Name: production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells
Uploaded: 2020-04-16T13:00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production and Characterization of Human Macrophages from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Vi takker Fiona Rossi og Claire Cryer for hjælp med flow cytometri, Eoghan O'Duibhir og Bertrand Vernay med mikroskopi. Dette arbejde blev finansieret af CONACYT (M.L.-Y.), Wellcome Trust (102610) og Innovate UK (L.M.F), Wellcome Trust PhD studentship (A.M.), MRC Precision Medicine Studentship (T.V). L.C. og J.W.P. blev støttet af Wellcome Trust (101067/Z/13/Z), Medical Research Council (MR/N022556/1) og COST Action BM1404 Mye-EUNITER (http://www.mye-euniter.eu).

BEMÆRK: Alle reagenser og alt udstyr, der anvendes i denne protokol, er angivet i Materialetabel. Mediet skal være ved 37 °C for cellekultur. Medier og reagenser, der anvendes i differentieringsprotokollen, skal være sterile.
1. Human iPSC Line Optøning og vedligeholdelse
<ol><li>
Forbered cellevedligeholdelse medium, vækstfaktorer, og andre reagenser.
	<ol>
<li>Forbered hESC-serum frie medier (hESC-SFM; se Materialetabel) ved at supplere Dulbeccos modificerede Eagle medium-F12 (DMEM/F12) med hESC supplement, 1,8% w/v kvæg serum albumin (BSA) og 0,1 mM 2-mercaptoethanol.</li>
		<li>Der fremstilles en bestandsopløsning af grundlæggende fibroblast (bFGF) (10 μg/ml) ved at opløse bFGF i en steril 0,1% humant serum albumin (HSA)-phosphatbufferet saltvandsopløsning (PBS). Stamopløsningen fordeles som 200 μL aliquots i kryorør. Stamopløsninger kan opbevares ved -20 °C op til 1 år. Når optøet, lager bFGF kan opbevares ved 4 °C i 7 dage.</li>
		<li>Forbered Rho kinase hæmmer (ROCK Inhibitor)-Y27632 stamopløsning (1 mg/ml) ved at opløse det i sterilt vand. Stamopløsningen fordeles som 50 μL aliquots i kryorør. Stamopløsninger kan opbevares ved -20 °C op til 1 år. Når rockhæmmeren er optøet, kan den opbevares ved 4 °C i 7 dage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fortyndet stamcellesubstrat (se Materialetabel) 1:50 i Dulbeccos fosfatbufferessaltvand med calcium og magnesium.</li>
	<li>Den fortyndede stamcellesubstratopløsning anbringes på dyrkningspladerne, så det endelige volumen pr. overfladeareal er 78 μL/cm2. Til coat brønden af en 6 brønd plade, tilsættes 750 μL opløsning.</li>
	<li>Inkuber den belagte plade i 1 time i en humificeret atmosfære ved 37 °C og 5 % CO2.</li>
	<li>Aspirerer stamcellesubstratbelægningen og tilsættes 1 ml hESC suppleret med 20 ng/ml bFGF og 10 μM ROCK Hæmmer.</li>
	<li>At tø et hætteglas med frosne humane iPSC-celler op, skal hætteglasset inkuberes ved 37 °C, indtil det er optøet, og cellerne overføres til 5 ml hESC-SFM-medier.</li>
	<li>Cellerne centrifugeres ved 100 x g i 3 min.</li>
	<li>Resuspender i 0,5 ml hESC-SFM suppleret med 20 ng/mL bFGF og 10 μM ROCK hæmmer. Overfør celler til den belagte brønd.</li>
	<li>Kulturceller i 24 timer.</li>
	<li>Skift medier til hESC-SFM suppleret med 20 ng/mL bFGF, men uden ROCK-hæmmer.</li>
	<li>For at bevare cellerne skal du skifte mediet hver dag, indtil cellerne når 80% sammenløbet. Udifferentierede iPSCs tager normalt 3-4 dage at nå 80% sammenløb.</li>
	<li>
Når cellerne har nået 80% sammenløb, passage celler.
	<ol>
<li>Erstat brugt kulturmedium med 1,5 ml frisk hESC-SFM suppleret med 20 ng/mL bFGF (uden ROCK-hæmmer).</li>
		<li>Hold dyrkningsbeholderen i den ene hånd, og rul et engangscellepassagingværktøj (se Materialetabel)hen over pladen i én retning (dvs. fra venstre mod højre). Alle knive i rullen skal berøre pladen. Hold ensartet tryk under rulning.</li>
		<li>Gentag rullende i samme retning, indtil hele brønden er blevet dækket.</li>
		<li>Kulturbeholderen roteres 90° og rulles igen som beskrevet i trin 1.12.2 og 1.12.3.</li>
		<li>Kassér passaging-værktøjet efter brug.</li>
		<li>Med en steril pipette, bruge medier i brønden til at løsne skåret kolonier.</li>
		<li>Celler overføres til et 1:4-forhold på præbestionerede stamcellesubstratbrønde (trin 1.2-1.5) til en endelig medievolumen (hESC -SFM suppleret med 20 ng/mL bFGF) på 1,5 ml pr. brønd.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Human iPSC Line Frysning
<ol><li>For at fryse iPSC-celler skal mediet af en 70%-80% sammenflydende brønd af en 6 brøndplade med hESC-SFM suppleret med 20 ng/mL bFGF og 10 μM ROCK Inhibitor.</li>
	<li>Inkuber godt ved 37 °C og 5% CO2 i 1 time.</li>
	<li>Skær kolonier med celle passerer værktøj og placere forskubbet kolonier i en centrifuge rør.</li>
	<li>Cellerne centrifugeres ved 100 x g i 3 min.</li>
	<li>Aspirere mediet og resuspender cellerne i 1 ml af cellekryopræserveringsmedier (se Materialetabel).</li>
	<li>Cellerne opdeles ligeligt i to kryovider, og anbring dem i en prækølet cellekryopræserveringsbeholder ved 4 °C.</li>
	<li>Cellerne opbevares ved -80 °C i 24-48 timer.</li>
	<li>Hætteglas overføres til enten en -135 °C fryser eller til en flydende nitrogentank.</li>
</ol>3. Human iPSC Differentiering til makrofager
BEMÆRK: Et skematisk resumé af makrofagdifferentieringsprotokollen er afbildet i figur 1.
<ol><li>Forberedelse af vækstfaktorer for celledifferentiering og andre reagenser
	<ol>
<li>Forbered hESC-SFM-medier (se forrige afsnit).</li>
		<li>0,1% w/v opløsning af porcine gelatine fremstilles ved at opløse gelatinen i sterilt vand. Gelatineopløsning kan opbevares ved 4 °C i op til 2 år.</li>
		<li>Der fremstilles en human BMP4-stamopløsning (25 μg/ml) ved at opløse BMP4 i en 4 mM hydrogenchlorid (HCl)-0,2% BSA PBS-opløsning. Stamopløsningen fordeles som 50 μL aliquots i kryorør. Stamopløsninger kan opbevares ved -20 °C op til 1 år. Når bmp4 er optøet, kan det opbevares ved 4 °C i 5 dage.</li>
		<li>Der fremstilles human VEGF-stamopløsning (100 μg/ml) ved at opløse VEGF i en 0,2% BSA PBS-opløsning. Stamopløsningen fordeles som 10 μL aliquots i kryorør. Stamopløsninger kan opbevares ved -20 °C op til 1 år. Når vegf er optøet, kan det opbevares ved 4 °C i 7 dage.</li>
		<li>Der fremstilles human SCF-stamopløsning (100 μg/ml) ved at opløse SCF i en 0,2% BSA PBS-opløsning. Stamopløsningen fordeles som 5 μL aliquots i kryorør. Stamopløsninger kan opbevares ved -20 °C op til 1 år. Når scennen er optøet, kan scf opbevares ved 4 °C i 10 dage.</li>
		<li>Der fremstilles human IL3-stamopløsning (10 μg/ml) ved at opløse IL3 i en 0,2% BSA PBS-opløsning. Stamopløsningen fordeles som 500 μL aliquots i kryorør. Stamopløsninger kan opbevares ved -20 °C op til 2 år. Når scf'en er optøet, kan det opbevares ved 4 °C i 15 dage.</li>
		<li>Der fremstilles en human CSF1-stamopløsning (10 μg/ml) ved at opløse CSF1 i en 0,2% BSA PBS-opløsning. Fordel stamopløsningen som 1 ml aliquots i kryorør. Stamopløsninger kan opbevares ved -20 °C op til 2 år. Når scf'en er optøet, kan det opbevares ved 4 °C i 15 dage.</li>
		<li>Der fremstilles separate 10 μg/ml-stamopløsninger af interferon-gamma (IFNg), interleukin 4 (IL4) og interleukin 10 (IL10) ved at opløses i 0,2% BSA PBS-opløsninger. Forbered lipopolysaccharid (LPS) på en stamopløsning på (100 U/ml) ved at opløses i en 0,2% BSA PBS-opløsning. Fordel hver stamopløsning som 35 μL aliquots. Opbevares ved -80 °C op til 2 år. Når lagrene er optøet, kan de opbevares ved 4 °C i 7 dage.</li>
	</ol></li>
	<li>Etape 1: Generation af embryoide kroppe (dag 0-dag 3)
	<ol>
<li>På dag 0, tilføje 2.25 mL af Stage 1 medier (hESC-SFM suppleret med 50 ng/mL BMP4, 50 NG/mL VEGF, og 20 NG/mL SCF) i to brønde af en ultralav vedhæftet fil 6 godt plade.</li>
		<li>Udskift vedligeholdelsesmedier af en 80% confluent brønd af iPSCs i en 6 brøndplade med 1,5 ml stage 1-medier.</li>
		<li>Skær kolonier ved hjælp af celle passerer værktøj og overføre skåret kolonier med en pipette i de to brønde af en ultralav vedhæftet fil 6 godt plade (se Tabel af materialer).</li>
		<li>På dag 2, bringe cytokiner til en endelig koncentration af 50 NG/mL BMP4, 50 NG /mL VEGF, og 20 ng /mL SCF ved hjælp af 0,5 ml hESC-SFM medier. BEMÆRK: IPSC kolonier vil blive EBs (Figur 2A).</li>
	</ol></li>
	<li>Etape 2: Fremkomsten af hæmatopoietiske celler i suspension
	<ol>
<li>På dag 4, pels 4 brønde af en 6 brønd væv kultur plade med 0,1% w / v gelatine og inkubere i mindst 10 min.</li>
		<li>Gelatine fjernes, og der tilsættes 2,5 ml stage 2-medier (X-VIVO15 suppleret med 100 NG/mL CSF1, 25 ng/mL IL-3, 2 mM glutamax, 1% penicillin-streptomycin og 0,055 mM 2-mercaptoethanol).</li>
		<li>Saml dannede EBs i en 50 ml centrifuge rør og lad dem bosætte sig i bunden af røret ved tyngdekraften. Omhyggeligt aspirat medierne.</li>
		<li>Resuspender eBs i 2 ml af Stage 2 medier.</li>
		<li>Overfør 10-15 EBs (ikke mere end 15) til en gelatinebelagt brønd indeholdende 2,5 ml stage 2-medier.</li>
		<li>Inkubere EB'er ved 37 °C og 5% CO2 luft.</li>
		<li>Skift medie på forgyldte EB'er hver 3-4 dage i 2-3 uger.</li>
		<li>Efter 2-3 uger begynder EBs at frigive nonadherent hæmatopoietiske celler i suspension. BEMÆRK: Denne periode med suspensioncellefrigivelse kan variere og er afhængig af cellelinje. Celler i denne suspension kan høstes og modnes til makrofager (se fase 3) (figur 2A).</li>
	</ol></li>
	<li>Fase 3: Terminal makrofag modning
	<ol>
<li>Saml suspension hæmatopoietiske celler og genopbygge medier (Stage 2 medier) på EB plade.</li>
		<li>Suspensionceller centrifugeres ved 200 x g i 3 min.</li>
		<li>Resuspender suspensionsceller i fase 3-medier (X-VIVO15 suppleret med 100 NG/mL CSF1, 2 mM glutamax og 1% penicillin-streptomycin).</li>
		<li>Plader opsamles og spundet celler på ubehandlede 10 cm bakteriologiske plader (10 ml) eller ubestrøget 6 brøndvævskulturplader (3 ml) ved en massefylde på 0,2 x 106 celler/ml.</li>
		<li>Hold celler i fase 3-medier i 9-11 dage og skift medier hver femte dag. BEMÆRK: Trin 3.4.1-3.4.5 fra fase 3 kan gentages hver 3-4 dage og ophængsceller, der er høstet fra den originale EB-plade i op til 3 måneder.</li>
	</ol></li>
	<li>Polarisering af makrofag
	<ol>
<li>For at aktivere makrofager til en M(LPS + IFNg) fænotype stimuleres cellerne med LPS (endelig koncentration: 100 ng/ml) og IFNg (endelig koncentration: 10 U/ml) i 48 timer. For at aktivere celler til en M(IL4) fænotype stimuleres cellerne med IL4 (endelig koncentration: 20 ng/ml). For at aktivere til en M(IL10) fænotype stimuleres makrofager med IL10 (endelig koncentration: 5 NG/ml).</li>
	</ol></li>
</ol>4. iPSC-afledte makrofager Kvalitetskontrol Kontrol
<ol><li>Antallet af hæmatopoietiske suspensionsceller, der produceres pr. 6 brøndplade af EB'er, bestemmes ved at tælle dem med et hæmatocytometer.</li>
	<li>Vurder makrofagmorfologi som tidligere beskrevet (f.eks. kommerciel kitfarvning)8,9.</li>
	<li>
Detekter ekspressionen af makrofagspecifikke markører og polariseringsmarkører ved hjælp af genekspressionsanalyser og flowcytometri som tidligere beskrevet8,9.
	<ol>
<li>For flow cytometri eksperimenter på en brønd af en 6 brønd plade af makrofager, høste celler ved at aspirere deres modning medier, vaskes med 2 ml PBS, og inkubere dem med 2 ml enzymfri celle dissociation buffer i 5 min ved stuetemperatur (RT). Pipette op og ned gentagne gange for at frigøre og høste makrofager.</li>
		<li>Der medregnes celler med et hæmatocytometer, og de suspenderes igen i 80 μL af en 2% BSA, 0,5 mM ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA)-PBS-opløsning.</li>
		<li>Der tilsættes 20 μLC MACS human F C-blokker.</li>
		<li>Inkuber på is i 20 min og beskyt mod lys.</li>
		<li>Der tilsættes et passende volumen på 2% BSA, 0,5 mM EDTA PBS-opløsning for at bringe cellekoncentrationen op på 1 x 106 makrofager/ml.</li>
		<li>Plettet 1 x 105 celler i 100 μL af 2% BSA, 0,5 mM EDTA PBS opløsning med tilsvarende antistof (se NOTE nedenfor) og inkuberes i 15 minutter ved RT beskyttet mod lys.</li>
		<li>1x med mindst 100 μL 2% BSA, 0,5 mM EDTA PBS.</li>
		<li>Resuspender cellerne i 200 μL på 2% BSA, 0,5 mM EDTA PBS.</li>
		<li>Der tilsættes 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, fortyndet 1:1.000) som et levende dødt farvestof. Inkuber 3 min.</li>
		<li>For flow cytometri analyser, gate på den vigtigste population, derefter enkelte celler, og derefter levende celler. På populationen af levende celler er makrofagsrelateret markørudtryk tydeligt (Figur 3A). BEMÆRK: Antistoffer bør omhyggeligt titreres for hver cellelinje, der anvendes til at udlede makrofager. Antistoffer, der præsenteres i resultatsektionen, findes i materialetabellen. Fortyndingsfaktoren for SFCi55-afledte makrofager flow cytometri analyser er også inkluderet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Høj gennemløb Fagocytosis Assay
<ol><li>Høst iPSC-afledte makrofager (iPSC-DMs) ved at aspirere mediet, tilføje iskold enzymfri celledissociationsbuffer og inkubere i 5 min. Saml makrofager ved pipettering gentagne gange.</li>
	<li>Plade 8 x 104 iPSC-DM'er i en brønd af billeddannelse af vævskultur klasse 96 brøndplader (f.eks Cellcarrier Ultra, Perkin Elmer) mindst 2 dage før høj gennemløbsbilleddannelse i 200 μL af trin 3 medier.</li>
	<li>PHrodoGreen Zymosan-A Bioparticles fremstilles igen ved at suspendere et hætteglas i 2 ml PBS ("Løsning 1"). Vortex opløsning til 10 s.</li>
	<li>2 ml PBS perlesuspension 1:5 fortyndes med mere PBS ("Løsning 2").</li>
	<li>Sonikeopløsning 2 til 8 s og vortex opløsning til 10 s. Hold den ved 4 °C. Denne opløsning vil blive anvendt i trin 5.11.</li>
	<li>Fjern mediet på belagte iPSC-DMs og vask med PBS.</li>
	<li>Plet-iPSC-DM'er med en PBS-opløsning indeholdende Hoechst 33342 fortyndet 1:20. Inkuber i 20 min ved 37 °C.</li>
	<li>Cellerne vaskes med PBS.</li>
	<li>Pletten med en PBS-opløsning indeholdende dyb rød plasmamembranplet fortyndet 1:1.000 (se Materialetabel). Inkuber i 30 min. ved 37 °C.</li>
	<li>Cellerne vaskes med PBS.</li>
	<li>Der tilsættes 100 μL perleopløsning ved 4 °C til hver brønd af iPSC-DMs. Pladerne er nu klar til billeddannelse.</li>
	<li>Image pladen ved hjælp af et højt indhold billeddannelse system og erhverve tre eller flere felter på tværs af brønden for at opnå en god repræsentation af brønden.</li>
	<li>
Kvantificer fagocytose ved hjælp af Columbus software (High-Content Imaging analysesystem software). En specifik algoritme kan udvikles til entydig billedbatchanalyse:
	<ol>
<li>Mål blå intensitet og definer i den software, som blåt signal angiver kernerne.</li>
		<li>Mål rød intensitet og definer i den software, der rødt signal angiver cytoplasmaet.</li>
		<li>Definer, at kerne og cytoplasma sammen svarer til en celle.</li>
		<li>Mål grøn intensitet i cellerne og etablere en streng cut-off/ tærskelværdi for at betragte en celle som fagocytisk.</li>
		<li>Kvantificer den fagocytiske cellefraktion og det gennemsnitlige fagocytiske indeks pr. celle. Fordi perlefarveintensiteten er proportional med antallet af perler, kan fagocytisk aktivitet måles ved antallet af indskydede perler.</li>
		<li>Anvend algoritmen/pipelinen på alle billeder inden for hvert felt og på alle de punkter, der er anskaffet, hvilket giver mulighed for en robust og upartisk batchtilgang til at bestemme cellernes fagocytiske egenskaber. BEMÆRK: Columbus er en analysesoftware med højt indhold, som tilbyder cellesegmenteringsanalyse til cellefænopålidelighed og funktionstest.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+technology:+a+decade+of+progress.">Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).</li><li>Focosi, D., Amabile, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Red+Blood+Cells+and+Platelet+Concentrates:+From+Bench+to+Bedside.">Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Red Blood Cells and Platelet Concentrates: From Bench to Bedside.</a> Cells. 7 (1), (2017).</li><li>Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IPS+cells:+A+game+changer+for+future+medicine.">IPS cells: A game changer for future medicine.</a> EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).</li><li>Lachmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Hematopoietic+Differentiation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Provides+Granulocytes+or+Macrophages+for+Cell+Replacement+Therapies.">Large-Scale Hematopoietic Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Provides Granulocytes or Macrophages for Cell Replacement Therapies.</a> Stem Cell Reports. 4 (2), 282-296 (2015).</li><li>Kuhn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALEN-mediated+functional+correction+of+human+iPSC-derived+macrophages+in+context+of+hereditary+pulmonary+alveolar+proteinosis.">TALEN-mediated functional correction of human iPSC-derived macrophages in context of hereditary pulmonary alveolar proteinosis.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).</li><li>Ackermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+Generation+of+Genetically+Modified+Macrophages+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Ex vivo Generation of Genetically Modified Macrophages from Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Transfusion Medicine and Hemotherapy. 44 (3), 135-142 (2017).</li><li>Lopez-Yrigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+iPSC+line+capable+of+differentiating+into+functional+macrophages+expressing+ZsGreen:+A+tool+for+the+study+and+in+vivo+tracking+of+therapeutic+cells.">A human iPSC line capable of differentiating into functional macrophages expressing ZsGreen: A tool for the study and in vivo tracking of therapeutic cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), (2018).</li><li>Lopez-Yrigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+programming+of+macrophages+generates+an+in+vitro+model+for+the+human+erythroid+island+niche.">Genetic programming of macrophages generates an in vitro model for the human erythroid island niche.</a> Nature Communications. 10 (1), 881 (2019).</li><li>Cassetta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Tumor-Associated+Macrophage+and+Monocyte+Transcriptional+Landscapes+Reveal+Cancer-Specific+Reprogramming,+Biomarkers,+and+Therapeutic+Targets.">Human Tumor-Associated Macrophage and Monocyte Transcriptional Landscapes Reveal Cancer-Specific Reprogramming, Biomarkers, and Therapeutic Targets.</a> Cancer Cell. 35 (4), 588-602 (2019).</li><li>Haideri, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+embryonic+stem+cell+derived+macrophages+ameliorates+fibrosis+in+a+murine+model+of+liver+injury.">Injection of embryonic stem cell derived macrophages ameliorates fibrosis in a murine model of liver injury.</a> NPJ Regenerative Medicine. 2, 1-10 (2017).</li><li>van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient,+long+term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions.">Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PLoS One. 8 (8), 71098 (2013).</li><li>Pandya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+and+murine+induced+pluripotent+stem+cells+to+microglia-like+cells.">Differentiation of human and murine induced pluripotent stem cells to microglia-like cells.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 753-759 (2017).</li><li>Douvaras, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+to+Microglia.">Directed Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Microglia.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1516-1524 (2017).</li><li>Heideveld, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+macrophage+differentiation+and+in+vitro+generation+of+human+tumor+associated-like+macrophages.">Methods for macrophage differentiation and in vitro generation of human tumor associated-like macrophages.</a> Methods in Enzymology. , 1-18 (2019).</li><li>Leary, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergism+between+interleukin-6+and+interleukin-3+in+supporting+proliferation+of+human+hematopoietic+stem+cells:+comparison+with+interleukin-1+alpha.">Synergism between interleukin-6 and interleukin-3 in supporting proliferation of human hematopoietic stem cells: comparison with interleukin-1 alpha.</a> Blood. 71 (6), 1759-1763 (1988).</li><li>Robin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unexpected+Role+for+IL-3+in+the+Embryonic+Development+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">An Unexpected Role for IL-3 in the Embryonic Development of Hematopoietic Stem Cells.</a> Developmental Cell. 11 (2), 171-180 (2006).</li><li>Moldenhauer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+progenitor+cells+and+interleukin-stimulated+endothelium:+Expansion+and+differentiation+of+myeloid+precursors.">Hematopoietic progenitor cells and interleukin-stimulated endothelium: Expansion and differentiation of myeloid precursors.</a> BMC Immunology. 9, 56 (2008).</li><li>Kodama, H., Nose, M., Shumpei Niida, S., Yarnasakit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+Role+of+Macrophage+Colony-Stimulating+Factor+in+the+Osteoclast+Differentiation+Supported+by+Stromal+Cells.">Essential Role of Macrophage Colony-Stimulating Factor in the Osteoclast Differentiation Supported by Stromal Cells.</a> Brief Definitive Report. , 1291-1294 (1991).</li><li>Bender, A. T., Ostenson, C. L., Giordano, D., Beavo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+monocytes+in+vitro+with+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+and+macrophage+colony-stimulating+factor+produces+distinct+changes+in+cGMP+phosphodiesterase+expression.">Differentiation of human monocytes in vitro with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and macrophage colony-stimulating factor produces distinct changes in cGMP phosphodiesterase expression.</a> Cellular Signalling. 16 (3), 365-374 (2004).</li><li>Klimchenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytic+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells+and+fetal+liver+share+common+differentiation+pathways+and+homeostatic+functions.">Monocytic cells derived from human embryonic stem cells and fetal liver share common differentiation pathways and homeostatic functions.</a> Blood. 117 (11), 3065-3075 (2011).</li><li>Alasoo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+macrophages+derived+from+monocytes+and+iPS+cells+identifies+a+conserved+response+to+LPS+and+novel+alternative+transcription.">Transcriptional profiling of macrophages derived from monocytes and iPS cells identifies a conserved response to LPS and novel alternative transcription.</a> Scientific Reports. , 1-15 (2015).</li><li>Buchrieser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Macrophages+Share+Ontogeny+with+MYB-Independent+Tissue-Resident+Macrophages.">Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Macrophages Share Ontogeny with MYB-Independent Tissue-Resident Macrophages.</a> Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).</li><li>Vanhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+embryonic+stem+cell+hematopoiesis+mimics+MYB-independent+yolk+sac+hematopoiesis.">In vitro human embryonic stem cell hematopoiesis mimics MYB-independent yolk sac hematopoiesis.</a> Haematologica. 100 (2), 157-166 (2015).</li><li>Abud, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-Derived+Human+Microglia-like+Cells+to+Study+Neurological+Diseases.">iPSC-Derived Human Microglia-like Cells to Study Neurological Diseases.</a> Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).</li><li>Yang, C. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+KLF1+Enhances+the+Differentiation+and+Maturation+of+Red+Blood+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Activation of KLF1 Enhances the Differentiation and Maturation of Red Blood Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cells. 35 (4), 886-897 (2017).</li><li>Karavitis, J., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+phagocytosis:+effects+of+environmental+pollutants,+alcohol,+cigarette+smoke,+and+other+external+factors.">Macrophage phagocytosis: effects of environmental pollutants, alcohol, cigarette smoke, and other external factors.</a> Journal of Leukocyte Biology. 90 (6), 1065-1078 (2011).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).</li><li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Activation+and+Polarization:+Nomenclature+and+Experimental+Guidelines.">Macrophage Activation and Polarization: Nomenclature and Experimental Guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li><li>Cao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+Functional+Comparison+of+Monocytes+and+Macrophages+from+hiPSCs+with+Peripheral+Blood+Derivatives.">Differentiation and Functional Comparison of Monocytes and Macrophages from hiPSCs with Peripheral Blood Derivatives.</a> Stem Cell Reports. 12, 1282-1297 (2019).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.

Protokollen for generering af iPSC-DM'er, der er beskrevet her, er robust og giver mulighed for produktion af et stort antal homogene celler fra et relativt lille antal iPSC'er. Efter den indledende differentiering af ca. 1 x 106 iPSC'er kan de efterfølgende kulturer høstes hver 4.7 Disse in vitro-genererede humane makrofager er morfologisk ligner primære menneskelige makrofager, udtrykke de vigtigste makrofag celle overflade markører, og udstille fagocytisk aktivitet. Protokollen for makrofagdifferentiering er reproducerbar og kan anvendes på andre hiPSC- og hESC-cellelinjer, men den præcise timing af den første høst af makrofagprækursorerne og det absolutte antal celler, der kan genereres, varierer mellem iPSC-linjer.
Det er blevet påvist, at makrofager kan genereres fra iPSCs, der er blevet genetisk manipuleret. F.eks. blev der indsat en transgenkassette bestående af den fluorescerende reporter ZsGreen under den konstituerende CAG-promotors kontrol i AAVS1 locus på SFCi55 iPSC-linjen, og det blev efterfølgende påvist, at denne iPSC-linje kunne differentieres til ZsGreen-udtrykkende makrofager8. Disse fluorescerende makrofager kan anvendes i fremtiden til at spore migration og stabilitet af terapeutiske makrofager i sygdomsmodeller. I en anden undersøgelse, makrofager blev genereret fra en iPSC linje, der var blevet genetisk manipuleret til at udtrykke en tamoxifen-induceret transskription faktor, KLF1. Aktivering af KLF1 i iPSC-afledte makrofager resulterede i produktion af makrofager med en fænotype, der kan sammenlignes med makrofager på erythroidøen9. Potentielt kan denne strategi anvendes til genetisk program iPSC-afledte makrofager i fænotyper forbundet med andre vævsspecifikke makrofagpopulationer såsom Kupffer-celler i leveren eller Langerhans-celler i huden. Dette ville være muligt, når de vigtigste transskriptionsfaktorer, der definerer disse celletyper, er identificeret.
Med hensyn til protokollen er det meget vigtigt at bemærke, at forudsætningen for startpopulationen af iPSC'er er afgørende for en vellykket differentiering. Menneskelige iPSC kulturer kan overskrides med karyotypically unormale subpopulationer over flere passager, så robust kurering af iPSC bestande og store batch master bestande udsat for genom kvalitetskontrol anbefales. I vores hænder kan de vedligeholdelsesprotokoller, der er beskrevet her, opretholde karyotypically normale iPSCs i op til 2 måneder i kontinuerlig kultur, men dette kan variere for forskellige cellelinjer og i forskellige laboratorier. Hvis der opstår problemer, er det tilrådeligt at bruge et nyt hætteglas med udifferentierede iPSC'er til hvert differentieringseksperiment. Desuden bør startkulturen for udifferentierede iPSC'er ikke være mere end 80 % flydende. På EB plating fase, bør kun 10-15 EBs være belagt pr brønd af en 6 godt væv kultur plade, og det er afgørende, at disse EBs er spredt ud jævnt over brønden. Et højere antal EBs og / eller sammenklumpning af EBs i midten af brønden havde en negativ effekt på antallet af makrofager genereret. Der bør udvises forsigtighed ved genopfyldning af medier og høst af monocytelignende sfrajedringsceller fra EB-kulturerne for at undgå at forstyrre eB'ernes vedhæftning til overfladen af de belagte dyrkningsplader. Antallet af hæmatopoietiske suspensionsceller, der produceres, stiger gradvist med hver høst med optimal produktion mellem dag 40-72 af differentiering (figur 2). Produktionen falder gradvist efter dag 68, og pladerne har tendens til at udtømme efter 2,5 måneder, selv om den præcise timing kan variere afhængigt af iPSC-linjen.
En begrænsning af vores protokol er, at det ikke har været muligt at kryopræparere de hæmatopoietiske suspensionsceller, der blev genereret i slutningen af fase 2. Protokoller, der er afhængige af den eksogene aktivering af WNT rapport om en 40% inddrivelse sats efter kryopræservering, men disse protokoller rapporterer kun én celle høst, så det absolutte antal makrofager genereret er lav30. Den protokol, der er beskrevet her, og som fremkalder endogen signalering via dannelsen af EB'er, kan høstes hver anden uge, hvilket giver et langt højere samlet makrofagudbytte.
Sammenfattende præsenterer vi en detaljeret protokol til produktion af funktionelle iPSC-afledte makrofager. Opsætning af in vitro-eksperimenter med iPSC-afledte makrofager for at studere makrofagbiologi i sundhed og sygdom har mange fordele i forhold til forsøg med monocyt-afledte makrofager (MDMs). Disse fordele omfatter den lette adgang til materialet (f.eks. kræves der ingen donorer), der kan produceres meget store mængder makrofager, og det er muligt og relativt ligetil at producere genetisk modificerede makrofager. Desuden kan iPSC-afledte makrofager være bedre ressource for studiet af vævs-hjemmehørende makrofag biologi.

Embryonale stamceller (ESCs) og inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) repræsenterer en selvfornyende cellekilde, der kan differentieres til at producere celler af alle tre kimlagsslægter. Teknologier, der giver mulighed for genetisk manipulation af humane pluripotente stamceller, såsom Zink Finger Nuclease, TALENS, og CRISPR-Cas9, har revolutioneret medicinsk forskning1,2,,3,4. Genetisk manipulation af menneskelige kpc'er er en særlig attraktiv strategi , når den primære celle af interesse er vanskelig at udvide og/eller opretholde in vitro eller er vanskelig at manipulere genetisk, som det er tilfældet for makrofager5,6,7,8,9. Da menneskelige iPSCs kan udledes af enhver somatiske celle, omgår de de etiske begrænsninger, der er forbundet med ePC'er, og giver en strategi for levering af personlig medicin. Dette omfatter patientspecifik sygdomsmodellering, lægemiddeltest og autolog celleterapi med nedsat risiko for immunafstødning og infektion6,8,10,11.
Protokoller, der beskriver generering af makrofager fra iPSC'er, består af en tretrinsproces, der omfatter: 1) Generering af embryolede kroppe; 2) Fremkomsten af hæmatopoietiske celler i suspension; 3) Terminal makrofag modning.
Dannelsen af tredimensionelle aggregater, kendt som embryoide organer (EBs) initierer differentiering af iPSCs. Knogle morfogenetisk protein (BMP4), stamcellefaktor (SCF), og vaskulære endotel vækstfaktor (VEGF) tilsættes for at drive mesoderm specifikation og støtte nye hæmatopoietiske celler7,8,9,11,12. De differentierende celler i EBs også indlede aktivering af endogene signalveje såsom Wnt og Activin. Nogle differentieringsprotokoller går ikke gennem den fase af EB-dannelse. I disse tilfælde føjes Wnt- og Activin-signalregulatorer, såsom rekombinant human Activin A og/eller Chiron, til differentiering af iPSC'er i et monolagsformat13,14,15. Her fokuserer vi på en protokol, der bruger EB-formation. For det andet trin i differentiering, er EBs belagt på en klæbende overflade. Disse vedlagte celler er derefter udsat for cytokiner, der fremmer fremkomsten af suspension celler, der omfatter hæmatopoietiske og myeloid progenitors. I disse in vitro kultur betingelser, interleukin-3 (IL3) sandsynligvis understøtter hæmatopoietisk stilk-progenitor celledannelse og spredning16,17, samt myeloid prækursorer spredning og differentiering18. Makrofagkolonistimulerende faktor (CSF1) understøtter produktionen af myeloidceller og deres differentiering til makrofager19,20. I den tredje fase af differentiering, er disse suspension celler dyrkes i overværelse af CSF1 til støtte terminal makrofag modning.
Differentieringen af menneskelige iPSCs i makrofager in vitro efterligner den tidlige bølge af makrofag produktion under udviklingen. Vævs-hjemmehørende makrofager er etableret under embryogenese og har en særskilt udviklingsmæssige afstamning fra voksne monocytter. Flere undersøgelser har vist, at iPSC-DMs har en gensignatur, der er mere sammenlignelig med føtale leverbaserede makrofager end blodafledte monocytter, hvilket tyder på, at iPSC-DMs er mere beslægtet med vævshjemmehørende makrofager. iPSC-DMs udtrykker højere niveauer af gener, der koder for udskillelsen af proteiner, der er involveret i vævsombygning og angiogenese, og udtrykker lavere niveauer af gener, der koder for proinflammatoriske cytokinsekredions- og antigenpræsentationsaktiviteter21,22. Desuden har iPSC-DMs et tilsvarende transskriptionsfaktorkrav til kravet om vævsresidente makrofager23,24. Ved hjælp af knockout iPSC-cellelinjer, der er mangelfulde i transskriptionsfaktorerne RUNX1, SPI1 (PU.1) og MYB, viste Buchrieser et al. at genereringen af iPSC-DMs er SPI1 og RUNX1 afhængig, men MYB uafhængig. Dette indikerer, at de er transskriptionalt ligner æggeblomme-sac afledte makrofager, der genereres under den første bølge af hæmatopoiese under udvikling23. Derfor er det almindeligt accepteret, at iPSC-DMs repræsenterer en mere passende cellemodel til at studere vævshjemmehørende makrofager såsom mikroglia14,25 og Kupffer celler11, og en mere ønskelig kilde til celler, der potentielt kunne anvendes i behandlinger til reparation af væv. For eksempel har det vist sig, at makrofager produceret in vitro fra mus ESCs var effektive i forbedring af fibrose i en CCl4-induceret leverskade model in vivo11. Endvidere var disse ESC-afledte makrofager mere effektive end knoglemarvsafledte makrofager ved repopulating Kupffer cellerum forarmet af makrofager ved hjælp af liposomal clodronat11 i mus.
Her beskriver vi protokoller for serum- og feederfri protokoller til vedligeholdelse, frysning og optøning af humane iPSC'er og for differentieringen af disse iPSCs til funktionelle makrofager. Denne protokol er meget lig den, der er beskrevet af Van Wilgenburg et al.12, med mindre ændringer, herunder: 1) iPSC-vedligeholdelse medier; 2) ROCK-hæmmer anvendes ikke i EB-dannelsesfasen. 3) En mekanisk tilgang snarere end en enzymatisk tilgang anvendes til at generere ensartede EBs fra iPSC kolonier; 4) Metoden til EB høst og plating ned er anderledes; 5) Suspension celler høstes 2x om ugen, snarere end ugentligt; og 6) Høstede suspensionceller dyrkes under CSF1 for makrofagmodning i 9 dage i stedet for 7 dage. Vi beskriver også protokoller, der bruges til at karakterisere iPSC-afledt makrofagfænotype og funktion, herunder analyser for genekspression (qRT-PCR), celleoverflademarkørudtryk (flowcytometri) og funktionelle analyser til vurdering af fagocytose og polarisering.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:891px;" width="889">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:468px;">2-Mercaptoethanol (50 mM)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:87px;">31350010</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Abtibody CD64-APC -CY7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>305026</td>
			<td>Dilution factor: 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody 25F9-EFLUOR 660</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>15599866</td>
			<td>Dilution factor: 1:20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CCR2-PE-Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>357212</td>
			<td>Dilution factor: 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CCR5 PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>313707</td>
			<td>Dilution factor: 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CCR8 PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>360603</td>
			<td>Dilution factor: 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CD11b-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>301305</td>
			<td>Dilution factor: 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CD14-APC</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>10669167</td>
			<td>Dilution factor: 1:20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CD163-PE-CY7</td>
			<td>BIolegend</td>
			<td>333614</td>
			<td>Dilution factor: 1:25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CD169-APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>346007</td>
			<td>Dilution factor: 1:25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CD206-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>321106</td>
			<td>Dilution factor: 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CD209-PE-CY7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>3310114</td>
			<td>Dilution factor: 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CD274-PE-CY7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>329718</td>
			<td>Dilution factor: 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CD43-PE</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>10854419</td>
			<td>Dilution factor: 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CD45-APC</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>15577936</td>
			<td>Dilution factor: 1:20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CD86-APC</td>
			<td style="width:149px;">Biolegend</td>
			<td>305412</td>
			<td>Dilution factor: 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CD93-PE</td>
			<td style="width:149px;">Ebioscience</td>
			<td>10804637</td>
			<td>Dilution factor: 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CX3CR1-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>307650</td>
			<td>Dilution factor: 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody HLA-DR-BV650</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>307650</td>
			<td>Dilution factor: 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antiboy CD115-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>347308</td>
			<td>Dilution factor: 1:40</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Dissociation Buffer, enzyme free</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>13151014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Dissociation Buffer, enzyme-free, PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13151014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6055302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellMask Deep Red Plasma Membrane Stain</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C10046</td>
			<td>Cryopreservation media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryostor CS10</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CTS CELLstart Substrate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1014201</td>
			<td>Stem cell substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td>Final concentration 1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS, calcium, magnesium (500ml)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14040091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FcR Blocking Reagent, human</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td colspan="2">130-059-901</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>PHG0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Recombinant IFNY</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14-8319-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Serum Albuminum</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharide (LPS) from E. Coli</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NucBlue (Hoechst33342)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate for Phagocytosis</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P35365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Porcine Skin Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human BMP4 Protein</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>314-BP-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human IL10</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human IL3</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>200-03-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human IL4</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>200-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human MCSF (carrier-free) 100ug</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>574806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human VEGF Protein</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>293-VE-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rock Inhibitor Y-27632</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SCM075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SCF (C-Kit Ligand) Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>PHC2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StemPro hESC SFM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A1000701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StemPro EZPassage Disposable Stem Cell Passaging Tool</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>23181010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultralow attachment plates: Cell culture multi-well plate, 6 well, cell star cell repellent surface</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>657970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Vivo 15 500 mL bottle</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE02-060F</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells

Makrofager er til stede i de fleste hvirveldyr væv og omfatter vidt spredte og heterogene cellepopulationer med forskellige funktioner. De er centrale aktører i sundhed og sygdom, der fungerer som fagocytter under immunforsvar og mægle trofisk, vedligeholdelse og reparation funktioner. Selv om det har været muligt at studere nogle af de molekylære processer, der er involveret i human makrofag funktion, har det vist sig vanskeligt at anvende genteknologiske teknikker til primære menneskelige makrofager. Dette har i høj grad hæmmet vores evne til at afhøre de komplekse genetiske veje, der er involveret i makrofagbiologi, og til at generere modeller for specifikke sygdomstilstande. En off-the-shelf kilde til menneskelige makrofager, der er modtagelige for det store arsenal af genetiske manipulation teknikker ville derfor give et værdifuldt redskab på dette område. Vi præsenterer en optimeret protokol, der giver mulighed for generering af makrofager fra humane inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) in vitro. Disse iPSC-afledte makrofager (iPSC-DMs) udtrykker humane makrofagcelleoverflademarkører, herunder CD45, 25F9, CD163 og CD169, og vores funktionelle analyse af levende celler viser, at de udviser robust fagocytisk aktivitet. Kulturformes iPSC-DMs kan aktiveres til forskellige makrofagtilstande, der viser ændret genekspression og fagocytisk aktivitet ved tilsætning af LPS og IFNg, IL4 eller IL10. Således, dette system giver en platform til at generere menneskelige makrofager regnskabsmæssige genetiske ændringer, model specifikke menneskelige sygdomme og en kilde til celler til narkotika screening eller celle terapi til behandling af disse sygdomme.

Differentieringsprogression, makrofagnummer og morfologi De fremlagte resultater er differentiering af SFCi55 human iPSC-linjen , som er blevet beskrevet og anvendt i en række undersøgelser8,9,10,26. Processen med IPSC-differentiering i retning af makrofager kunne overvåges ved hjælp af optisk mikroskopi. iPSC kolonier, embryoid organer (EBs), hæmatopoietiske suspension celler, og modne makrofager var morfologisk adskilt (Figur 2A). Ældre makrofag morfologi kunne valideres yderligere ved farvning af centrifugerede cytospin præparater. IPSC-afledte makrofager var store og havde enkelte små ovale kerner og rigelige cytoplasma, der indeholder mange vesikler (figur 2B).
De første 2 uger af hæmatopoietiske suspensionceller høster (dag 16-28) af en fuld 6 brøndplade af EB'er indeholdt i gennemsnit 2,59 x 106 ± 0,54 celler. Efter dag 28 blev der i gennemsnit produceret 4,64 x 106 ± 0,94 af suspensionscellerne pr. 6 brøndplade af EB'er. Fra dag 80 og fremefter begyndte antallet af suspensionsceller at falde, efterhånden som EB'erne blev opbrugt (figur 2C). Det anbefales at stoppe differentieringsprotokollen, efter at tallene er faldet til under 3 x 106 prækursorer pr. høst pr. 6 brøndplade af EB'er.
IPSC-afledt makrofagcelleoverflademarkører Flow cytometri er fortsat den mest almindelige metode, der anvendes til at vurdere fænotype af menneskelige makrofager. Gating-strategien til vurdering af celleoverflademarkørudtrykket består i at gating den vigtigste population af celler ved hjælp af fysiske parametre som størrelse og granularitet, efterfulgt af gating enkelte celler og derefter levende celler (Figur 3A). Modne iPSC-afledte makrofager bør udtrykke afstamning markør CD45 og makrofag modning markør 25F9, og være negativ for monocyt / umodne makrofag markør CD93. Dette er i overensstemmelse med vores bemærkninger (figur 3A). IPSC-afledte makrofager var også positive for afstamning myeloid markører CD11b, CD14, CD43, CD64, CD115, CD163, og CD169 (Figur 3B). De var positive for immun-graduering markør CD86, og en lille del af dem udtrykt chemokinreceptorer CX3CR1, CCR2, CCR5, og CCR8 på naiv tilstand (Figur 3B). De parceller blev indhentet fra data tidligere offentliggjort af vores laboratorium8.
iPSC-afledte makrofager fagocytose og polarisering Et af de vigtigste elementer i makrofager i vært forsvar og væv homøostase er deres evne til at fagocytose patogener, apoptotiske celler, og vragrester27. Satsen for fagocytose er tæt forbundet med specifikke fænotypiske tilstande28. For at evaluere iPSC-DM fagocytiske evne, vi brugte et højt indhold billeddannelse system tilgang8,,9,11, der gør brug af PerkinElmer Operetta Mikroskop og pHrodo Zymosan biopartikler (pH-følsomme farvestof konjugater). Biopartikler var nonfluorescerende, når de tilsættes til kulturerne (figur 4A), men fluorescerede lysegrønne i den intracellulære sure pH (figur 4B). Det levende billeddannende Operetta-mikroskop blev sat til billede hvert 5. En høj gennemløb og upartisk billedanalyse pipeline blev derefter brugt i Columbus platform til at kvantificere aktivitet i form af den fagocytiske fraktion, der repræsenterer andelen af celler, fagocytosede perler og det fagocytiske indeks, der er et mål for antallet af perler, som hver celle indtages.
Makrofager kan reagere og ændre deres fænotype afhængigt af miljømæssige signaler. For at vurdere deres evne til at reagere og ændre på miljømæssige stimuli, kan iPSC-DMs behandles med LPS og IFNg, IL4 eller IL10. Efter 48 timers behandling, de ændrede fænotype, heri benævnt M (LPS + IFNg), M (IL4), og M (IL10), henholdsvis29. Analyse af genekspression er et nyttigt værktøj til at teste makrofagernes polariseringsstatus. Ved LPS- og IFNg-stimulering opskalerer makrofager et reguleret mRNA-udtryk for gener CD40, VCAM1og TNFA (Figur 5A). Efter IL4 stimulation, celler upregulated mRNA udtryk for gener CD68, CD84, og MRC1 (Figur 5B). Efter IL10-stimulering blev iPSC-DMs reguleret ekspression af MRC1 (figur 5B). Med hensyn til fagocytose viste makrofager behandlet med LPS + IFNg eller IL4 en signifikant lavere procentdel af fagocytiske celler sammenlignet med naive makrofager. iPSC-DMs behandlet med IL10 viste en øget procentdel af fagocytiske celler og fagocytiske indeks (Figur 5C–E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61038/61038fig1.jpg"> Figur 1: Grafisk sammenfatning af iPSC-differentiering til modne funktionelle makrofager. Diagram tegnet med Biorender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61038/61038fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61038/61038fig2.jpg"> Figur 2: iPSC-differentiering i retning af makrofager og iPSC-DM-nummer og morfologi. (A) Bright Field-billeder fra (fra venstre mod højre): en IPSC-koloni, embryoide kroppe (EBs), høstede suspensionsceller og modne makrofager. Skalabar = 100 μm. (B) Billede af makrofag cytospins farves med Kwik-diff kit. Skalabjælke = 25 μm. (C) Antal ophængningsceller indsamlet pr. høst pr. 6 brøndplade af EB'er. Plot viser gennemsnit + SEM; (n = 6 biologisk uafhængige forsøg). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61038/61038fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61038/61038fig3.jpg"> Figur 3: Makrofagcelleoverflademarkør fænotype. (A) Gatingstrategi til analyse af modne iPSC-afledte makrofager. Enkelt, levende celler blev gated, derefter analyseret for udtryk for celle overflade markører CD45, CD93, og 25F9. Porte til celleoverflademarkørerne blev tegnet ved hjælp af fluorescens minus en (FMO) kontrol. (B) Repræsentativ flow cytometri histogrammer for enkelt pletter af iPSC-DMs (blå) og isotype kontrol (grå) for afstamning og myeloid markører, immun-modulation markører, modning markører, og chemokinreceptorer. Parceller er repræsentative for n = 5 biologisk uafhængige forsøg for alle afstamnings- og myeloidmarkører, undtagen CD105 og CD206 (n = 3); modningsmarkører (n = 5) immunmoduleringsmarkører (n = 3) og chemokinreceptorer (n = 3). Plots brug tidligere offentliggjorte data8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61038/61038fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61038/61038fig4.jpg"> Figur 4: IPSC-DM polarisering og fagocytose assays. Repræsentative billeder af iPSC-DMs (A) umiddelbart efter tilsætning af Zymosan pHrodo grønne perler og (B) 175 min efter tilsætning af perler. Blå repræsenterer cellernes kerner; rød repræsenterer cellernes cytoplasma. Grøn repræsenterer indtaget perler (Skalabar = 20 μm). (C) Fraktion af fagocytiske makrofager og (D) fagocytisk indeks/grøn intensitet pr. fagocytisk makrofag over tid i naiv tilstand (n = 6 biologisk uafhængige eksperimenter). Plotvis viser middelværdien, og søjlerne repræsenterer SEM. Plots brug tidligere offentliggjorte data8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61038/61038fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61038/61038fig5.jpg"> Figur 5: Evaluering af iPSC-DM polariseringstater. Relativ kvantificering af RT-PCR-analyser af naive og polariserede iPSC-DM'er med henblik på at vurdere udtrykket af (A) M(LPS+IFNΥ) BB) M(IL4) og M (IL10)-associerede gener (n = 6 biologisk uafhængige forsøg Envejs ANOVA og Holm-Sidaks mange sammenligninger efter testen. Polariserede grupper blev statistisk sammenlignet med den naive gruppe). Parceller viser middelværdien, og fejllinjerne repræsenterer standardafvigelsen. ND i plots = udskrift ikke opdaget. Data for disse parceller blev tidligere offentliggjort8. (C)Repræsentative billeder af iPSC-DMs 175 min efter tilsætning af pHrodo perler fra iPSC-DMs behandlet med (fra venstre mod højre): ingen cytokiner, LPS+IFN-Y, IL-4 og IL-10 (Scale bar = 20 μm). (D) Fraktion af fagocytiske makrofager og (E) fagocytisk indeks/grøn intensitet pr. fagocytisk makrofag i naive og polariserede makrofagbehandlinger 175 min efter tilsætning af perler (n = 12 biologisk uafhængige eksperimenter, envejs ANOVA og Holm-Sidaks mange sammenligninger efter testen. Polariserede grupper blev statistisk sammenlignet med den naive gruppe). Parceller viser middelværdien, og fejllinjerne repræsenterer standardafvigelsen (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61038/61038fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production and Characterization of Human Macrophages from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Production and Characterization of Human Macrophages from Pluripotent Stem Cells

Denne protokol beskriver den robuste generation af makrofager fra humane inducerede pluripotente stamceller, og metoder til deres efterfølgende karakterisering. Celleoverflademarkørekspression, genekspression og funktionelle analyser anvendes til at vurdere fænotypen og funktionen af disse iPSC-afledte makrofager.

Produktion og karakterisering af humane makrofager fra pluripotente stamceller

Macrophages are present in most vertebrate tissues and comprise widely dispersed and heterogeneous cell populations with different functions. They are key ...

Human makrofag biologi forskning har været begrænset, fordi det er afhængig af at indsamle celler fra donorer. Denne protokol viser en metode, hvor vi kan producere menneskelige makrofager fra pluripotente stamceller i laboratoriet. Dette er en robust protokol, der kan skaleres op til at producere makrofager i store mængder til cellebehandlinger eller forskning.Pluripotente stamceller kan manipuleres genetisk. Så i denne protokol, kan vi generere makrofager med en bestemt fænotype, fluorescerende tags, og også makrofager til model sygdomstilstande. Visuel demonstration af denne protokol er nyttig, fordi brugen af den nemme passage værktøj vil ikke være bekendt for mange forskere.Også det niveau af pleje, der er behov for, når genopfyldning medier og høst celler er svært at sætte ord på. Når de dyrkede celler har nået 80%sammenløbet, erstatte den brugte kultur medium med 1,5 milliliter frisk medium. Hold kulturbeholderen i den ene hånd, rul et engangscellepasningsværktøj hen over pladen i én retning.Alle knive i rullen skal berøre pladen. Bevar et ensartet tryk, mens der rulles. Gentag rullende i samme retning, indtil hele brønden er dækket.Drej kulturbeholderen 90 grader og gentag rullende. Med en steril pipette, bruge medier i brønden til at løsne snit kolonier. Aspirere CELLstart og erstatte medier.Overfør celler i et en-til-fire forhold på forbelagte brønde forberedt som beskrevet i manuskriptet. For at begynde differentieringsprocessen på dag nul, tilføjes 2,25 milliliter af fase et medie i to brønde af en ultra lav vedhæftet fil seks-brønd plade. Så for en 80% sammenløb godt af iPSCs i en seks-brønd plade, erstatte vedligeholdelse medier med 1,5 milliliter af fase et medie.Klip kolonier ved hjælp af et nyt celledelingsværktøj. Ved hjælp af en pipette, overføre de afskårne kolonier i de to brønde i den ultra lave vedhæftet fil seks-brønd plade. På dag to justeres cytokinkoncentrationerne ved at tilføje 0,5 milliliter hESC SFM-medier til den seks-brøndplade, der indeholder dag to embryoidorganer.På dag fire, pels fire brønde af en seks-godt væv kultur plade med 0,1% gelatine. Efter inkubation i mindst 10 minutter fjernes gelatinen og tilsættes 2,5 milliliter i fase to medier. Saml dannede embryoid organer fra de to brønde i en seks-brønd plade og læg dem i en 50 milliliter centrifuge rør.Lad dem bosætte sig i bunden af røret ved tyngdekraften. Derefter forsigtigt aspirere medierne fra røret og resuspend embryoid organer i to milliliter af fase to medier. Overfør 10 til 15 embryoidstoffer til en gelatinebelagt brønd, der indeholder 2,5 milliliter fase to medier og inkuberes ved 37 grader Celsius med 5 % kuldioxid.I to til tre uger skal du skifte mediet hver tredje til fjerde dag. Plating af EU er afgørende. At have færre end 10 eller flere end 15 EBs eller få dem ujævnt fordelt kan føre til lave udbytter af makrofager.Efter to til tre uger, embryoid organer begynder at frigive nonadherent hæmatopoietiske celler i suspension. Ved hjælp af en 40 mikrometer si, indsamle disse celler i en 50 milliliter rør og derefter genopbygge medierne. Centrifuge suspensionen af hæmatopoietiske celler ved 200 gange g i tre minutter.Resuspend de hæmatopoietiske celler i fase tre medier. Derefter plade cellerne på en massevis af 0,2 gange 10 til den sjette celler pr milliliter. Skift fase tre medier hver femte dag.Efter ni til 11 dage vil makrofagerne være fuldt differentierede og fuldt funktionelle. Tilføj otte gange 10 til den fjerde iPSC-afledte makrofager i 200 mikroliter af tredje fase medier til hver brønd af en 96-brønd plade. Der tilsættes 100 mikroliter perleopløsning til hver brønd, der indeholder iPSC-afledte makrofager.Brug et billedsystem med højt indhold til at afbilde pladen. Erhverve tre eller flere felter på tværs af hver brønd for at få en god repræsentation. iPSC-kolonier, embryoidorganer, hæmatopoietiske suspensionsceller og modne makrofager var morfologisk adskilte.iPSC-afledte makrofager var store, havde en lille oval kerne og havde rigelige cytoplasma indeholder mange vesicles. Makrofagfæstype blev vurderet efter flowcytometri. Modne iPSC-afledte makrofager udtrykte afstamningsmarkøren CD45 og makrofagmodningsmarkøren 25F9 og var negative for monocyt umodne makrofagmærke CD93.iPSC-afledte makrofager udtrykte flere afstamning myeloid markører og var positive for immun modulering markør CD86. En lille del af makrofagerne udtrykt chemokine receptorer CX3CR1, CCR2, CCR5, og CCR8. iPSC-DM fagocytiske evner blev evalueret ved hjælp af biopartikler og et højt indhold billeddannelsessystem.Biopartiklerne var ikkefluorescerende, når de blev tilsat makrofagkulturerne, men efter fagocytose fluorescerede lysegrøn i den intracellulære sure pH. Den fagocytiske fraktion repræsenterer den andel af makrofager, der fagocyrerede biopartikler og det fagocytiske indeks er et mål for antallet af biopartikler, som hver makrofag indtog. Makrofager kan ændre fænotype som reaktion på miljømæssige signaler.RT-PCR blev brugt til at kvantificere detregulerede mRNA-ekspression af gener. Makrofager behandlet med LPS og interferon gamma eller IL4 viste en betydeligt lavere procentdel af fagocytiske celler sammenlignet med naive makrofager. Makrofager behandlet med IL10 viste en øget procentdel af fagocytiske celler og et øget fagocytisk indeks.Denne protokol kan anvendes til at give en off-the-shelf kilde til celler til behandling af sygdomme som kronisk leversygdom, hvor makrofager har vist sig at være terapeutisk i dyremodeller. iPSC-afledte makrofager kan bruges til at studere makrofager forbundet med flere sygdomsstater. For eksempel bruger vi disse celler til at studere makrofager forbundet med tumorer i brystkræft.Vi har ændret fænotypen af iPSC-afledte makrofager ved genetisk programmering ved hjælp af en enkelt transskriptionsfaktor kaldet KLF1. Med dette producerede vi makrofager, der ligner erythroid ø makrofager, og de har givet indsigt i produktion og modning af røde blodlegemer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Isolering og karakterisering af dendritiske celler og makrofager fra mus Tarmen

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Afledning af T-celler<em&gt; In Vitro</em&gt; Fra mus embryonale stamceller

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

Vurdering af immunmodulerende egenskaber af humane mesenchymale stamceller (MSC&#39;er)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

Funktionel karakterisering af regulatoriske makrofager, der hæmmer graftreaktiv immunitet

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Fænotypisk karakterisering af makrofager fra rottenyre ved flowcytometri

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

SILAC Based proteomiske Karakterisering af Exosomer fra HIV-1 inficerede celler

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Isolation, karakterisering og rensning af makrofager fra væv ramt af fedme-relaterede Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering af Salmonella typhimurium-indeholdende Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells

Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells

Meningococcal meningitis is a life-threatening infection that occurs when Neisseria meningitidis (meningococcus, Nm) can gain access to the central ...