Name: in vitro model of human cutaneous hypertrophic scarring using macromolecular crowding
Uploaded: 2020-05-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding at JoVE.com

Detta arbete stöddes av finansiering från Singapores Agency for Science, Technology and Research "SPF 2013/004: Skin Biology Basic Research" och "Wound Care Innovation for the Tropics" IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Författarna erkänner tacksamt råd och hjälp från Dr Paula Benny och Dr Michael Raghunath.

1. Cellkultur
<ol><li>Underhåll hHSFs och normala dermal fibroblaster som härrör från icke-patologisk vävnad (hNSFs) i Dulbecco modifierade Eagle's medium (DMEM) som innehåller 10% fetala kalv serum (FCS) och 1% v/v penicillin/streptomycin lösning (P / S) vid 37 ° C i en inkubator med 5% CO2/95% luft.</li>
	<li>Köp Ficoll 70, Ficoll 400 och askorbinsyra från lämpliga företag.</li>
</ol>2. Konstruktion av MMC hypertrofisk ärr modell
<ol><li>Sådd hHSFs eller hNSFs (50.00...

<ol>
	<li>vander Veer, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+cellular+and+molecular+causes+of+hypertrophic+scar+formation.">Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation.</a> Burns. 35 (1), 15-29 (2009).</li><li>Linge, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+Scar+Cells+Fail+to+Undergo+a+Form+of+Apoptosis+Specific+to+Contractile+Collagen[mdash]The+Role+of+Tissue+Transglutaminase.">Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).</li><li>Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+TGF-beta+family+in+wound+healing,+burns+and+scarring:+a+review.">The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review.</a> International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).</li><li>Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+correlation+of+in+vivo+burn+scar+contraction+with+the+level+of+alpha-smooth+muscle+actin+expression.">The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression.</a> Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).</li><li>Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle-depleted+fetal+bovine+and+human+sera+have+reduced+capacity+to+support+cell+growth.">Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373 (2015).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Kapalczynska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures.">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).</li><li>Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+enhancement+of+collagen+matrix+formation+and+crosslinking+for+applications+in+tissue+engineering:+a+preliminary+study.">In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study.</a> Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).</li><li>Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+macromolecular+crowding+can+do+to+a+protein.">What macromolecular crowding can do to a protein.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).</li><li>Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+macromolecular+crowding+to+enhance+extracellular+matrix+deposition+and+its+remodeling+in+vitro+for+tissue+engineering+and+cell-based+therapies.">Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).</li><li>Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+Crowding+Directs+Extracellular+Matrix+Organization+and+Mesenchymal+Stem+Cell+Behavior.">Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior.</a> PloS one. 7 (5), 37904 (2012).</li><li>Chen, C. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Scar-in-a-Jar:+studying+potential+antifibrotic+compounds+from+the+epigenetic+to+extracellular+level+in+a+single+well.">The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well.</a> British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+"macromolecular+crowding"+in+vitro+to+investigate+the+naphthoquinones+shikonin,+naphthazarin+and+related+analogues+for+the+treatment+of+dermal+scars.">Application of "macromolecular crowding" in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars.</a> Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).</li><li>Canty, E. G., Kadler, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procollagen+trafficking,+processing+and+fibrillogenesis.">Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis.</a> Journal of Cell Science. 118, 1341-1353 (2005).</li><li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+for+Excluded+Volume+Interaction+between+an+Unfolded+Protein+and+Rigid+Macromolecular+Cosolutes:+Macromolecular+Crowding+and+Protein+Stability+Revisited.">Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).</li><li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linearization+of+the+bradford+protein+assay.">Linearization of the bradford protein assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (38), e1918 (2010).</li><li>Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+RNeasy+Mini+Kit+to+obtain+high-quality+total+RNA+from+sessile+cells+of+Staphylococcus+aureus.">Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus.</a> Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).</li><li>Xue, M., Jackson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Matrix+Reorganization+During+Wound+Healing+and+Its+Impact+on+Abnormal+Scarring.">Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring.</a> Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).</li><li>Rohani, M. G., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+remodeling+by+MMPs+during+wound+repair.">Matrix remodeling by MMPs during wound repair.</a> Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).</li><li>Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+in+patients+with+different+types+of+scars+and+keloids.">Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids.</a> Journal of Plastic, Reconstructive &amp; Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).</li><li>Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Implications+of+the+IL-6+Signaling+Pathway+in+Keloid+Pathogenesis.">Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).</li><li>Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+scar+formation+by+vascular+endothelial+growth+factor.">Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor.</a> Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).</li><li>Rashid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+use+for+polyvinylpyrrolidone+as+a+macromolecular+crowder+for+enhanced+extracellular+matrix+deposition+and+cell+proliferation.">Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).</li><li>Lago, J. C., Puzzi, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+aging+in+primary+human+dermal+fibroblasts.">The effect of aging in primary human dermal fibroblasts.</a> PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).</li><li>Cigognini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding+meets+oxygen+tension+in+human+mesenchymal+stem+cell+culture+-+A+step+closer+to+physiologically+relevant+in+vitro+organogenesis.">Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture - A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis.</a> Scientific Reports. 6, 30746 (2016).</li><li>Cuttle, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porcine+deep+dermal+partial+thickness+burn+model+with+hypertrophic+scarring.">A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring.</a> Burns. 32 (7), 806-820 (2006).</li><li>Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+potential+of+Shikonin+as+a+novel+hypertrophic+scar+treatment.">Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment.</a> Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shikonin+reduces+TGF-beta1-induced+collagen+production+and+contraction+in+hypertrophic+scar-derived+human+skin+fibroblasts.">Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts.</a> International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).</li><li>Werner, S., Krieg, T., Smola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocyte-Fibroblast+Interactions+in+Wound+Healing.">Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).</li></ol>

Detta protokoll syftar till att optimera och autentisera en förbättrad : ärr-in-a-jar "in vitro-modell för mänskliga testning ärrvävnad. Tidigare studier har rapporterat tillämpningen av MMC teknik till mänskliga lungfibroblaster12, mänskliga benmärg mesenkymala stamceller23, och mänskliga dermal fibroblaster23 med dextran12, Ficoll12, och PVP23 som crowders. I studie...

Ärrvävnad representerar slutpunkten för vävnadsreparation. Men hos många individer, särskilt de som lider av brännskador eller trauma1, ärrbildning kan vara överdriven och införa oönskade effekter på morfologi och funktion av läkt hud. Även om de exakta mekanismerna för patologiska (hypertrofiska ärr och keloider) ärrbildning inte är helt klarlagda, har överdriven nedfall av kollagen under sårläkning visat sig vara ett viktigt bidrag2.
Det är väletablerat att transformera tillväxtfaktor beta 1 (TGF-β1) och alfa glatt muskulatur aktin (αSMA) spelar nyckelroller i bildandet av hypertrofiska ärr. Bevis tyder på att förhöjd TGF-β1 direkt stimulerar överdriven nedfall av kollagen via reglering av SMAD signalering väg3. Dessutom har αSMA visat sig bidra till hypertrofisk ärrbildning genom att reglera cellkontraktion och reepithelialization i sårläkningsprocessen4. Bristen på lämpliga in vitro- och in vivo-modeller är ett stort hinder för att utveckla och utvärdera interventioner och terapier för ärrsanering. Syftet med denna studie är att utnyttja den befintliga MMC-tekniken för att konstruera en "in vivo-liknande" hypertrofisk ärrmodell som är lämplig för att utvärdera nya och framväxande ärrrelaterade interventioner.
Reproducera levande vävnad utanför kroppen har varit ett mål i flera år i det vetenskapliga samfundet. Utvecklingen av in vitro-tekniker i början av nittonhundratalet delvis uppnått detta mål. Nuvarande in vitro-tekniker har utvecklats något från Roux ursprungliga demonstration att embryonala celler kan överleva ex vivo i flera dagar i varm saltlösning5. In vitro-metoder är dock oftast begränsade till encelliga typer som odlas i 2D och inte korrekt rekapitulerar vävnader in vivo. Även användbart för att undersöka cell biokemi, fysiologi och genetik, inhemska vävnader är 3-D och införliva flera celltyper. Enkla 2D in vitro-system utsätter däggdjursceller för mycket artificiella miljöer där infödd vävnadsspecifik arkitektur går förlorad6. Detta påverkar i sin tur intracellulära och extracellulära händelser, vilket resulterar i onormal cellmorfologi, fysiologi och beteende7.
Intresset bakom detta protokoll ligger i utveckling och klinisk förvaltning av hypertrofisk ärr och keloider. Även om det är väletablerat att dermala fibroblaster är till stor del ansvarig för den rikliga produktionen av kollagen som finns i ärrvävnad, odla dermal fibroblaster med hjälp av 2-D in vitro-system misslyckas med att reproducera omsättningen av kollagen observeras in vivo8. Samtida in vitro-metoder fortfarande i huvudsak använder "varm saltlösning", en miljö helt annorlunda än i levande vävnader. Vävnader in vivo är extremt trångt, med proteiner, nukleinsyror, ribonukleoproteiner och polysackarider, upptar 5%-40% av den totala volymen. Eftersom inga två molekyler kan uppta samma utrymme samtidigt, det finns lite ledigt utrymme och en nästan fullständig avsaknad av fritt vatten9.
MMC-tekniken medför begränsningar som påverkar cytosolens och interstitella vätskors termodynamiska egenskaper. Molekylära interaktioner, receptor-ligand signalering komplex, enzymer och organeller är begränsade och begränsas från att interagera fritt9. Interaktioner inom den pericellulära miljön (dvs. interstitium) är också begränsade. Nya rön bekräftar att höga koncentrationer av inert makromolekyler i trånga lösningar störande diffusion, fysisk associering, viskositet och hydrodynamiska egenskaper10.
Intressant nog är flera populära trängselmedel (dvs. Ficoll, dextran, polyvinylpyrrolidon [PVP] och natrium 4-styret [PSS]) inte likvärdiga när de tillämpas på olika celltyper och i olika inställningar. I en tidigare studie, Ficoll rapporterades vara mindre cytotoxiska för mesenkymala stamceller jämfört med PVP. Dessa resultat tolkades som en följd av dess neutrala laddning och relativt liten hydrodynamisk radie11. Däremot fann en andra studie att dextran är mer effektivt för att stimulera kollagen jag nedfall av mänskliga lungfibroblaster jämfört med Ficoll12. Data från vår egen studie tyder på att Ficoll förbättrar kollagen nedfall av hypertrofisk ärr-härledda fibroblaster, medan PVP är giftigt för dessa celler13.
Det har visat sig att omvandlingen av procollagen till kollagen är snabbare i en mycket trångt in vivo miljö14, medan graden av biologiska reaktioner försenas i en utspädd 2D kultur system15. Vi har optimerat in vitro-protokollet här, som innehåller MMC för att visa odling av dermala fibroblaster som fungerar som en mer "in vivo-liknande" modell för dermal fibros och ärrbildning. I motsats till den gemensamma 2D-odlingssystem, odla hHSFs med MMC stimulerar biosyntesen och nedfall av kollagen betydligt13. Särskilt andra egenskaper hos fibros (dvs. ökat uttryck för matrismetalloproteinaser [MMPs] och proinflammatoriska cytokiner) är också uppenbara enligt detta optimerade MMC-protokoll13. När odlas med denna metod, det visas att dermal celler rekapitulera fysiologiska, biokemiska och funktionella parametrar mätt in vivo.
Den optimerade MMC in vitro-protokollet har använts för att utvärdera uttrycket av kollagen och andra ECM-proteiner genom dermal fibroblaster isolerade från hypertrofisk ärr dermis och oengagerade intilliggande dermis. När odlas i MMC miljöer in vitro, har det observerats att hHSFs uttrycka vissa egenskaper (dvs. mRNA, biokemi, fysiologi och fenotyp) liknar dermal hypertrofisk ärrvävnad in vivo. Bevisen tyder på att fysiska och kemiska egenskaper är viktiga överväganden när man väljer crowders och optimera MMC villkor för odling in vitro.
För proof-of-princip, mmc-protokollet tillämpas här för att kvalitativt och kvantitativt utvärdera förmåga Shikonin och dess analoger att inducera apoptos. Detta gör det möjligt att utvärdera de potentiella tillämpningarna av dessa naturligt härledda traditionell kinesisk medicin (TCM) föreningar för hantering av dermal ärrbildning13. Trots detta mmc-protokolls enkelhet, kostnadseffektivitet och aktualitet uppfyller detta IN VITRO MMC-protokoll också de senaste bestämmelserna för att eliminera försök på däggdjur genom EU-direktiv 2010/63/EU och U.S. Environmental Protection Agency (EPA).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1337px;" width="1336">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">0.2 &#956;m filter</td>
			<td style="width:195px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">16534</td>
			<td style="width:537px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Alexa Fluor 680</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A-21076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Alexa Fluor 800</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A-11371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab5694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler )</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4351106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:195px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">#013-12061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">#A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Bradford protein assay</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen I primary antibody (for immunostaining)</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">6308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen I primary antibody (for western blot)</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab21286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen III primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab7778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen IV primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab6586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Direct Red 80</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>2610108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11996-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">6000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Ficoll 400</td>
			<td style="width:195px;">GE HealthCare</td>
			<td style="width:119px;">#17-0300-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Ficoll 70</td>
			<td style="width:195px;">GE HealthCare</td>
			<td style="width:119px;">#17-0310-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">GAPDH primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Goat Anti-Rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF)</td>
			<td style="width:195px;">Cell Research Corporation</td>
			<td style="width:119px;">106, 107, 108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">#1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-1 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab38929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-13 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab39012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-2 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab37150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MMP-9 primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab38898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">NanoDrop Microvolume Spectrophotometers</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">10484060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0321BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Odyssey blocking buffer</td>
			<td style="width:195px;">LI-COR Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">927&#8211;40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td style="width:195px;">LI-COR Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining)</td>
			<td style="width:195px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Penicillin/streptomycin solution (P/S)</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">PrimePCR Assays</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Protease inhibitor cocktail (PIC)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">PVP 360</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#PVP360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">PVP 40</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#PVP40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:195px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">#74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Sodium vanadate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">450022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Sodium vanadate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">SsoAdvanced universal SYBR green supermix</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">#172-5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Tween 20</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model of human cutaneous hypertrophic scarring using macromolecular crowding

Det har visat sig att in vivo vävnader är mycket trångt av proteiner, nukleinsyror, ribonukleoproteiner, polysackarider, etc. Följande protokoll tillämpar en makromolekylär trängsel (MMC) teknik för att efterlikna denna fysiologiska trängsel genom tillägg av neutrala polymerer (crowders) till cellkulturer in vitro. Tidigare studier med Ficoll eller dextran som crowders visar att uttrycket av kollagen I och fibronectin i WI38 och WS-1 cellinjer förbättras avsevärt med hjälp av MMC-tekniken. Denna teknik har dock inte validerats i primära hypertrofisk ärr-härledda mänskliga huden fibroblaster (hHSFs). Som hypertrofisk ärrbildning uppstår från överdriven nedfall av kollagen, syftar detta protokoll till att konstruera en kollagen-rik in vitro hypertrofisk ärr modell genom att tillämpa MMC tekniken med hHSFs. Denna optimerade MMC-modell har visat sig ha fler likheter med in vivo ärrvävnad jämfört med traditionella 2-dimensionella (2D) cellodlingssystem. Dessutom är det kostnadseffektivt, tidseffektivt och etiskt önskvärt jämfört med djurmodeller. Därför erbjuder den optimerade modellen som rapporteras här en avancerad "in vivo-liknande" modell för hypertrofisk ärrrelaterade studier.

Triplicate prover utfördes i varje experiment, och varje experiment upprepades 3x med hjälp av celler från tre enskilda patienter. Uppgifterna uttrycks i procent av kontrollgruppen. Enkelriktad ANOVA och Tukeys post-hoc-test tillämpades för att analysera statistiska skillnader (*p ≥ 0,05).
MMC använder Ficoll på 9% FVO (fraktionerad volym beläggning) ökar den totala mängden kollagen och kollagen jag nedfall i hHSF13. Som framgår av <strong class="x...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding at JoVE.com

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

Detta protokoll beskriver användningen av makromolekylära trängsel för att skapa en in vitro mänskliga hypertrofisk ärr vävnad modell som liknar in vivo villkor. När odlas i en fullsatt makromolekylär miljö, mänskliga huden fibroblaster uppvisar fenotyper, biokemi, fysiologi och funktionella egenskaper som liknar ärrvävnad.

In Vitro-modell av humant kutan hypertrofisk ärrbildning med makromolekylär trängsel

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Vi skapade en individuell kollagen-rik modell för att efterlikna den miljö som celler upplever in vivo med hjälp av makromolekylära trängselteknik. Hud är en trång miljö, till skillnad från den flytande miljö som vi redan använder för att odla celler in vitro. Jämfört med det traditionella monolayer cellodlingssystemet återskapar denna modell den trånga molekylära miljö som celler upplever in vivo, särskilt i ärrvävnader där riklig extracellulär matris tränger undan flytande vatten.Förutom hypertrofiska ärr, denna makromolekylära trängselteknik kan användas för studier där den extracellulära matrisen är riklig, såsom lungfibros. Odla ärr-härledda och normala fibroblaster enligt manuskriptet riktningar. Sedan utsäde dem i 24 brunnsplattor vid 50, 000 celler per brunn i en milliliter medium.Inkubera plattan över natten vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid. Förbered makromolekylär trängsel eller MMC-media genom att blanda Ficoll 70, Ficoll 400 och askorbinsyra till 10%FCS DMEM. Inkubera media i ett vattenbad för att skingra crowders i lösningen.Sterilisera den sedan med ett 0,2 mikrometerfilter. Aspirera de förbrukade medierna från fibroblaster och ersätta den med nygjord MMC media. Inkubera cellerna vid 37 grader Celsius i sex dagar, ändra MMC media var tredje dag.Förbered en Sirius Red-lösning genom att lösa upp 0,2 gram Direct Red 80 pulver i 200 milliliter destillerat deioniserat vatten med en milliliter av ättiksyra. Aspirera MMC-media från cellerna och tillsätt 300 mikroliter av Sirius Red lösning till varje brunn. Sedan tillbaka cellerna till inkubatorn i 90 minuter.Efter inkubationen sköljer du försiktigt siriusröd lösning med kranvatten och låter plattan lufttorka över natten. Nästa dag, extrahera Sirius Red genom att lägga till 200 mikroliter av 0,1 molar natriumhydroxid i varje brunn och skaka plattan i fem till 10 minuter. Överför 100 mikroliter av den extraherade fläcken till en genomskinlig 96 brunnsplatta och mät absorbansen vid 620 nanometer med en mikroplåtsläsare.Tvätta varje brunn med 200 mikroliter PBS och fixera cellerna med metanol vid fyra grader Celsius i 10 minuter. Tillsätt sedan 3%BSA till brunnarna och inkubera plattan i 30 minuter vid rumstemperatur. Aspirera den blockerande lösningen och tillsätt 200 mikroliter av anti-kollagen en antikropp till varje brunn.Inkubera plattan i 90 minuter. Därefter aspirera antikroppen Och tvätta brunnarna tre gånger med PBS i fem minuter per tvätt. Lägg till 200 mikroliter av Get Anti-Rabbit-FITC Sekundär Antibody och DAPI till varje brunn.Täck plattan med aluminiumfolie och inkubera den i 30 minuter vid rumstemperatur. Kassera sekundärantikroppen och DAPI och upprepa tvättarna med PBS. Visualisera sedan fluorescensen direkt under ett mikroskop.Efter tvättning av cellerna två gånger med PBS, tillsätt 40 mikroliter av lysbuffert i varje brunn och skrapa cellskiktet med en pipettspets. Överför sedan proteinet lysate i mikro centrifugrör för att mäta proteinkoncentrationen. Ladda 10 mikrogram protein i varje brunn av en fyra till 12%Bis-Tris protein gel och utföra SDS-PAGE på 200 volt i 30 minuter.När du är klar, överför proteinet till ett nitrocellulosamembran genom att köra en västerländsk blot på 90 volt i 90 minuter, var noga med att undvika bubbla bildas mellan gelen och membranet. Blockera membranet med 10 milliliter blockerande buffert. Sedan inkubera den med primära antikroppar vid fyra grader Celsius över natten.Nästa dag tvättar du membranet fem gånger med 0,1 procent TBS Tween 20 i fem minuter per tvätt. Därefter inkubera membranet med en art-lämplig sekundär antikropp under en timme vid rumstemperatur. Upprepa tvättarna och visualisera fluorescens med ett bildsystem.Efter att ha renats det totala RNA med en kommersiell RNA-extraktionssats, mät RNA-koncentration med hjälp av en mikrovolymspektrofotometer. Använd sedan en cDNA-synteskit för att utföra en första sträng-DNA-syntes. Blanda cDNA med 10 mikroliter av SYBR Green Supermix och överför proverna till en anpassad 96 brunnsplatta förbelagd med oligonukleotidprimers.Justera den totala volymen till 20 mikroliter per brunn med vatten och kör RT-PCR enligt manuskriptriktningar. Celldensitet av hypertrofiska ärr-härledda mänskliga huden fibroblaster betydligt ökat efter odling med Ficoll jämfört med att använda PVP eller kontrollen. Makromolekylära trängsel med Ficoll på 9%fractional volym beläggning avsevärt förbättrat nedfallet av kollagen, inklusive kollagen en, jämfört med andra formuleringar.Detta visades ytterligare med kvantitativ analys. Ärr-härledda fibroblaster och normala dermal fibroblaster odlas i MMC miljöer konstaterades att reglera uttryck för ECM arter utöver kollagen. Noterbart, en förhöjd uttryck för matris metalloproteinaser eller MMPs befanns ackumuleras i hypertrofiska ärr vävnader jämfört med inhemska vävnader.Det observerades att uttrycket av MMP2, nio och 13 var betydligt upp-reglerad i båda cellkulturer odlas i makromolekylära trängselförhållanden. MSP spelar en viktig roll under sårläkning och ärrbildning, reglera ECM montering och ombyggnad. Syntes av interleukin sex och Vaskulär endotel tillväxtfaktor var omöjlig att upptäcka i en västerländsk blot.Men RT-PCR analys visade att uttrycket av interleukin sex var betydligt upp-reglerad, medan uttryck för vaskulär endotel tillväxtfaktor var ned-reglerad i fibroblaster odlas i MMC villkor. När du försöker detta protokoll, Är det mycket viktigt att välja dermal fibroblaster som har mycket få CO patogener. Vi måste också komma ihåg att askorbinsyra är en viktig ingrediens i MMC-mediet.Vi är särskilt intresserade av att ytterligare upptäcka kollagen nedfall och anpassning i denna MMC modell. Vi planerar att använda avancerade mikroskopiska tekniker för att jämföra denna in vitro-modell med inhemska ärrvävnader in vivo. Vi uppmuntrar andra att använda denna makromolekylära crowding teknik för att förbättra in vitro äktheten av de tillhörande modal vävnader.Naturligtvis kan makromolekylära trängsel också användas för att räkna om modeller av sjukdom och patologi in vitro.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Visualisera proteiner och Makromolekylär av negativa Stain EM: från Grid förberedelse till Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Anatomiska Rekonstruktioner av Human Cardiac vensystemet med Contrast-datortomografi av Perfusion-fasta prover

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell Co-kultur mönstring med användning av vattenhaltiga tvåfassystem

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering av en Human 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Tumör Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Cellodling in vitro modell för Toxic Inhalerat Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produktion, karakterisering och potentiella användningsområdena för en 3D vävnadstekniska Human Esophageal Mucosal Modell

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Ögonirritationstest (EIT) för Hazard Identifiering av Eye irriterande kemikalier med hjälp av rekonstruerad Human Cornea liknande Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Förbättra 2D och 3D Skin<em&gt; In Vitro</em&gt; Modeller Använda Macro Trängsel

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikroflödes Flow Chambers Använda Beredd blod till modell Hemostas och trombocyttransfusion<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Kultur Modell av murina mellankotskivan

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...