Name: in vitro model of human cutaneous hypertrophic scarring using macromolecular crowding
Uploaded: 2020-05-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la financiación de la Agencia de Ciencia, Tecnología e Investigación de Singapur "SPF 2013/004: Investigación Básica de La Biología de la Piel" y la "Innovación para el Cuidado de la Herida para los Trópicos" IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Los autores agradecen el asesoramiento y la asistencia de la Dra. Paula Benny y la Dra. Michael Raghunath.

1. Cultivo celular
<ol><li>Mantener los hHSF y los fibroblastos dérmicos normales derivados del tejido no patológico (hNSF) en el medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco que contiene un 10% de suero fetal (FCS) y una solución de 1% v/v de penicilina/estreptomicina (P/S) a 37oC en una incubadora con un 5% de CO 2/95% de aire.2</li>
	<li>Compra Ficoll 70, Ficoll 400 y ácido ascórbico de las empresas apropiadas.</li>
</ol>2. Construcción del modelo de cicatrices hipertróficas...

<ol>
	<li>vander Veer, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+cellular+and+molecular+causes+of+hypertrophic+scar+formation.">Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation.</a> Burns. 35 (1), 15-29 (2009).</li><li>Linge, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+Scar+Cells+Fail+to+Undergo+a+Form+of+Apoptosis+Specific+to+Contractile+Collagen[mdash]The+Role+of+Tissue+Transglutaminase.">Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).</li><li>Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+TGF-beta+family+in+wound+healing,+burns+and+scarring:+a+review.">The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review.</a> International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).</li><li>Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+correlation+of+in+vivo+burn+scar+contraction+with+the+level+of+alpha-smooth+muscle+actin+expression.">The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression.</a> Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).</li><li>Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Kapalczynska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures.">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).</li><li>Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+enhancement+of+collagen+matrix+formation+and+crosslinking+for+applications+in+tissue+engineering:+a+preliminary+study.">In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study.</a> Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).</li><li>Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. 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Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Scar-in-a-Jar:+studying+potential+antifibrotic+compounds+from+the+epigenetic+to+extracellular+level+in+a+single+well.">The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well.</a> British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+"macromolecular+crowding"+in+vitro+to+investigate+the+naphthoquinones+shikonin,+naphthazarin+and+related+analogues+for+the+treatment+of+dermal+scars.">Application of "macromolecular crowding" in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars.</a> Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).</li><li>Canty, E. G., Kadler, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procollagen+trafficking,+processing+and+fibrillogenesis.">Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis.</a> Journal of Cell Science. 118, 1341-1353 (2005).</li><li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+for+Excluded+Volume+Interaction+between+an+Unfolded+Protein+and+Rigid+Macromolecular+Cosolutes:+Macromolecular+Crowding+and+Protein+Stability+Revisited.">Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).</li><li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linearization+of+the+bradford+protein+assay.">Linearization of the bradford protein assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (38), e1918 (2010).</li><li>Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+remodeling+by+MMPs+during+wound+repair.">Matrix remodeling by MMPs during wound repair.</a> Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).</li><li>Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+in+patients+with+different+types+of+scars+and+keloids.">Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids.</a> Journal of Plastic, Reconstructive &amp; Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).</li><li>Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Implications+of+the+IL-6+Signaling+Pathway+in+Keloid+Pathogenesis.">Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).</li><li>Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+scar+formation+by+vascular+endothelial+growth+factor.">Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor.</a> Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).</li><li>Rashid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+use+for+polyvinylpyrrolidone+as+a+macromolecular+crowder+for+enhanced+extracellular+matrix+deposition+and+cell+proliferation.">Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).</li><li>Lago, J. C., Puzzi, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+aging+in+primary+human+dermal+fibroblasts.">The effect of aging in primary human dermal fibroblasts.</a> PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).</li><li>Cigognini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding+meets+oxygen+tension+in+human+mesenchymal+stem+cell+culture+-+A+step+closer+to+physiologically+relevant+in+vitro+organogenesis.">Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture - A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis.</a> Scientific Reports. 6, 30746 (2016).</li><li>Cuttle, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porcine+deep+dermal+partial+thickness+burn+model+with+hypertrophic+scarring.">A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring.</a> Burns. 32 (7), 806-820 (2006).</li><li>Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+potential+of+Shikonin+as+a+novel+hypertrophic+scar+treatment.">Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment.</a> Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shikonin+reduces+TGF-beta1-induced+collagen+production+and+contraction+in+hypertrophic+scar-derived+human+skin+fibroblasts.">Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts.</a> International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).</li><li>Werner, S., Krieg, T., Smola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocyte-Fibroblast+Interactions+in+Wound+Healing.">Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).</li></ol>

Este protocolo tiene como objetivo optimizar y autenticar un modelo in vitro mejorado :scar-in-a-jar" para el tejido cicatricial cutáneo humano. Estudios anteriores han informado de la aplicación de la técnica MMC a los fibroblastos pulmonares humanos12, células madre mesenquimales de médula ósea humana23,y fibroblastos dérmicos humanos23 utilizando dextran12,Ficoll12y PVP23</su...

El tejido cicatricial representa la variable de reparación del tejido. Sin embargo, en muchos individuos, especialmente aquellos que sufren de quemaduras o trauma1, las cicatrices pueden ser excesivas e imponer efectos indeseables en la morfología y el funcionamiento de la piel curada. Aunque no se entienden completamente los mecanismos exactos de la formación patológica (cicatrices hipertróficas y queloides), la deposición excesiva de colágeno durante la cicatrización de heridas ha demostrado ser una contribución esencial2.
Está bien establecido que la transformación del factor de crecimiento beta 1 (TGF--1) y la actina muscular alfa suave (SMA) desempeñan un papel clave en la formación de cicatrices hipertróficas. La evidencia sugiere que el TGF-1 elevado estimula directamente la deposición excesiva de colágeno a través de la regulación de la vía de señalización SMAD3. Además, se ha encontrado que la ASMA contribuye a la formación de cicatrices hipertróficas mediante la regulación de la contracción celular y la reepitelización en el proceso de cicatrización de heridas4. La falta de modelos in vitro e in vivo adecuados es un impedimento importante para desarrollar y evaluar intervenciones y terapias para la remediación de cicatrices. El objetivo de este estudio es utilizar la técnica MMC existente para construir un modelo de cicatrices hipertróficas "in vivo-like" que sea adecuado para evaluar intervenciones novedosas y emergentes relacionadas con las cicatrices.
Reproducir tejido vivo fuera del cuerpo ha sido un objetivo durante años en la comunidad científica. El desarrollo de técnicas in vitro a principios del siglo XX logró en parte este objetivo. Las técnicas in vitro actuales han evolucionado ligeramente a partir de la demostración original de Roux de que las células embrionarias pueden sobrevivir ex vivo durante varios días en la salina caliente5. Sin embargo, las metodologías in vitro se limitan principalmente a los tipos de células simples cultivadas en 2-D y no recapitulan con precisión los tejidos in vivo. Si bien son útiles para examinar la bioquímica celular, la fisiología y la genética, los tejidos nativos son tridimensionales e incorporan múltiples tipos de células. Los sistemas in vitro 2D simples someten las células de mamíferos a entornos altamente artificiales en los que se pierde la arquitectura específica del tejido nativo6. A su vez, esto afecta a los eventos intracelulares y extracelulares, lo que resulta en morfología celular anormal, fisiología y comportamiento7.
El interés de este protocolo radica en el desarrollo y manejo clínico de cicatrices y queloides hipertróficos. Si bien está bien establecido que los fibroblastos dérmicos son en gran parte responsables de la abundante producción de colágenos presentes en el tejido cicatricial, el cultivo de fibroblastos dérmicos utilizando sistemas in vitro 2-D no reproduce la rotación de colágeno observada in vivo8. Los métodos in vitro contemporáneos todavía utilizan esencialmente "salina caliente", un ambiente completamente diferente al de los tejidos vivos. Los tejidos in vivo están extremadamente concurridos, con proteínas, ácidos nucleicos, ribonucleoproteínas y polisacáridos, ocupando entre el 5% y el 40% del volumen total. Como no hay dos moléculas pueden ocupar el mismo espacio al mismo tiempo, hay poco espacio libre disponible y una ausencia casi completa de agua libre9.
La técnica MMC impone restricciones que afectan a las propiedades termodinámicas del citosol y los fluidos intersticiales. Las interacciones moleculares, los complejos de señalización receptor-ligand, las enzimas y los orgánulos están confinados y restringidos a interactuar libremente9. Las interacciones dentro del entorno pericelular (es decir, intersticio) también están limitadas. La evidencia reciente confirma que las altas concentraciones de macromoléculas inertes en soluciones abarrotadas perturban la difusión, asociación física, viscosidad y propiedades hidrodinámicas10.
Curiosamente, varios agentes de aglomeración populares (es decir, Ficoll, dextran, polivinilpirrolidona [PVP] y sodio 4-estirenosulfonato [PSS]) no son equivalentes cuando se aplican a diferentes tipos de células y en diferentes configuraciones. En un estudio anterior, Se informó que Ficoll era menos citotóxico para las células madre mesenquimales en comparación con la PVP. Estos resultados fueron interpretados como la consecuencia de su carga neutra y el radio hidrodinámico relativamente pequeño11. Por el contrario, un segundo estudio encontró que el deextran es más eficaz en la estimulación de la deposición de colágeno I por fibroblastos pulmonares humanos en comparación con Ficoll12. Los datos de nuestro propio estudio sugieren que Ficoll mejora la deposición de colágeno por fibroblastos derivados de cicatrices hipertróficas, mientras que la PVP es tóxica para estas células13.
Se ha demostrado que la conversión de procolágeno a colágeno es más rápida en un ambiente in vivo altamente concurrido14,mientras que la tasa de reacciones biológicas se retrasa en un sistema de cultivo 2D diluido15. Hemos optimizado el protocolo in vitro aquí, incorporando MMC para mostrar el cultivo de fibroblastos dérmicos sirviendo como un modelo más "in vivo-como" para fibrosis dérmica y formación de cicatrices. En contraste con el sistema de cultivo 2D común, el cultivo de hHSFcon MMC estimula significativamente la biosíntesis y la deposición de colágeno13. En particular, otras características de la fibrosis (es decir, el aumento de la expresión de la matriz de metaloproteinasas [MMP] y citoquinas proinflamatorias) también son evidentes bajo este protocolo MMC optimizado13. Cuando se cultiva utilizando este método, se muestra que las células dérmicas recapitulan los parámetros fisiológicos, bioquímicos y funcionales medidos in vivo.
El protocolo MMC in vitro optimizado se ha utilizado para evaluar la expresión de colágeno y otras proteínas ECM por fibroblastos dérmicos aislados de la dermis de cicatrices hipertróficas y la dermis adyacente no implicada. Cuando se cultiva en entornos MMC in vitro, se ha observado que los hHSF expresan ciertas características (es decir, ARNm, bioquímica, fisiología y fenotipo) similares al tejido cicatricial hipertrófico dérmico in vivo. La evidencia indica que las propiedades físicas y químicas son consideraciones importantes a la hora de seleccionar crowders y optimizar las condiciones MMC para el cultivo in vitro.
Para la prueba de principio, el protocolo MMC se aplica aquí para evaluar cualitativa y cuantitativamente la capacidad de Shikonin y sus análogos para inducir la apoptosis. Esto permite evaluar las posibles aplicaciones de estos compuestos de medicina tradicional china (TCM) de origen natural para la gestión de cicatrices dérmicas13. No obstante, la simplicidad, la rentabilidad y la puntualidad de este protocolo MMC in vitro también satisfacen las regulaciones recientes para eliminar la experimentación en mamíferos por la Directiva 2010/63/UE y la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA) de la UE.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1337px;" width="1336">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">0.2 &#956;m filter</td>
			<td style="width:195px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">16534</td>
			<td style="width:537px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Alexa Fluor 680</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A-21076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Alexa Fluor 800</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A-11371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab5694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler )</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4351106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:195px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">#013-12061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">#A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Bradford protein assay</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen I primary antibody (for immunostaining)</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">6308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen I primary antibody (for western blot)</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab21286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen III primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab7778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen IV primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab6586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Direct Red 80</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>2610108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11996-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">6000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Ficoll 400</td>
			<td style="width:195px;">GE HealthCare</td>
			<td style="width:119px;">#17-0300-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Ficoll 70</td>
			<td style="width:195px;">GE HealthCare</td>
			<td style="width:119px;">#17-0310-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">GAPDH primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Goat Anti-Rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF)</td>
			<td style="width:195px;">Cell Research Corporation</td>
			<td style="width:119px;">106, 107, 108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">#1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-1 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab38929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-13 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab39012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-2 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab37150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-9 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab38898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">NanoDrop Microvolume Spectrophotometers</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">10484060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0321BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Odyssey blocking buffer</td>
			<td style="width:195px;">LI-COR Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">927&#8211;40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td style="width:195px;">LI-COR Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining)</td>
			<td style="width:195px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Penicillin/streptomycin solution (P/S)</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">PrimePCR Assays</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Protease inhibitor cocktail (PIC)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">PVP 360</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#PVP360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">PVP 40</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#PVP40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:195px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">#74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Sodium vanadate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">450022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Sodium vanadate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">SsoAdvanced universal SYBR green supermix</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">#172-5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Tween 20</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model of human cutaneous hypertrophic scarring using macromolecular crowding

Se ha demostrado que los tejidos in vivo están muy llenos de proteínas, ácidos nucleicos, ribonucleoproteínas, polisacáridos, etc. El siguiente protocolo aplica una técnica de aglomeración macromolecular (MMC) para imitar este hacinamiento fisiológico mediante la adición de polímeros neutros (crowders) a cultivos celulares in vitro. Estudios previos con Ficoll o dextran como crowders demuestran que la expresión de colágeno I y fibronectina en las líneas celulares WI38 y WS-1 se mejoran significativamente mediante la técnica MMC. Sin embargo, esta técnica no ha sido validada en fibroblastos primarios de piel humana derivados de cicatrices hipertróficas (hHSF). A medida que la cicatrización hipertrófica surge de la excesiva deposición de colágeno, este protocolo tiene como objetivo construir un modelo de cicatriz hipertrófica in vitro rico en colágeno mediante la aplicación de la técnica MMC con hHSFs. Se ha demostrado que este modelo MMC optimizado posee más similitudes con el tejido cicatricial in vivo en comparación con los sistemas tradicionales de cultivo celular de 2 dimensiones (2-D). Además, es rentable, eficiente en el tiempo y éticamente deseable en comparación con los modelos animales. Por lo tanto, el modelo optimizado reportado aquí ofrece un modelo avanzado "in vivo-como" para estudios hipertróficos relacionados con la cicatriz.

En cada experimento se realizaron muestras de triplicado, y cada experimento se repitió 3 veces utilizando células de tres pacientes individuales. Los datos se expresan como porcentajes del grupo de control. Se aplicaron la prueba post-hoc de ANOVA unidireccional y Tukey para analizar las diferencias estadísticas (*p . 0,05).
MMC utilizando Ficoll al 9% FVO (ocupación de volumen fraccionario) mejora la cantidad total de colágeno y colágeno I deposición en hHSF...

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In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

Este protocolo describe el uso de aglomeración macromolecular para crear un modelo de tejido cicatricial humano in vitro que se asemeja a condiciones in vivo. Cuando se cultivan en un ambiente macromolecular lleno de gente, los fibroblastos de la piel humana exhiben fenotipos, bioquímica, fisiología y características funcionales que se asemejan al tejido cicatricial.

Modelo In Vitro de Cicatrices Hipertróficas Cutáneas Humanas usando Crowding Macromolecular

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Creamos un modelo individual rico en colágeno para imitar el entorno que las células experimentan in vivo utilizando la técnica de aglomeración macromolecular. La piel es un ambiente lleno de gente, a diferencia del ambiente líquido que ya utilizamos para cultivar células in vitro. En comparación con el sistema tradicional de cultivo celular monocapa, este modelo recrea el ambiente molecular abarrotado que las células experimentan in vivo, especialmente en los tejidos cicatriciales donde abundante matriz extracelular desplaza el agua líquida.Además de las cicatrices hipertróficas, esta técnica de hacinamiento macromolecular se puede utilizar para estudios donde la matriz extracelular es abundante, como la fibrosis pulmonar. Cultivar fibroblastos normales y derivados de cicatrices de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Luego sembrarlas en 24 placas de pozo a 50.000 células por pozo en un mililitro de medio.Incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Prepare el hacinamiento macromolecular o los medios MMC mezclando Ficoll 70, Ficoll 400 y ácido ascórbico en 10%FCS DMEM. Incubar los medios en un baño de agua para dispersar a los hacinadores en la solución.A continuación, esterilizarlo con un filtro de 0,2 micrómetros. Aspirar los medios gastados de los fibroblastos y reemplazarlos por medios MMC recién hechos. Incubar las células a 37 grados centígrados durante seis días, cambiando los medios de MMC cada tres días.Preparar una solución Sirius Red disolviendo 0,2 gramos de polvo Direct Red 80 en 200 mililitros de agua desionizada destilada con un mililitro de ácido acético. Aspirar los medios MMC de las células y añadir 300 microlitros de la solución Sirius Red a cada pozo. Luego devuelva las células a la incubadora durante 90 minutos.Después de la incubación, enjuague suavemente la solución Sirius Red con agua del grifo y deje que la placa se seque al aire durante la noche. Al día siguiente, extraiga el Sirius Red añadiendo 200 microlitros de 0,1 molar de hidróxido de sodio en cada pozo y agitando la placa durante cinco a 10 minutos. Transfiera 100 microlitros de la mancha extraída a una placa transparente de 96 pozos y mida la absorbancia a 620 nanómetros con un lector de microplamas.Lave cada pozo con 200 microlitros de PBS y fije las células con metanol a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. A continuación, añadir 3%BSA a los pozos e incubar la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente. Aspirar la solución de bloqueo y añadir 200 microlitros de anti-colágeno un anticuerpo a cada pozo.Incubar el plato durante 90 minutos. A continuación, aspirar el anticuerpo y lavar los pozos tres veces con PBS durante cinco minutos por lavado. Añadir 200 microlitros de Goat Anti-Rabbit-FITC Secondary Anticuerpo y DAPI a cada pozo.Cubra la placa con papel de aluminio e incubarlo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Deseche el anticuerpo secundario y el DAPI y repita los lavados con PBS. A continuación, visualice la fluorescencia directamente bajo un microscopio.Después de lavar las células dos veces con PBS, agregue 40 microlitros de tampón de lysis en cada pozo y raspe la capa celular con una punta de pipeta. A continuación, transfiera el izado proteico a tubos de micro centrífuga para medir la concentración de proteínas. Cargue 10 microgramos de proteína en cada pozo de un gel proteico de cuatro a 12%Bis-Tris y realice SDS-PAGE a 200 voltios durante 30 minutos.Cuando haya terminado, transfiera la proteína a una membrana de nitrocelulosa ejecutando una mancha occidental a 90 voltios durante 90 minutos, teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas entre el gel y la membrana. Bloquee la membrana con 10 mililitros de tampón de bloqueo. Luego incubarlo con anticuerpos primarios a cuatro grados centígrados durante la noche.Al día siguiente, lave la membrana cinco veces con 0.1 por ciento de TBS Tween 20 durante cinco minutos por lavado. A continuación, incubar la membrana con un anticuerpo secundario apropiado para la especie durante una hora a temperatura ambiente. Repita los lavados y visualice la fluorescencia con un sistema de imágenes.Después de purificar el ARN total con un kit comercial de extracción de ARN, mida la concentración de ARN utilizando un espectrofotómetro de micro volumen. A continuación, utilice un kit de síntesis de ADNc para realizar una síntesis de ADN de primera hebra. Mezcle el ADNc con 10 microlitros de SYBR Green Supermix y transfiera las muestras a una placa personalizada de 96 pozos pre-recubierta con imprimadores de oligonucleótidos.Ajuste el volumen total a 20 microlitros por pozo con agua y ejecute RT-PCR de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. La densidad celular de los fibroblastos de piel humana derivados de cicatrices hipertróficas aumentó significativamente después del cultivo con Ficoll en comparación con el uso de PVP o el control. El hacinamiento macromolecular con Ficoll a una ocupación de volumen de 9% fraccionado mejoró significativamente la deposición de colágeno, incluido el colágeno, en comparación con otras formulaciones.Esto se demostró aún más con el análisis cuantitativo. Se encontró fibroblastos derivados de cicatrices y fibroblastos dérmicos normales cultivados en ambientes de MMC para regular la expresión de especies de ECM además de colágeno. En particular, se encontró que una expresión elevada de metaloproteinasas de matriz o MMP se acumulaba en tejidos cicatriciales hipertróficos en comparación con los tejidos nativos.Se observó que la expresión de MMP2, nueve y 13 estaba significativamente regulada en ambos cultivos celulares cultivados en condiciones de hacinamiento macromolecular. Los MMP desempeñan un papel importante durante la cicatrización de heridas y la formación de cicatrices, regulando el montaje y la remodelación de ECM. La síntesis de interleucina seis y el factor de crecimiento endotelial vascular era indetectable en una mancha occidental.Pero el análisis de RT-PCR reveló que la expresión de la interleucina seis estaba significativamente regulada hacia arriba, mientras que la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular estaba regulada hacia abajo en fibroblastos cultivados en condiciones de MMC. Al intentar este protocolo, es muy importante elegir fibroblastos dérmicos que tengan muy pocos patógenos de CO. También tenemos que tener en cuenta que el ácido ascórbico es un ingrediente esencial en el medio MMC.Estamos particularmente interesados en detectar aún más la deposición y alineación del colágeno en este modelo MMC. Planeamos utilizar técnicas microscópicas avanzadas para comparar este modelo in vitro con los tejidos cicatriciales nativos in vivo. Animamos a otros a utilizar esta técnica de hacinamiento macromolecular para mejorar la autenticidad in vitro de los tejidos modales auxiliares.Por supuesto, el hacinamiento macromolecular también se puede utilizar para recalcular modelos de enfermedad y patología in vitro.

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