Name: production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells
Uploaded: 2020-04-16T13:00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production and Characterization of Human Macrophages from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Vi takker Fiona Rossi og Claire Cryer for hjelp med flow cytometri, Eoghan O'Duibhir og Bertrand Vernay med mikroskopi. Dette arbeidet ble finansiert av CONACYT (M.L.-Y.), Wellcome Trust (102610) og Innovate UK (L.M.F), Wellcome Trust PhD studentship (A.M), MRC Precision Medicine Studentship (T.V). L.C. og J.W.P. ble støttet av Wellcome Trust (101067/Z/13/Z), Medical Research Council (MR/N022556/1) og COST Action BM1404 Mye-EUNITER (http://www.mye-euniter.eu).

MERK: Alle reagenser og utstyr som brukes i denne protokollen, er oppført i Materialtabellen. Media bør være på 37 °C for cellekultur. Medier og reagenser som brukes i differensieringsprotokollen må være sterile.
1. Human iPSC Line Tining og vedlikehold
<ol><li>
Forbered cellevedlikeholdsmediet, vekstfaktorer og andre reagenser.
	<ol>
<li>Forbered hESC-serumfrie medier (hESC-SFM; se Materialtabellen) ved å supplere Dulbeccos modifiserte Eagle medium-F12 (DMEM/F12) med hESC-supplement, 1,8 % w/v storfeserumalbumin (BSA) og 0,1 mM 2-merkaptoetanol.</li>
		<li>Forbered menneskelig grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF) lagerløsning (10 μg/ ml) ved å oppløse bFGF i en steril 0,1% human serum albumin (HSA) -fosfat bufret saltvann (PBS) løsning. Fordel lagerløsningen som 200 μL aliquots i kryotuber. Lagerløsninger kan lagres ved -20 °C opptil 1 år. Når tint, kan lager bFGF lagres ved 4 °C i 7 dager.</li>
		<li>Forbered Rho kinasehemmer (ROCK Inhibitor)-Y27632 lageroppløsning (1 mg/ml) ved å oppløse den i sterilt vann. Fordel lagerløsningen som 50 μL aliquots i kryorør. Lagerløsninger kan lagres ved -20 °C opptil 1 år. Når den er tint, kan rockehemmerlagres ved 4 °C i 7 dager.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fortynn stamcellesubstratet (se materialtabell) 1:50 i Dulbeccos fosfat bufret saltvann med kalsium og magnesium.</li>
	<li>Plasser den fortynnede stamcellesubstratoppløsningen på kulturplater slik at det endelige volumet per overflateareal er 78 μL/cm2. For å belegge brønnen på en 6 brønnplate, tilsett 750 μL oppløsning.</li>
	<li>Inkuber den belagte platen i 1 time i en humifisert atmosfære ved 37 °C og 5 % CO2.</li>
	<li>Aspirer stamcellesubstratbelegget og tilsett 1 ml hESC supplert med 20 ng/ml bFGF og 10 μM ROCK Inhibitor.</li>
	<li>For å tine et hetteglass med frosne humane iPSC-celler, inkuber hetteglasset ved 37 °C til du tines og overfører cellene til 5 ml hESC-SFM-medier.</li>
	<li>Sentrifugeceller ved 100 x g i 3 min.</li>
	<li>Resuspendier i 0,5 ml hESC-SFM supplert med 20 ng/ml bFGF og 10 μM ROCK-hemmer. Overfør celler til de belagte godt.</li>
	<li>Kulturceller i 24 timer.</li>
	<li>Endre media til hESC-SFM supplert med 20 ng / ml bFGF, men uten ROCK-hemmer.</li>
	<li>For å opprettholde cellene, endre mediet hver dag til cellene når 80% samløpet. Udifferensierte iPSCer tar vanligvis 3–4 dager å nå 80 % samløpet.</li>
	<li>
Når cellene har nådd 80% samløpet, passasje celler.
	<ol>
<li>Erstatt brukt kultur medium med 1,5 ml fersk hESC-SFM supplert med 20 ng / ml bFGF (uten ROCK hemmer).</li>
		<li>Hold kulturfartøyet i den ene hånden og rull et engangscellepassaging-verktøy (se Materialbord) over platen i én retning (dvs. venstre til høyre). Alle kniver i valsen må berøre platen. Oppretthold jevnt trykk mens du ruller.</li>
		<li>Gjenta rullende i samme retning til hele brønnen er dekket.</li>
		<li>Roter kulturfartøyet 90° og gjenta rullingen som beskrevet i trinn 1.12.2 og 1.12.3.</li>
		<li>Kast passaging verktøyet etter bruk.</li>
		<li>Med en steril pipette, bruk media i brønnen for å løsne kutte kolonier.</li>
		<li>Overfør celler med et 1:4-forhold til forhåndsbelagte stamcellesubstratbrønner (trinn 1,2–1,5) til et endelig medievolum (hESC -SFM supplert med 20 ng/ml bFGF) på 1,5 ml per brønn.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Menneskelig iPSC linje frysing
<ol><li>For å fryse iPSC-celler, erstatt media av en 70%-80% confluent brønn av en 6 brønnplate med hESC-SFM supplert med 20 ng / ml bFGF og 10 μM ROCK Inhibitor.</li>
	<li>Inkuber godt ved 37 °C og 5 % CO2 i 1 time.</li>
	<li>Skjær kolonier med cellepassaging verktøyet og plasser løsnet kolonier i et sentrifugerør.</li>
	<li>Sentrifugeceller ved 100 x g i 3 min.</li>
	<li>Aspirer mediene og resuspendcellene i 1 ml cellekryopreservation media (se Materialtabellen).</li>
	<li>Del cellene likt i to kryovialer og legg dem i en prekjølt celle kryopreservation beholder ved 4 °C.</li>
	<li>Oppbevar cellene ved -80 °C i 24–48 timer.</li>
	<li>Overfør hetteglass til enten en fryser -135 °C eller til en flytende nitrogentank.</li>
</ol>3. Human iPSC differensiering til makrofager
MERK: Et skjematisk sammendrag av makrofagdifferensieringsprotokollen er avbildet i figur 1.
<ol><li>Klargjøre vekstfaktorer for celledifferensiering og andre reagenser
	<ol>
<li>Klargjør hESC-SFM-medier (se forrige avsnitt).</li>
		<li>Forbered 0,1% m / v løsning av svinegelatin ved å oppløse gelatinen i sterilt vann. Gelatinoppløsning en beholder ved 4 °C i opptil 2 år.</li>
		<li>Forbered human BMP4 lageroppløsning (25 μg/ml) ved å oppløse BMP4 til en 4 mM hydrogenklorid (HCl)-0,2% BSA PBS-løsning. Fordel lagerløsningen som 50 μL aliquots i kryorør. Lagerløsninger kan lagres ved -20 °C opptil 1 år. Når den er tint, kan bmp4 oppbevares ved 4 °C i 5 dager.</li>
		<li>Forbered human VEGF-lagerløsning (100 μg/ml) ved å oppløse VEGF til en 0,2 % BSA PBS-løsning. Fordel lageroppløsningen som 10 μL aliquots i kryorør. Lagerløsninger kan lagres ved -20 °C opptil 1 år. Når den er tint, kan VEGF oppbevares ved 4 °C i 7 dager.</li>
		<li>Forbered human SCF-lagerløsning (100 μg/ml) ved å oppløse SCF til en 0,2 % BSA PBS-løsning. Fordel lageroppløsningen som 5 μL aliquots i kryorør. Lagerløsninger kan lagres ved -20 °C opptil 1 år. Når den er tint, kan SCF oppbevares ved 4 °C i 10 dager.</li>
		<li>Forbered human IL3-lageroppløsning (10 μg/ml) ved å oppløse IL3 til en 0,2 % BSA PBS-løsning. Fordel lagerløsningen som 500 μL aliquots i kryotuber. Lagerløsninger kan lagres ved -20 °C opptil 2 år. Når den er tint, kan SCF oppbevares ved 4 °C i 15 dager.</li>
		<li>Forbered human CSF1 lagerløsning (10 μg/ml) ved å oppløse CSF1 til en 0,2% BSA PBS-løsning. Fordel lagerløsningen som 1 ml aliquots i kryotuber. Lagerløsninger kan lagres ved -20 °C opptil 2 år. Når den er tint, kan SCF oppbevares ved 4 °C i 15 dager.</li>
		<li>Forbered separate 10 μg/ml lagerløsninger av interferon-gamma (IFNg), interleukin 4 (IL4) og interleukin 10 (IL10) ved å oppløse susjere inn i 0,2 % BSA PBS-løsninger. Forbered lipopolysakkarid (LPS) til en lagerløsning på (100 U/ml) ved å oppløse til en 0,2% BSA PBS-løsning. Fordel hver aksjeoppløsning som 35 μL aliquots. Oppbevares ved -80 °C opptil 2 år. Når tint, kan bestandene lagres ved 4 °C i 7 dager.</li>
	</ol></li>
	<li>Trinn 1: Generasjon av embryoide kropper (dag 0–dag 3)
	<ol>
<li>På dag 0, legg til 2,25 ml trinn 1 media (hESC-SFM supplert med 50 ng / ml BMP4, 50 ng / ml VEGF, og 20 ng / ml SCF) i to brønner av en ultralow vedlegg 6 brønnplate.</li>
		<li>Erstatt vedlikeholdsmediet til en 80% sammenstreden av iPSCer i en 6 brønnplate med 1,5 ml trinn 1-medier.</li>
		<li>Skjær kolonier ved hjelp av cellepassagingverktøyet og overfør kuttkolonier med en pipette inn i de to brønnene i en ultralav vedlegg 6 brønnplate (se Materialtabellen).</li>
		<li>På dag 2, ta cytokiner til en endelig konsentrasjon på 50 ng / ml BMP4, 50 ng / ml VEGF, og 20 ng / ml SCF ved hjelp av 0,5 ml hESC-SFM-medier. MERK: IPSC kolonier vil bli EBs (Figur 2A).</li>
	</ol></li>
	<li>Trinn 2: Fremveksten av hematopoetiske celler i suspensjon
	<ol>
<li>På dag 4, pels 4 brønner av en 6 brønnvev kultur plate med 0,1% w / v gelatin og inkubere i minst 10 min.</li>
		<li>Fjern gelatin og tilsett 2,5 ml fase 2-medier (X-VIVO15 supplert med 100 ng/ml CSF1, 25 ng/ml IL-3, 2 mM glutamax, 1 % penicillin-streptomycin og 0,055 mM 2-merkaptoetanol).</li>
		<li>Samle dannede EBs i en 50 ml sentrifuge rør og la dem bosette seg på bunnen av røret ved tyngdekraften. Forsiktig aspirere media.</li>
		<li>Resuspender EBs i 2 ml av Stage 2 media.</li>
		<li>Overfør 10–15 EBer (ikke mer enn 15) til en gelatinbelagt brønn som inneholder 2,5 ml fase 2-medier.</li>
		<li>Inkuber EBs ved 37 °C og 5 % CO2 luft.</li>
		<li>Bytt medier på belagte EBer hver 3–4 dager i 2–3 uker.</li>
		<li>Etter 2–3 uker begynner EBs å slippe ikke-celler i suspensjon. MERK: Denne perioden med suspensjon celle utgivelsen kan variere og er celle linje avhengig. Celler i denne suspensjonen kan høstes og modnes til makrofager (se trinn 3) (Figur 2A).</li>
	</ol></li>
	<li>Trinn 3: Terminal makrofagmodning
	<ol>
<li>Samle opp hematopoetiske celler og fyll opp medier (Trinn 2-medier) på EB-plate.</li>
		<li>Sentrifugesuspensjonsceller ved 200 x g i 3 min.</li>
		<li>Resuspender suspensjonceller i trinn 3 medier (X-VIVO15 supplert med 100 ng/ml CSF1, 2 mM glutamax og 1 % penicillin-streptomycin).</li>
		<li>Plate samlet og spunnet celler på ubehandlet plast 10 cm bakteriologiske-grade plater (10 ml) eller ubestrøket 6 brønnvev kultur plater (3 ml) med en tetthet på 0,2 x 106 celler / ml.</li>
		<li>Hold celler i fase 3-medier i 9–11 dager, og skift av medier hver femte dag. MERK: Trinn 3.4.1-3.4.5 fra trinn 3 kan gjentas hver 3-4 dager og suspensjonceller høstet fra den opprinnelige EB-platen i opptil 3 måneder.</li>
	</ol></li>
	<li>Makrofagpolarisering
	<ol>
<li>For å aktivere makrofager til en M(LPS + IFNg) fenotype, stimulere cellene med LPS (endelig konsentrasjon: 100 ng / ml) og IFNg (endelig konsentrasjon: 10 U / ml) for 48 h. For å aktivere celler til en M (IL4) fenotype, stimulere celler med IL4 (endelig konsentrasjon: 20 ng / ml). For å aktivere til en M (IL10) fenotype, stimulere makrofager med IL10 (endelig konsentrasjon: 5 ng / ml).</li>
	</ol></li>
</ol>4. iPSC-avledet makrofager kvalitetskontroll kontroll
<ol><li>Bestem antall hematopoetiske suspensjonsceller produsert per 6 brønnplate av EB ved å telle dem med et hematocytometer.</li>
	<li>Vurder makrofagmorfologi som tidligere beskrevet (f.eks. kantsettfarging)8,9.</li>
	<li>
Oppdag uttrykket for makrofagspesifikke markører og polariseringsmarkører ved hjelp av genuttrykksanalyser og flytcytometri som tidligere beskrevet8,9.
	<ol>
<li>For flow cytometri eksperimenter på en brønn av en 6 brønnplate av makrofager, høste celler ved å aspirere sine modningsmedier, vask med 2 ml PBS, og inkuber ei dem med 2 ml enzymfri celledissosiasjonbuffer i 5 min ved romtemperatur (RT). Pipette opp og ned gjentatte ganger for å løsne og høste makrofager.</li>
		<li>Telle celler med et hematocytometer og resuspend dem i 80 μL av en 2% BSA, 0,5 mM etylendiaminetetraeddiksyre (EDTA)-PBS løsning.</li>
		<li>Tilsett 20 μL macs human FC-blokkering.</li>
		<li>Inkuber på is i 20 min og beskytt mot lys.</li>
		<li>Legg til et passende volum på 2% BSA, 0,5 mM EDTA PBS-løsning for å bringe cellekonsentrasjonen til 1 x 106 makrofager / ml.</li>
		<li>Beis 1 x 105 celler i 100 μL av 2 % BSA, 0,5 mM EDTA PBS-løsning med tilsvarende antistoff (se MERK nedenfor) og inkuber i 15 min ved RT beskyttet mot lys.</li>
		<li>Vask 1x med minst 100 μL av 2% BSA, 0,5 mM EDTA PBS.</li>
		<li>Resuspender cellene i 200 μL på 2 % BSA, 0,5 mM EDTA PBS.</li>
		<li>Tilsett 4',6-diamidino-2-fenylindzol (DAPI, fortynnet 1:1,000) som en levende-død dye. Inkuber3 min.</li>
		<li>For flow cytometri analyser, gate på hovedpopulasjonen, deretter enkeltceller, og deretter levende celler. På den levende cellepopulasjonen er makrofagrelatert markøruttrykk tydelig (figur 3A). MERK: Antistoffer bør være nøye titrerat for hver cellelinje som brukes til å utlede makrofager. Antistoffer som presenteres i resultatdelen er i Materialtabellen. Fortynningsfaktoren for SFCi55-avledede makrofager flyter cytometrianalyser er også inkludert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Høy gjennomstrømning Fagocytose analyse
<ol><li>Høst iPSC-avledede makrofager (iPSC-DMs) ved å aspirere media, legge til iskald enzymfri celledissosiasjonsbuffer og inkubere i 5 min. Samle makrofager ved å pipetting gjentatte ganger.</li>
	<li>Plate 8 x 104 iPSC-DMs i en brønn av en bildevevskultur klasse 96 brønnplater (f.eks Cellcarrier Ultra, Perkin Elmer) minst 2 dager før høy gjennomstrømningsavbildning i 200 μL av stage 3-medier.</li>
	<li>Forbered pHrodoGreen Zymosan-A Biopartikler ved å resuspendere ett hetteglass i 2 ml PBS ("Løsning 1"). Vortex løsning for 10 s.</li>
	<li>Fortynn 2 ml PBS perlesuspensjon 1:5 med mer PBS ("Løsning 2").</li>
	<li>Sonicate Solution 2 for 8 s og vortex løsning for 10 s. Hold den ved 4 °C. Denne løsningen vil bli brukt i trinn 5.11.</li>
	<li>Fjern mediet på belagte iPSC-DMs og vask med PBS.</li>
	<li>Flekk iPSC-DMs med en PBS-løsning som inneholder Hoechst 33342 fortynnet 1:20. Inkuber i 20 min ved 37 °C.</li>
	<li>Vask celler med PBS.</li>
	<li>Flekk med en PBS-løsning som inneholder dyp rød plasmamembranflekk fortynnet 1:1000 (se materialtabellen). Inkuber i 30 min ved 37 °C.</li>
	<li>Vask celler med PBS.</li>
	<li>Tilsett 100 μL perleoppløsning holdt ved 4 °C til hver brønn av iPSC-DMs. Platene er nå klare for bildebehandling.</li>
	<li>Bilde platen ved hjelp av et bildesystem med høyt innhold og skaffe tre eller flere felt på tvers av brønnen for å få en god representasjon av brønnen.</li>
	<li>
Kvantifiser phagocytose ved hjelp av Columbus programvare (High-Content Imaging analyse system programvare). En bestemt algoritme kan utvikles for entydig bildebatchanalyse:
	<ol>
<li>Mål blå intensitet og definer i programvaren som blått signal indikerer kjernene.</li>
		<li>Mål rød intensitet og definer i programvaren som rødt signal indikerer cytoplasma.</li>
		<li>Definer at kjernen og cytoplasma sammen tilsvarer en celle.</li>
		<li>Mål grønn intensitet i cellene og etablere en streng cut-off / terskel verdi for å vurdere en celle som fagocytisk.</li>
		<li>Kvantifiser fagocytisk cellefraksjon og gjennomsnittlig fagocytisk indeks per celle. Fordi perlefargeintensiteten er proporsjonal med antall perler, kan fagocytisk aktivitet måles ved antall perler som inntas.</li>
		<li>Bruk algoritmen/rørledningen på alle bilder i alle felt og til enhver tidspunkter som er anskaffet, slik at en robust og objektiv satsvis tilnærming kan bestemme cellenes fagocytiske evner. MERK: Columbus er en høy innholdsanalyse programvare, som tilbyr celle segmentering analyse for celle fenotyping og funksjonell testing.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+technology:+a+decade+of+progress.">Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).</li><li>Focosi, D., Amabile, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Red+Blood+Cells+and+Platelet+Concentrates:+From+Bench+to+Bedside.">Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Red Blood Cells and Platelet Concentrates: From Bench to Bedside.</a> Cells. 7 (1), (2017).</li><li>Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IPS+cells:+A+game+changer+for+future+medicine.">IPS cells: A game changer for future medicine.</a> EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).</li><li>Lachmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Hematopoietic+Differentiation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Provides+Granulocytes+or+Macrophages+for+Cell+Replacement+Therapies.">Large-Scale Hematopoietic Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Provides Granulocytes or Macrophages for Cell Replacement Therapies.</a> Stem Cell Reports. 4 (2), 282-296 (2015).</li><li>Kuhn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALEN-mediated+functional+correction+of+human+iPSC-derived+macrophages+in+context+of+hereditary+pulmonary+alveolar+proteinosis.">TALEN-mediated functional correction of human iPSC-derived macrophages in context of hereditary pulmonary alveolar proteinosis.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).</li><li>Ackermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+Generation+of+Genetically+Modified+Macrophages+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Ex vivo Generation of Genetically Modified Macrophages from Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Transfusion Medicine and Hemotherapy. 44 (3), 135-142 (2017).</li><li>Lopez-Yrigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+iPSC+line+capable+of+differentiating+into+functional+macrophages+expressing+ZsGreen:+A+tool+for+the+study+and+in+vivo+tracking+of+therapeutic+cells.">A human iPSC line capable of differentiating into functional macrophages expressing ZsGreen: A tool for the study and in vivo tracking of therapeutic cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), (2018).</li><li>Lopez-Yrigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+programming+of+macrophages+generates+an+in+vitro+model+for+the+human+erythroid+island+niche.">Genetic programming of macrophages generates an in vitro model for the human erythroid island niche.</a> Nature Communications. 10 (1), 881 (2019).</li><li>Cassetta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Tumor-Associated+Macrophage+and+Monocyte+Transcriptional+Landscapes+Reveal+Cancer-Specific+Reprogramming,+Biomarkers,+and+Therapeutic+Targets.">Human Tumor-Associated Macrophage and Monocyte Transcriptional Landscapes Reveal Cancer-Specific Reprogramming, Biomarkers, and Therapeutic Targets.</a> Cancer Cell. 35 (4), 588-602 (2019).</li><li>Haideri, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+embryonic+stem+cell+derived+macrophages+ameliorates+fibrosis+in+a+murine+model+of+liver+injury.">Injection of embryonic stem cell derived macrophages ameliorates fibrosis in a murine model of liver injury.</a> NPJ Regenerative Medicine. 2, 1-10 (2017).</li><li>van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient,+long+term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions.">Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PLoS One. 8 (8), 71098 (2013).</li><li>Pandya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+and+murine+induced+pluripotent+stem+cells+to+microglia-like+cells.">Differentiation of human and murine induced pluripotent stem cells to microglia-like cells.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 753-759 (2017).</li><li>Douvaras, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+to+Microglia.">Directed Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Microglia.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1516-1524 (2017).</li><li>Heideveld, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+macrophage+differentiation+and+in+vitro+generation+of+human+tumor+associated-like+macrophages.">Methods for macrophage differentiation and in vitro generation of human tumor associated-like macrophages.</a> Methods in Enzymology. , 1-18 (2019).</li><li>Leary, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergism+between+interleukin-6+and+interleukin-3+in+supporting+proliferation+of+human+hematopoietic+stem+cells:+comparison+with+interleukin-1+alpha.">Synergism between interleukin-6 and interleukin-3 in supporting proliferation of human hematopoietic stem cells: comparison with interleukin-1 alpha.</a> Blood. 71 (6), 1759-1763 (1988).</li><li>Robin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unexpected+Role+for+IL-3+in+the+Embryonic+Development+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">An Unexpected Role for IL-3 in the Embryonic Development of Hematopoietic Stem Cells.</a> Developmental Cell. 11 (2), 171-180 (2006).</li><li>Moldenhauer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+progenitor+cells+and+interleukin-stimulated+endothelium:+Expansion+and+differentiation+of+myeloid+precursors.">Hematopoietic progenitor cells and interleukin-stimulated endothelium: Expansion and differentiation of myeloid precursors.</a> BMC Immunology. 9, 56 (2008).</li><li>Kodama, H., Nose, M., Shumpei Niida, S., Yarnasakit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+Role+of+Macrophage+Colony-Stimulating+Factor+in+the+Osteoclast+Differentiation+Supported+by+Stromal+Cells.">Essential Role of Macrophage Colony-Stimulating Factor in the Osteoclast Differentiation Supported by Stromal Cells.</a> Brief Definitive Report. , 1291-1294 (1991).</li><li>Bender, A. T., Ostenson, C. L., Giordano, D., Beavo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+monocytes+in+vitro+with+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+and+macrophage+colony-stimulating+factor+produces+distinct+changes+in+cGMP+phosphodiesterase+expression.">Differentiation of human monocytes in vitro with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and macrophage colony-stimulating factor produces distinct changes in cGMP phosphodiesterase expression.</a> Cellular Signalling. 16 (3), 365-374 (2004).</li><li>Klimchenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytic+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells+and+fetal+liver+share+common+differentiation+pathways+and+homeostatic+functions.">Monocytic cells derived from human embryonic stem cells and fetal liver share common differentiation pathways and homeostatic functions.</a> Blood. 117 (11), 3065-3075 (2011).</li><li>Alasoo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+macrophages+derived+from+monocytes+and+iPS+cells+identifies+a+conserved+response+to+LPS+and+novel+alternative+transcription.">Transcriptional profiling of macrophages derived from monocytes and iPS cells identifies a conserved response to LPS and novel alternative transcription.</a> Scientific Reports. , 1-15 (2015).</li><li>Buchrieser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Macrophages+Share+Ontogeny+with+MYB-Independent+Tissue-Resident+Macrophages.">Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Macrophages Share Ontogeny with MYB-Independent Tissue-Resident Macrophages.</a> Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).</li><li>Vanhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+embryonic+stem+cell+hematopoiesis+mimics+MYB-independent+yolk+sac+hematopoiesis.">In vitro human embryonic stem cell hematopoiesis mimics MYB-independent yolk sac hematopoiesis.</a> Haematologica. 100 (2), 157-166 (2015).</li><li>Abud, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-Derived+Human+Microglia-like+Cells+to+Study+Neurological+Diseases.">iPSC-Derived Human Microglia-like Cells to Study Neurological Diseases.</a> Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).</li><li>Yang, C. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+KLF1+Enhances+the+Differentiation+and+Maturation+of+Red+Blood+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Activation of KLF1 Enhances the Differentiation and Maturation of Red Blood Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cells. 35 (4), 886-897 (2017).</li><li>Karavitis, J., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+phagocytosis:+effects+of+environmental+pollutants,+alcohol,+cigarette+smoke,+and+other+external+factors.">Macrophage phagocytosis: effects of environmental pollutants, alcohol, cigarette smoke, and other external factors.</a> Journal of Leukocyte Biology. 90 (6), 1065-1078 (2011).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).</li><li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Activation+and+Polarization:+Nomenclature+and+Experimental+Guidelines.">Macrophage Activation and Polarization: Nomenclature and Experimental Guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li><li>Cao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+Functional+Comparison+of+Monocytes+and+Macrophages+from+hiPSCs+with+Peripheral+Blood+Derivatives.">Differentiation and Functional Comparison of Monocytes and Macrophages from hiPSCs with Peripheral Blood Derivatives.</a> Stem Cell Reports. 12, 1282-1297 (2019).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter å erklære.

Protokollen for generering av iPSC-DMs beskrevet her er robust og tillater produksjon av et stort antall homogene celler fra et relativt lite antall iPSCer. Etter den første differensieringen av ca. 1 x 106 iPSCer, kan de påfølgende kulturene høstes hver fjerde dag i opptil 2–3 måneder, noe som resulterer i produksjon av minst 6,5 x 107 makrofager i løpet av den tiden. Disse in vitro-genererte humane makrofagene er morfologisk lik primære menneskelige makrofager, uttrykker de viktigste makrofagcelleoverflatemarkørene og viser fagocytisk aktivitet. Protokollen for makrofagdifferensiering er reproduserbar og kan brukes på andre hiPSC- og hESC-cellelinjer, men den nøyaktige tidspunktet for den første innhøstingen av makrofagforløperne og det absolutte antallet celler som kan genereres varierer mellom iPSC-linjer.
Det har blitt vist at makrofager kan genereres fra iPSCer som har blitt genetisk manipulert. For eksempel ble en transgenekassett bestående av den fluorescerende reporteren ZsGreen under kontroll av den konstituerende CAG-arrangøren satt inn i AAVS1-locus av SFCi55 iPSC-linjen, og det ble senere vist at denne iPSC-linjen kunne differensieres i ZsGreen-uttrykkende makrofager8. Disse fluorescerende makrofagene kan brukes i fremtiden til å spore migrasjonen og stabiliteten til terapeutiske makrofager i sykdomsmodeller. I en annen studie ble makrofager generert fra en iPSC-linje som hadde blitt genetisk manipulert for å uttrykke en tamoxifen-indusert transkripsjonsfaktor, KLF1. Aktivering av KLF1 i iPSC-avledede makrofager resulterte i produksjon av makrofager med en fenotype som kan sammenlignes med makrofager på den erytroide øya9. Potensielt kan denne strategien brukes til genetisk program iPSC-avledede makrofager i fenotyper forbundet med andre vevsspesifikke makrofagpopulasjoner som Kupffer-celler i leveren eller Langerhans-cellene i huden. Dette ville være mulig når de viktigste transkripsjonsfaktorene som definerer disse celletypene er identifisert.
Når det gjelder protokollen, er det svært viktig å merke seg at tilstanden til startpopulasjonen av iPSCer er avgjørende for vellykket differensiering. Menneskelige iPSC kulturer kan overkjøres med karyotypisk unormale underpopulasjoner over flere passasjer, så robust kurering av iPSC aksjer og store batch master aksjer utsatt for genom kvalitetskontroll anbefales. I våre hender kan vedlikeholdsprotokollene som er beskrevet her, opprettholde karyotypisk normale iPSCer i opptil 2 måneder i kontinuerlig kultur, men dette kan variere for forskjellige cellelinjer og i forskjellige laboratorier. Hvis det oppstår problemer, er det tilrådelig å bruke et nytt hetteglass med udifferensierte iPSCer for hvert differensieringseksperiment. I tillegg bør startkulturen til udifferensierte iPSCer ikke være mer enn 80% konfluent. På EB plating scenen, bare 10-15 EBs bør være belagt per brønn av en 6 brønn vev kultur plate, og det er avgjørende at disse EB er spredt jevnt over brønnen. Et høyere antall EBs og /eller klumping av EB i midten av brønnen hadde en negativ effekt på antall makrofager generert. Det bør utvises forsiktighet ved etterfylling av medier og høsting av monocyttlignende stamceller fra EB-kulturene for å unngå å forstyrre vedhemingen av EB-er til overflaten av de belagte kulturplatene. Antall hematopoetiske suspensjonsceller som produseres gradvis øker med hver høst, med optimal produksjon mellom dag 40–72 differensiering (figur 2). Produksjonen avtar gradvis etter dag 68 og plater har en tendens til å eksos etter 2,5 måneder, selv om den nøyaktige timingen kan variere avhengig av iPSC-linjen.
En begrensning av vår protokoll er at det ikke har vært mulig å kryobevare hematopoietiske suspensjonsceller generert på slutten av trinn 2. Protokoller som er avhengige av eksogene aktivering av WNT rapporterer om en 40% utvinning saterate etter kryopreservation, men disse protokollene rapporterer bare en celle innhøsting, så det absolutte antallmakrofager generert er lav30. Protokollen som er beskrevet her, indusereende endogene signalering via dannelsen av EBs, kan høstes annenhver uke, noe som gir en mye høyere total makrofag utbytte.
Oppsummert presenterer vi en detaljert protokoll for produksjon av funksjonelle iPSC-avledede makrofager. Å sette opp in vitro-eksperimenter med iPSC-avledede makrofager for å studere makrofagbiologi i helse og sykdom har mange fordeler fremfor eksperimenter med monocytt-avledede makrofager (MDMer). Disse fordelene inkluderer enkel tilgjengelighet til materialet (f.eks. ingen givere er nødvendig), svært store mengder makrofager kan produseres, og det er mulig og relativt enkelt å produsere genmodifiserte makrofager. Videre kan iPSC-avledede makrofager være bedre ressurs for studiet av vevsbosatt makrofagbiologi.

Embryonale stamceller (ESCer) og indusertpluripotente stamceller (iPSCer) representerer en selvfornyende cellekilde som kan differensieres for å produsere celler av alle tre bakterielagslinjer. Teknologier som tillater genetisk manipulering av humane pluripotente stamceller (PSCer), som Zinc Finger Nuclease, TALENS og CRISPR-Cas9, har revolusjonert medisinsk forskning1,2,3,4.4 Genetisk manipulering av menneskelige PSCer er en spesielt attraktiv strategi når den primære cellen av interesse er vanskelig å utvide og / eller å opprettholde in vitro, eller er vanskelig å genetisk manipulere, slik som er tilfelle for makrofager5,6,7,8,9. Siden menneskelige iPSCer kan utledes fra en hvilken somhelst somatiske celle, omgår de de etiske begrensningene knyttet til EsCer, og gir en strategi for å levere personlig medisin. Dette inkluderer pasientspesifikk sykdomsmodellering, legemiddeltesting og autolog cellebehandling med redusert risiko for immunavvisning og infeksjon6,,8,10,11.
Protokoller som beskriver generering av makrofager fra iPSCer består av en tre-trinns prosess som inkluderer: 1) Generasjon embryoid organer; 2) Fremveksten av hematopoetiske celler i suspensjon; 3) Terminal makrofag modning.
Dannelsen av tredimensjonale aggregater, kjent som embryoidlegemer (EBs) initierer differensiering av iPSCer. Bone morfogenetisk protein (BMP4), stamcellefaktor (SCF) og vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF) legges til for å drive mesoderm spesifikasjon og støtte nye hematopoetiske celler7,8,9,11,12. Differensierende celler i EBs også initiere aktivering av endogene signalveier som Wnt og Activin. Noen differensieringsprotokoller går ikke gjennom fasen av EB-formasjonen. I disse tilfellene, Wnt og Activin signalregulatorer, for eksempel rekombinant human Activin A og / eller Chiron legges til differensierende iPSCer i en monolayer format13,14,15. Her fokuserer vi på en protokoll som bruker EB-dannelse. For det andre trinnet av differensiering er EBs belagt på en tilhengeroverflate. Disse vedlagte cellene blir deretter utsatt for cytokiner som fremmer fremveksten av suspensjonsceller som inkluderer hematopoietiske og myeloide stamceller. I disse in vitro kulturforhold, interleukin-3 (IL3) støtter sannsynligvis hematopoietisk stem-stamcelledannelse og spredning16,17, samt myeloid forløpere spredning og differensiering18. Makrofagkolonistimulerende faktor (CSF1) støtter produksjon av myeloide celler og differensiering til makrofager19,,20. I løpet av den tredje fasen av differensiering dyrkes disse suspensjonscellene i nærvær av CSF1 for å støtte terminal makrofagmodning.
Differensieringen av menneskelige iPSCer til makrofager in vitro etterligner den tidlige bølgen av makrofagproduksjon under utvikling. Vevsbosatte makrofager er etablert under embryogenese og har en distinkt utviklingsavstamning fra voksne monocytter. Flere studier har vist at iPSC-DMs har en gensignatur som er mer sammenlignbar med føtale leveravledede makrofager enn blodavledede monocytter, noe som tyder på at iPSC-DMs er mer beslektet med vevsbosatte makrofager. iPSC-DMs uttrykker høyere nivåer av gener som koder for sekresjon av proteiner som er involvert i vevsmodellering og angiogenese og uttrykker lavere nivåer av gener koding for pro-inflammatorisk cytokin sekresjon og antigen presentasjonaktiviteter21,22. I tillegg har iPSC-DMs et analogt transkripsjonsfaktorkrav til vevsbosatte makrofager23,24. Ved hjelp av knockout iPSC cellelinjer som er mangelfulli transkripsjonsfaktorene RUNX1, SPI1 (PU.1) og MYB, viste Buchrieser et al. at genereringen av iPSC-DMs er SPI1 og RUNX1 avhengig, men MYB uavhengig. Dette indikerer at de er transkripsjonsmessig lik eggeplomme-sac avledet makrofager som genereres under den første bølgen av hematopoiesis under utvikling23. Derfor er det allment akseptert at iPSC-DMs representerer en mer hensiktsmessig cellemodell for å studere vevsbosatte makrofager som microglia14,,25 og Kupffer celler11, og en mer ønskelig kilde til celler som potensielt kan brukes i terapifor å reparere vev. For eksempel har det blitt vist at makrofager produsert in vitro fra mus ESCer var effektive i å lindre fibrose i en CCl4-indusert leverskademodell in vivo11. Videre var disse ESC-avledede makrofagene mer effektive enn benmargsavledede makrofager ved å repopulating Kupffer cellerom utarmet av makrofager ved hjelp av liposomal klomtrenate11 hos mus.
Her beskriver vi serum- og materfrie protokoller for vedlikehold, frysing og tining av menneskelige iPSCer, og for differensiering av disse iPSCene til funksjonelle makrofager. Denne protokollen er svært lik den som beskrives av Van Wilgenburg et al.12, med mindre endringer, inkludert: 1) iPSC-vedlikeholdsmedier; 2) ROCK-hemmer brukes ikke i EB-formasjonsstadiet; 3) En mekanisk tilnærming i stedet for en enzymatisk tilnærming brukes til å generere ensartede EBer fra iPSC kolonier; 4) Metoden for EB høsting og plating ned er annerledes; 5) Suspensjon celler høstes 2x i uken, snarere enn ukentlig; og 6) Høstet suspensjon celler er kultivert under CSF1 for makrofag modning i 9 dager i stedet for 7 dager. Vi beskriver også protokoller som brukes til å karakterisere iPSC-avledede makrofagfenotype og funksjon, inkludert analyser for genuttrykk (qRT-PCR), celleoverflatemarkøruttrykk (flow cytometri) og funksjonelle analyser for å vurdere phagocytose og polarisering.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:891px;" width="889">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:468px;">2-Mercaptoethanol (50 mM)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:87px;">31350010</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Abtibody CD64-APC -CY7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>305026</td>
			<td>Dilution factor: 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody 25F9-EFLUOR 660</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>15599866</td>
			<td>Dilution factor: 1:20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CCR2-PE-Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>357212</td>
			<td>Dilution factor: 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CCR5 PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>313707</td>
			<td>Dilution factor: 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CCR8 PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>360603</td>
			<td>Dilution factor: 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CD11b-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>301305</td>
			<td>Dilution factor: 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CD14-APC</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>10669167</td>
			<td>Dilution factor: 1:20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CD163-PE-CY7</td>
			<td>BIolegend</td>
			<td>333614</td>
			<td>Dilution factor: 1:25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CD169-APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>346007</td>
			<td>Dilution factor: 1:25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CD206-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>321106</td>
			<td>Dilution factor: 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CD209-PE-CY7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>3310114</td>
			<td>Dilution factor: 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CD274-PE-CY7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>329718</td>
			<td>Dilution factor: 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CD43-PE</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>10854419</td>
			<td>Dilution factor: 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CD45-APC</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>15577936</td>
			<td>Dilution factor: 1:20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CD86-APC</td>
			<td style="width:149px;">Biolegend</td>
			<td>305412</td>
			<td>Dilution factor: 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CD93-PE</td>
			<td style="width:149px;">Ebioscience</td>
			<td>10804637</td>
			<td>Dilution factor: 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody CX3CR1-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>307650</td>
			<td>Dilution factor: 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody HLA-DR-BV650</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>307650</td>
			<td>Dilution factor: 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antiboy CD115-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>347308</td>
			<td>Dilution factor: 1:40</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Dissociation Buffer, enzyme free</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>13151014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Dissociation Buffer, enzyme-free, PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13151014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6055302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellMask Deep Red Plasma Membrane Stain</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C10046</td>
			<td>Cryopreservation media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryostor CS10</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CTS CELLstart Substrate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1014201</td>
			<td>Stem cell substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td>Final concentration 1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS, calcium, magnesium (500ml)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14040091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FcR Blocking Reagent, human</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td colspan="2">130-059-901</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>PHG0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Recombinant IFNY</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14-8319-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Serum Albuminum</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharide (LPS) from E. Coli</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NucBlue (Hoechst33342)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate for Phagocytosis</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P35365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Porcine Skin Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human BMP4 Protein</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>314-BP-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human IL10</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human IL3</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>200-03-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human IL4</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>200-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human MCSF (carrier-free) 100ug</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>574806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human VEGF Protein</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>293-VE-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rock Inhibitor Y-27632</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SCM075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SCF (C-Kit Ligand) Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>PHC2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StemPro hESC SFM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A1000701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StemPro EZPassage Disposable Stem Cell Passaging Tool</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>23181010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultralow attachment plates: Cell culture multi-well plate, 6 well, cell star cell repellent surface</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>657970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Vivo 15 500 mL bottle</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE02-060F</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells

Makrofager er tilstede i de fleste virveldyrvev og består av vidt spredte og heterogene cellepopulasjoner med forskjellige funksjoner. De er sentrale aktører i helse og sykdom, fungerer som phagocytes under immunforsvar og mediering trofisk, vedlikehold, og reparasjon funksjoner. Selv om det har vært mulig å studere noen av de molekylære prosessene som er involvert i menneskelig makrofagfunksjon, har det vist seg vanskelig å anvende gentekniske teknikker på primære menneskelige makrofager. Dette har betydelig hindret vår evne til å avhøre de komplekse genetiske veiene som er involvert i makrofagbiologi og å generere modeller for spesifikke sykdomstilstander. En off-the-shelf kilde til menneskelige makrofager som er mottagelig for det store arsenalet av genetiske manipulasjonsteknikker, vil derfor gi et verdifullt verktøy på dette feltet. Vi presenterer en optimalisert protokoll som gjør det mulig for generering av makrofager fra humane induserte pluripotente stamceller (iPSCer) in vitro. Disse iPSC-avledede makrofagene (iPSC-DMs) uttrykker menneskelige makrofagcelleoverflatemarkører, inkludert CD45, 25F9, CD163 og CD169, og vår funksjonelle analyse av live-cellebilder viser at de viser robust fagocytisk aktivitet. Kultiverte iPSC-DMs kan aktiveres til forskjellige makrofagtilstander som viser endret genuttrykk og fagocytisk aktivitet ved tillegg av LPS og IFNg, IL4 eller IL10. Dermed gir dette systemet en plattform for å generere menneskelige makrofager som bærer genetiske endringer som modellerer spesifikk menneskelig sykdom og en kilde til celler for legemiddelscreening eller celleterapi for å behandle disse sykdommene.

Differensieringsprogresjon, makrofagnummer og morfologi Resultatene som presenteres er fra differensiering av SFCi55 human iPSC linje som har blitt beskrevet og brukt i en rekke studier8,9,10,26. Prosessen med IPSC differensiering mot makrofager kan overvåkes av optisk mikroskopi. iPSC-kolonier, embryoide legemer (EBs), hematopoetiske suspensjonsceller og modne makrofager var morfologisk forskjellige (Figur 2A). Eldre makrofagmorfologi kan ytterligere valideres ved farging av sentrifugerte cytospinnpreparater. IPSC-avledede makrofager var store, og hadde enkle små ovale kjerner og rikelig cytoplasma som inneholdt mange vesikler (figur 2B).
De første 2 ukene med hematopoietiske suspensjonceller høster (dag 16–28) av en full 6 brønnplate av EB inneholdt i gjennomsnitt 2,59 x 106 ± 0,54 celler. Etter dag 28 ble det i gjennomsnitt produsert 4,64 x 106 ± 0,94 suspensjonsceller per 6 brønnplate av EB-er. Fra dag 80 og utover begynte antall suspensjonsceller å falle etter hvert som EB-ene ble oppbrukt (figur 2C). Det anbefales å stoppe differensieringsprotokollen etter at tallene faller under 3 x 106 forløpere per høst per 6 brønnplate av EB-er.
IPSC-avledet makrofagcellemarkører uttrykk Flow cytometri er fortsatt den vanligste metoden som brukes til å vurdere fenotypen av humane makrofager. Gating strategien for å vurdere celle overflate markør uttrykk består av gating hovedpopulasjonen av celler ved hjelp av fysiske parametere som størrelse og granularity, etterfulgt av gating enkeltceller og deretter levende celler (Figur 3A). Modne iPSC-avledede makrofager bør uttrykke linjemarkøren CD45 og makrofagmodningsmarkør 25F9, og være negativ for monocytt/umoden makrofagmarkør CD93. Dette er i samsvar med våre observasjoner (figur 3A). IPSC-avledede makrofager var også positive for avstamning myeloid markører CD11b, CD14, CD43, CD64, CD115, CD163, og CD169 (Figur 3B). De var positive for immunmoduleringsmarkør CD86, og en liten andel av dem uttrykte chemokinreseptorer CX3CR1, CCR2, CCR5 og CCR8 ved naiv tilstand (figur 3B). Tomtene ble hentet fra data som tidligere ble publisert av vårt laboratorium8.
iPSC-avledede makrofager fagocytose og polarisering En av de viktigste funksjonene i makrofager i vertsforsvar og vev homeostase er deres evne til fagocytose patogener, apoptotiske celler og rusk27. Frekvensen av fagocytose er nært forbundet med spesifikke fenotypiske tilstander28. For å evaluere iPSC-DM fagocytisk evne, brukte vi et høyinnholdsbildesystem tilnærming8,9,11 som gjør bruk av PerkinElmer Operetta Microscope og pHrodo Zymosan biopartikler (pH-sensitive fargekonjugater). Biopartikler var ikke fluorescerende når de ble tilsatt kulturene (figur 4A), men fluorescert lys grønn i den intracellulære sure pH (Figur 4B). Operetta-mikroskopet ble satt til bilde hvert 5. En høy gjennomstrømning og objektiv bildeanalyserørledning ble deretter brukt i Columbus-plattformen for å kvantifisere aktivitet når det gjelder den fagocytiske fraksjonen som representerer andelen celler som fagocytosed perler og fagocytisk indeks som er et mål på antall perler som hver celle inntok.
Makrofager kan reagere og endre fenotypen avhengig av miljøsignaler. For å vurdere deres evne til å reagere og endre på miljøstimuli, kan iPSC-DMs behandles med LPS og IFNg, IL4 eller IL10. Etter 48 timer behandling endret de fenotype, heri referert til som M (LPS + IFNg), M (IL4) og M (IL10), henholdsvis29. Analyse av genuttrykk er et nyttig verktøy for å teste polariseringsstatusen til makrofager. Ved LPS- og IFNg-stimulering er makrofager oppregulert mRNA-uttrykk for gener CD40, VCAM1og TNFA (Figur 5A). Ved IL4 stimulering, celler upregulated mRNA uttrykk for gener CD68, CD84,og MRC1 (Figur 5B). Ved IL10 stimulering, iPSC-DMs upregulated uttrykk for MRC1 (Figur 5B). Når det gjelder fagocytose, viste makrofager behandlet med LPS + IFNg eller IL4 en signifikant lavere prosentandel av fagocytiske celler sammenlignet med naive makrofager. iPSC-DMs behandlet med IL10 viste en økt prosentandel av fagocytiske celler og fagocytisk indeks (Figur 5C–E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61038/61038fig1.jpg"> Figur 1: Grafisk sammendrag av iPSC-differensiering til modne funksjonelle makrofager. Diagram tegnet med Biorender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61038/61038fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61038/61038fig2.jpg"> Figur 2: iPSC-differensiering mot makrofager og iPSC-DM-nummer og morfologi. (A) Bright Field-bilder hentet fra (venstre til høyre): en IPSC-koloni, embryoidlegemer (EB), høstede fjæringsceller og modne makrofager. Skalabar = 100 μm. (B) Bilde av makrofag cytospins farget med Kwik-diff kit. Skalabar = 25 μm. (C) Antall suspensjonceller samlet inn per høst per 6 brønnplate av EB. Tomten viser bety + SEM; (n = 6 biologisk uavhengige eksperimenter). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61038/61038fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61038/61038fig3.jpg"> Figur 3: Makrofagcelleoverflatemarkør fenotype. (A) Gating strategi for analyse av modne iPSC-avledede makrofager. Enkelt, levende celler ble inngjerdet, deretter analysert for uttrykk for celle overflate markører CD45, CD93, og 25F9. Porter for celleoverflatemarkørene ble trukket ved hjelp av fluorescens minus en (FMO) kontroller. (B) Representative flow cytometri histogrammer for enkeltflekker av iPSC-DMs (blå) og isotype kontroller (grå) for avstamning og myeloid markører, immun-modulasjon markører, modning markører, og chemokinreseptorer. Tomter er representative for n = 5 biologisk uavhengige eksperimenter for alle avstamning og myelogen markører, unntatt CD105 og CD206 (n = 3); modningsmarkører (n = 5); immunmoduleringsmarkører (n = 3); og chemokinreseptorer (n = 3). Tomter bruker tidligere publiserte data8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61038/61038fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61038/61038fig4.jpg"> Figur 4: IPSC-DM polarisering og fagocytose analyser. Representative bilder av iPSC-DMs (A) umiddelbart etter tilsetning av Zymosan pHrodo grønne perler og (B) 175 min etter tilsetning av perler. Blå representerer cellenes kjerner; rødt representerer cellenes cytoplasma. Grønn representerer inntatte perler (Skalabar = 20 μm). (C) Brøkdel av fagocytiske makrofager og (D) fagocytisk indeks/grønn intensitet per fagocytisk makrofag over tid i naiv tilstand (n = 6 biologisk uavhengige eksperimenter). Plott viser gjennomsnittsverdien, og stolpene representerer SEM. Tomter bruker tidligere publiserte data8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61038/61038fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61038/61038fig5.jpg"> Figur 5: Evaluering av iPSC-DM polariseringstilstander. Relativ kvantifisering av RT-PCR-analyser av naive og polariserte iPSC-DMs for å vurdere uttrykket av (A) M(LPS + IFNΥ); (B) M(IL4) og M (IL10)-tilknyttede gener (n = 6 biologisk uavhengige eksperimenter; Enveis ANOVA og Holm-Sidak sto for flere sammenligninger etter testen. Polariserte grupper ble statistisk sammenlignet med den naive gruppen). Plott viser gjennomsnittsverdien, og feilfeltene representerer standardavviket. ND i tomter = transkripsjon ikke oppdaget. Data for disse plottene ble tidligere publisert8. (C) Representative bilder av iPSC-DMs 175 min etter tilsetning av pHrodo perler fra iPSC-DMs behandlet med (venstre til høyre): ingen cytokiner, LPS + IFN-Y, IL-4, og IL-10 (Scale bar = 20 μm). (D) Fraksjon av fagocytiske makrofager og (E) fagocytisk indeks/ grønn intensitet per fagocytisk makrofag i naiv og polarisert makrofag behandlinger 175 min etter tilsetning av perler (n = 12 biologisk uavhengige eksperimenter, enveis ANOVA og Holm-Sidak flere sammenligninger etter test. Polariserte grupper ble statistisk sammenlignet med den naive gruppen). Plott viser gjennomsnittsverdien, og feilfeltene representerer standardavviket (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61038/61038fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production and Characterization of Human Macrophages from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Production and Characterization of Human Macrophages from Pluripotent Stem Cells

Denne protokollen beskriver den robuste generasjonen makrofager fra humane induserte pluripotente stamceller, og metoder for deres påfølgende karakterisering. Celleoverflatemarkøruttrykk, genuttrykk og funksjonelle analyser brukes til å vurdere fenotypen og funksjonen til disse iPSC-avledede makrofagene.

Produksjon og karakterisering av humane makrofager fra pluripotente stamceller

Macrophages are present in most vertebrate tissues and comprise widely dispersed and heterogeneous cell populations with different functions. They are key ...

Forskning på menneskelig makrofagbiologi har vært begrenset fordi den er avhengig av å samle celler fra givere. Denne protokollen viser en metode der vi kan produsere menneskelige makrofager fra pluripotente stamceller i laboratoriet. Dette er en robust protokoll som kan skaleres opp for å produsere makrofager i store mengder for celleterapi eller forskning.Pluripotente stamceller kan manipuleres genetisk. Så i denne protokollen kan vi generere makrofager med en bestemt fenotype, fluorescerende koder, og også makrofager for å modellere sykdomsstater. Visuell demonstrasjon av denne protokollen er nyttig fordi bruken av det enkle passasjeverktøyet ikke vil være kjent for mange forskere.Også nivået av omsorg som trengs når du fyller opp medier og høster celler er vanskelig å sette ord på. Når de kultiverte cellene har nådd 80% samløpet, erstatt det brukte kulturmediet med 1,5 milliliter friskt medium. Hold kulturfartøyet i den ene hånden, rull et engangscellepassagingsverktøy over platen i en retning.Alle bladene i valsen må berøre platen. Oppretthold jevntrykk mens du ruller. Gjenta rulle i samme retning til hele brønnen er dekket.Roter kulturfartøyet 90 grader og gjenta rullende. Med en steril pipette, bruk media i brønnen for å løsne kutte kolonier. Aspirer CELLstart og bytt ut medier.Overfør celler med ett-til-fire-forhold til pre-coated brønner tilberedt som beskrevet i manuskriptet. For å starte differensieringsprosessen på dag null, legg til 2,25 milliliter trinn ett media i to brønner av en ultrallyd vedlegg seksbrønns plate. Deretter for en 80% sammenføyd brønn av iPSCer i en seks-brønns plate, erstatte vedlikeholdsmediet med 1,5 milliliter trinn ett media.Klipp kolonier ved hjelp av et nytt cellepassagingsverktøy. Ved hjelp av en pipette, overføre de kuttede koloniene til de to brønnene i ultra lav vedlegg seks-brønns plate. På dag to justerer du cytokinkonsentrasjonene ved å tilsette 0,5 milliliter hESC SFM-medier til seksbrønnsplaten som inneholder de to embryoide kroppene.På dag fire, pels fire brønner av en seks-brønns vev kultur plate med 0,1% gelatin. Etter inkubering i minst 10 minutter, fjern gelatinen og tilsett 2,5 milliliter stadium to medier. Samle dannet embryolegemer fra de to brønnene av en seks-brønns plate og legg dem i en 50 milliliter sentrifuge rør.La dem bosette seg på bunnen av røret ved tyngdekraften. Deretter aspirerer du forsiktig mediene fra røret og gjenbruker embryolegemene i to milliliter av trinn to medier. Overfør 10 til 15 embryolegemer til en gelatinbelagt brønn som inneholder 2,5 milliliter av trinn to medier og inkuber ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid.I to til tre uker, endre media hver tredje til fire dager. Plating av EBs er avgjørende. Å ha færre enn 10 eller mer enn 15 EBer eller å ha dem ujevnt fordelt kan føre til lave utbytter av makrofager.Etter to til tre uker begynner embryoide organer å slippe ut ikke-adhemor hematopoetiske celler i suspensjon. Bruk en 40 mikrometersil, samle disse cellene i et 50 milliliter rør og deretter fylle opp mediet. Sentrifuger suspensjonen av hematopoetiske celler ved 200 ganger g i tre minutter.Resuspend de hematopoetiske cellene i trinn tre medier. Deretter plate cellene med en tetthet på 0,2 ganger 10 til de sjette cellene per milliliter. Endre trinn tre medier hver femte dag.Etter ni til 11 dager vil makrofagene være fullt differensiert og fullt funksjonelle. Legg åtte ganger 10 til fjerde iPSC-avledede makrofager i 200 mikroliter av trinn tre medier til hver brønn av en 96-brønns plate. Tilsett 100 mikroliter perleløsning til hver brønn som inneholder iPSC-avledede makrofager.Bruk et bildesystem med høyt innhold til å bilde av platen. Få tre eller flere felt på tvers av hver brønn for å få en god representasjon. iPSC-kolonier, embryolegemer, hematopoetiske suspensjonsceller og modne makrofager var morfologisk forskjellige.iPSC-avledede makrofager var store, hadde enkle små ovale kjerner og hadde rikelig cytoplasma som inneholdt mange vesikler. Makrofag fenotype ble vurdert ved strømningscytometri. Modne iPSC-avledede makrofager uttrykte avstamningsmarkøren CD45 og makrofagmodningsmarkøren 25F9 og var negative for monocytt umoden makrofagmarkør CD93.iPSC-avledede makrofager uttrykte flere lineage myeloid markører og var positive for immunmodulasjonsmarkør CD86. En liten andel av makrofagene uttrykte chemokinreseptorer CX3CR1, CCR2, CCR5 og CCR8. iPSC-DM phagocytic evne ble evaluert ved hjelp av biopartikler og et høyinnhold bildebehandlingssystem.Biopartikler var ikke-fluoreserende når de ble lagt til makrofagkulturene, men etter fagocytose fluorescerer lysegrønne i intracellulær sur pH. Den fagocytiske fraksjonen representerer andelen makrofager som fagocytosed biopartikler og fagocytisk indeks er målet på antall biopartikler som hver makrofag inntok. Makrofager kan endre fenotype som svar på miljøsignaler.RT-PCR ble brukt til å kvantifisere oppregulert mRNA uttrykk for gener. Makrofager behandlet med LPS og interferon gamma eller IL4 viste en betydelig lavere prosentandel av fagocytiske celler sammenlignet med naive makrofager. Makrofager behandlet med IL10 viste en økt prosentandel av fagocytiske celler og en økt fagocytisk indeks.Denne protokollen kan brukes til å gi en off-the-shelf kilde til celler for å behandle sykdommer som kronisk leversykdom der makrofager har vist seg å være terapeutisk i dyremodeller. iPSC-avledede makrofager kan brukes til å studere makrofager forbundet med flere sykdomsstater. For eksempel bruker vi disse cellene til å studere makrofager forbundet med svulster i brystkreft.Vi har endret fenotypen av iPSC-avledede makrofager ved genetisk programmering ved hjelp av en enkelt transkripsjonsfaktor kalt KLF1. Med dette produserte vi makrofager som ser ut som erythroide øymakrofager, og de har gitt innsikt i produksjon og modning av røde blodlegemer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Isolering og karakterisering av dendrittiske celler og makrofager fra musen Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Avledning av T-celler<em&gt; In Vitro</em&gt; Fra Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

Vurdering av Immunmodulerende Properties of Human stamceller (MSC)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

Funksjonell karakterisering av regulatoriske makrofager som hemmer graft-reaktiv immunitet

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Fenotypisk Karakterisering av makrofager fra Rat Nyre ved flowcytometri

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

SILAC basert proteomikk Karakterisering av Exosomes fra HIV-1 infiserte celler

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Isolering og karakterisering rensing av makrofager fra vev av fedme-relaterte betennelse

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolasjon av Salmonella typhimurium-som inneholder Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells

Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells

Meningococcal meningitis is a life-threatening infection that occurs when Neisseria meningitidis (meningococcus, Nm) can gain access to the central ...