешивания Ficoll 70, Ficoll 400 и аскорбиновой кислоты в 10%FCS DMEM. Инкубировать средства массовой информации в водяной бане, чтобы разогнать скученников в раствор.Затем стерилизовать его с помощью фильтра 0,2 микрометра. Аспирировать оттраченные средства массовой информации из фибробластов и заменить его на свежеприготовленные средства массовой информации MMC. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в течение шести дней, меняя средства массовой информации MMC каждые три дня.Приготовьте раствор Sirius Red, растворив 0,2 грамма порошка Direct Red 80 в 200 миллилитров дистиллированной деионизированной воды с одним миллилитром уксусной кислоты. Оспирировать средства MMC из ячеек и добавить 300 микролитров раствора Sirius Red к каждой хорошо. Затем верните клетки в инкубатор на 90 минут.После инкубации аккуратно промойте раствор Sirius Red водопроводной водой и дайте пластине высохнуть на ночь. На следующий день извлечения Сириус Красный, добавив 200 микролитров 0,1 молярного гидроксида натрия в каждой хорошо и встряхивая пластины в течение пяти-десяти минут. Передача 100 микролитров извлеченного пятна в прозрачную пластину 96 хорошо и измерить поглощение на 620 нанометров с микро пластины читателя.Вымойте каждый колодец с 200 микролитров PBS и исправить клетки с метанолом при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут. Затем добавьте 3%BSA в скважины и инкубировать пластину в течение 30 минут при комнатной температуре. Аспирировать блокирующий раствор и добавить 200 микролитров анти-коллагена по одному антителу к каждой хорошо.Инкубировать тарелку в течение 90 минут. Затем аспирировать антитела и мыть колодцы три раза с PBS в течение пяти минут за стирку. Добавьте 200 микролитров козьего анти-Кролика-FITC вторичного антитела и DAPI к каждой хорошо.Накройте тарелку алюминиевой фольгой и инкубировать ее в течение 30 минут при комнатной температуре. Откажитесь от вторичных антител и DAPI и повторите моет с PBS. Затем визуализируете флуоресценцию прямо под микроскопом.После мытья клеток дважды с PBS, добавить 40 микролитров лиза буфера в каждой хорошо и соскребать клеточный слой с кончиком пипетки. Затем перенесите лизат белка в трубки микро центрифуги для измерения концентрации белка. Загрузите 10 микрограммов белка в каждый колодец из белка 4-12%Bis-Tris и выполните SDS-PAGE на 200 вольт в течение 30 минут.После завершения, передача белка в мембрану нитроцеллюлозы, запуская западную помарку на 90 вольт в течение 90 минут, заботясь, чтобы избежать образования пузыря между гелем и мембраной. Заблокировой мембрану 10 миллилитров блокирующего буфера. Затем инкубировать его с первичными антителами при четырех градусах по Цельсию в одночасье.На следующий день, мыть мембрану пять раз с 0,1 процента TBS Tween 20 в течение пяти минут за стирку. Затем инкубировать мембрану с видом соответствующих вторичных антител в течение одного часа при комнатной температуре. Повторите мойки и визуализировать флуоресценцию с помощью системы визуализации.Очищая общую РНК коммерческим набором для экстракции РНК, измерьте концентрацию РНК с помощью микрообъемного спектрофотометра. Затем используйте комплект синтеза cDNA для выполнения первого синтеза ДНК нити. Смешайте cDNA с 10 микролитров SYBR Green Supermix и передать образцы на обычай 96 хорошо пластины предварительно покрыты олигонуклеотид грунтовки.Отрегулируйте общий объем до 20 микролитров на колодец с водой и запустите RT-PCR в соответствии с рукописными указаниями. Плотность клеток гипертрофических рубцов человеческих фибробластов кожи человека значительно увеличилась после культивирования с Ficoll по сравнению с использованием PVP или контроля. Макромолекулярная скученности с Ficoll на 9% дробного объема занятости значительно увеличилось осаждение коллагена, в том числе коллагена один, по сравнению с другими формулировками.Это было дополнительно продемонстрировано с помощью количественного анализа. Были найдены фибробласты, полученные из шрамов, и нормальные кожные фибробласты, культивируемые в средах MMC, чтобы регулировать экспрессию видов ECM в дополнение к коллагену. Примечательно, что повышенное выражение матричных металлопротеиназ или ПМВ накапливается в гипертрофических рубцовых тканях по сравнению с местными тканями.Было отмечено, что выражение MMP2, 9 и 13 были значительно up-regulated в обеих культурах клетки культивируемых в макромолекулярных условиях скученсти. MMPs играют важную роль во время заживления ран и образования рубцов, регулируя сборку и реконструкцию ECM. Синтез интерлеукина шести и сосудистого эндотелиального фактора роста был необнаружим в западной помарке.Но анализ RT-PCR показал, что экспрессия интерлеукиновой шестерки была значительно выше регулируется, в то время как экспрессия сосудистого эндотелиального фактора роста была вниз регулируется в фибробластах, культивируемых в условиях MMC. При попытке этого протокола, это очень важно, чтобы выбрать кожные фибробласты, которые имеют очень мало патогенов CO. Мы также должны иметь в виду, что аскорбиновая кислота является важным ингредиентом в среде MMC.Мы особенно заинтересованы в дальнейшем обнаружении осаждения коллагена и выравнивания в этой модели MMC. Мы планируем использовать передовые микроскопические методы, чтобы сравнить эту модель in vitro с родными рубцовых тканей in vivo. Мы призываем других использовать этот макромолекулярный метод скученности для улучшения подлинности вспомогательной модальной ткани in vitro.Конечно, макромолекулярное скучение также может быть использовано для пересчета моделей заболеваний и патологий in vitro.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Визуализация белков и макромолекулярных комплексов по Отрицательные пятна EM: от сетки Подготовка к Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Анатомические реконструкций сердца человека венозной системы использованием контраста Компьютерная томография перфузии фиксированных экземпляров

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Сотовые Co-культуре Создание массивов с использованием водных двухфазных системах

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Тканевая инженерия человеческого 3D<em&gt; В пробирке</em&gt; Опухоль Тестовая система

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

В пробирке клеточных культур модели для токсичных ингаляционной химической тестирования

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Производственные, характеристики и потенциальные возможности использования в 3D тканевой инженерии человека пищевода слизистой модели

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Раздражение глаз тест (СПЭ) для идентификации опасности глазных Раздражает химических веществ с использованием реконструированного человеческой роговицы, как Эпителиальный (RHCE) тканей Модель

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Улучшение 2D и 3D кожи<em&gt; In Vitro</em&gt; Модели Использование макромолекулярных Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Микрожидкостных Flow Камеры Использование водостойких крови к модели гемостаза и тромбоцитарный Переливание<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

<em&gt; In Vitro</em&gt; Орган культуры Модель мышиной межпозвонкового диска

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...