Name: application of atomic force microscopy to detect early osteoarthritis
Uploaded: 2020-05-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis at JoVE.com

نشكر المؤلفين المشاركين من المنشور الأصلي على مساعدتهم ودعمهم.

تم الحصول على عينات الغضاريف البشرية من المرضى الذين يخضعون لرأب مفصل الركبة الكلي في قسم جراحة العظام في المستشفى الجامعي في توبنغن، ألمانيا، ومستشفى وينجهوفر، روتنبورغ a.N.، ألمانيا، لنهاية المرحلة OA من الركبة. تم الحصول على موافقة كاملة من الإدارات والمؤسسات واللجنة الأخلاقية المحلية ...

<ol>
	<li>Guilak, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pericellular+matrix+as+a+transducer+of+biomechanical+and+biochemical+signals+in+articular+cartilage.">The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).</li><li>Peters, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protective+role+of+the+pericellular+matrix+in+chondrocyte+apoptosis.">The protective role of the pericellular matrix in chondrocyte apoptosis.</a> Tissue Engineering Part A. 17 (15-16), 2017-2024 (2011).</li><li>Larson, C. M., Kelley, S. S., Blackwood, A. D., Banes, A. J., Lee, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+of+the+native+chondrocyte+pericellular+matrix+results+in+significantly+improved+matrix+production.">Retention of the native chondrocyte pericellular matrix results in significantly improved matrix production.</a> Matrix Biology. 21 (4), 349-359 (2002).</li><li>Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+horizontal+patterns+in+the+spatial+organization+of+superficial+zone+chondrocytes+of+human+joints.">Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints.</a> Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).</li><li>Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontally+oriented+clusters+of+multiple+chondrons+in+the+superficial+zone+of+ankle,+but+not+knee+articular+cartilage.">Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage.</a> The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).</li><li>Rolauffs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+preclinical+osteoarthritis:+the+angular+spatial+organization+permits+early+diagnosis.">Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis.</a> Arthritis Rheumatology. 63 (6), 1637-1647 (2011).</li><li>Maver, U., Velnar, T., Gaber&#353;&#269;ek, M., Planin&#353;ek, O., Fin&#353;gar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progressive+use+of+atomic+force+microscopy+in+biomedical+applications.">Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 80, 96-111 (2016).</li><li>Polini, A., Yang, F., Ramalingam, M., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+characterization+of+nanofiber+composites.">Physicochemical characterization of nanofiber composites.</a> Nanofiber Composites for Biomedical Applications. , 97-115 (2017).</li><li>Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+biomechanical+properties+of+the+extracellular+and+pericellular+matrix+and+their+interconnection+throughout+the+course+of+osteoarthritis.">Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis.</a> Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).</li><li>Danalache, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+stiffness+and+biochemical+composition+of+the+pericellular+matrix+as+a+function+of+spatial+chondrocyte+organisation+in+osteoarthritic+cartilage.">Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).</li><li>Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+strategies+for+automated+AFM+force+curve+analysis--I.+Non-adhesive+indentation+of+soft,+inhomogeneous+materials.">Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).</li><li>Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+properties+of+human+mesenchymally-derived+stem+cells+and+primary+osteoblasts,+chondrocytes,+and+adipocytes.">Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes.</a> Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).</li><li>Thambyah, A., Nather, A., Goh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+articular+cartilage+covered+by+the+meniscus.">Mechanical properties of articular cartilage covered by the meniscus.</a> Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 580-588 (2006).</li><li>Choi, A. P., Zheng, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+Young's+modulus+and+Poisson's+ratio+of+soft+tissue+from+indentation+using+two+different-sized+indentors:+finite+element+analysis+of+the+finite+deformation+effect.">Estimation of Young's modulus and Poisson's ratio of soft tissue from indentation using two different-sized indentors: finite element analysis of the finite deformation effect.</a> Medical Biological Engineering Computing. 43 (2), 258-264 (2005).</li><li>Jin, H., Lewis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Poisson's+ratio+of+articular+cartilage+by+indentation+using+different-sized+indenters.">Determination of Poisson's ratio of articular cartilage by indentation using different-sized indenters.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 126 (2), 138-145 (2004).</li></ol>

باستخدام AFM كتقنية جديدة وقوية لقياس الخصائص الميكانيكية الحيوية للمواد البيولوجية على مستوى النانو، قمنا بقياس الخصائص المرنة لـ ECM و PCM في الغضروف المفصلي لهشاشة العظام البشرية. تم اختيار عينات الغضاريف وفقًا لنمطها المكاني السائد في منظمة chondrocyte كعلامة بيولوجية قائمة على الصور لانحطا?...

الغضروف المفصلي هو نسيج وعائي وعصبي. تنتج chondrocytes المتناثرة بشكل متفرق ، وتنظم ، وتحافظ على مصفوفة خارج الخلية توسعية (ECM) التي يتم تضمينها فيها. كجزء متميز ومتخصص من ECM ، تحيط chondrocytes بطبقة رقيقة من المصفوفة المتخصصة المعروفة باسم المصفوفة المحيطة بالخلية (PCM). PCM بمثابة واجهة الخلية مصفوفة الميشانوحساس1 الذي يحمي chondrocytes2 وتعدل استجابتها biosynthetic3. كما وصف سابقا4، في غضروف صحي ، يتم ترتيب chondrocytes في أنماط مكانية محددة ومتميزة محددة لكل طبقة نسيج ومشترك4،5 وتعتمد على آليات التحميل الميكانيكية الخاصة بالمفاصل6. تتغير هذه الأنماط من الأزواج والسلاسل في الغضروف الصحي إلى سلاسل مزدوجة مع بداية هشاشة العظام (OA). مع مزيد من التقدم للمرض تشكل chondrocytes مجموعات صغيرة ، وزيادة تدريجية في الحجم إلى مجموعات كبيرة في OA المتقدمة. ويلاحظ فقدان كامل لأي هيكل تنظيمي وتحريض المبرمج في نهاية المرحلة OA. وهكذا، يمكن استخدام ترتيب الخلوية chondrocyte كعلامة بيولوجية على أساس الصورة للتقدم OA4.
الخصائص الميكانيكية الحيوية للخلايا والأنسجة ليس فقط تنظيم شكلها ووظيفتها ولكن أيضا حاسمة للحفاظ على حيويتها. يمكن أن تنتشر التغيرات في المرونة أو تؤدي إلى ظهور أمراض رئيسية مثل السرطان أو OA. وقد برز المجهر القوة الذرية كأداة قوية لتوصيف الخصائص الميكانيكية الحيوية للهياكل المستهدفة البيولوجية المحددة على نطاق مجهري، وقياس مجموعة واسعة من القوة، من بيكونيوتن إلى الميكرونيوتن. التطبيق الرئيسي للAFM هو قياس التضاريس السطحية والخصائص الميكانيكية للعينات في قرار مقياس تحت النانو7. يتكون جهاز القياس من ثلاثة مكونات رئيسية: 1) مسبار AFM ، وهو عبارة عن طرف حاد مثبت على الكانتيليفر ويستخدم للتفاعل المباشر مع سطح العينة. عندما يتم تطبيق القوة على cantilever ، يحدث تشوه هذا الأخير وفقًا لخصائص الأنسجة المقاسة. 2) نظام بصري أن المشاريع شعاع الليزر على cantilever، والتي تنعكس بعد ذلك إلى وحدة كاشف. 3) كاشف الديويدي الضوئية التي تلتقط الضوء منحرفة من cantilever. فإنه يحول المعلومات الواردة بشأن انحراف الليزر من قبل cantilever إلى منحنى القوة التي يمكن تحليلها.
وبالتالي، فإن المبدأ الرئيسي للإدارة الاستراتيجية هو الكشف عن القوة التي تعمل بين مسبار AFM والهيكل المستهدف للعينة. المنحنيات قوة حصلت وصف الخصائص الميكانيكية للهياكل المستهدفة على سطح العينة مثل مرونة، وتوزيع الشحن، المغناطيسية، والإجهاد العائد، ومرونة ديناميات تشوه البلاستيك8. ميزة هامة من AFM على تقنيات التصوير الأخرى هو أن AFM يمكن استخدامها لقياس الخصائص الميكانيكية للخلايا الحية في متوسطة أو أنسجة في حالة أصلية دون إتلاف الأنسجة. يمكن أن تعمل AFM في ظروف سائلة أو جافة. لا يوجد أي شرط لإعداد العينة. يوفر AFM إمكانية صورة عينة وقياس خصائصها الميكانيكية في وقت واحد في العينات القريبة من الظروف الفسيولوجية. في هذه الدراسة وصفنا نهجا جديدا لتقييم تطور OA من خلال قياس مرونة PCM وECM في الغضروف المفصلي الأصلي. إن ارتباط التنظيم المكاني للتشوندروكوتس بدرجة انحطاط الأنسجة المحلية يوفر منظورًا جديدًا تمامًا للكشف المبكر عن OA. بيد أن الأهمية الوظيفية لهذه الأنماط لم تقيَّم حتى الآن. لأن الوظيفة الرئيسية للغضروف المفصلي هو الحمل تحمل في احتكاك منخفض، يجب أن تمتلك الأنسجة خصائص مرنة. AFM يسمح قياس ليس فقط مرونة ECM ولكن أيضا من الأنماط الخلوية المكانية جزءا لا يتجزأ من PCM بهم. الارتباط الملحوظ للمرونة مع تغيير النمط المكاني للchondrocytes قوي لدرجة أن قياس المرونة وحدها قد يسمح بالتقسيم الطبقي لانحطاط الأنسجة المحلية.
تم تقييم مودولي مرن ة من PCM و ECM في 35 ميكرومتر رقيقة المقاطع باستخدام نظام AFM متكاملة في مجهر تباين المرحلة المقلوبة التي سمحت التصور في وقت واحد من عينة الغضاريف. ويستند هذا البروتوكول على دراسة نشرت بالفعل من مختبرنا9 ويصف على وجه التحديد كيفية توصيف الترتيب المكاني للchondrocytes وكيفية قياس مرونة PCM المرتبطة بها وECM. مع كل تغيير نمط من chondrocytes، يمكن أيضا ملاحظة تغييرات كبيرة في مرونة لكل من PCM وECM، مما يسمح لهذه التقنية لاستخدامها لقياس مباشرة مرحلة انحطاط الغضاريف.
يفتح هذا النهج المعتمد طريقة جديدة لتقييم تطور OA والآثار العلاجية في المراحل المبكرة قبل أن يبدأ تدهور الأنسجة العيانية في الظهور فعليًا. إن إجراء قياسات AFM باستمرار عملية شاقة. في البروتوكول التالي، نصف كيفية إعداد العينة التي سيتم قياسها بواسطة AFM، وكيفية إجراء قياسات AFM الفعلية بدءًا من إعداد الكانتيليفر، وكيفية معايرة AFM، ثم كيفية إجراء القياسات. وتعطي التعليمات خطوة بخطوة نهجا واضحا وموجزا للحصول على بيانات موثوقة وتوفير استراتيجيات أساسية لمعالجتها وتفسيرها. يصف قسم المناقشة أيضًا المزالق الأكثر شيوعًا لهذه الطريقة الصارمة ويوفر نصائح مفيدة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscope (AFM)</td>
			<td>CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM head</td>
			<td>(CellHesion 200) JPK</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocompatible sample glue</td>
			<td>JPK Instruments AG, Berlin, Germany</td>
			<td>H000033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever</td>
			<td>tip C, k &#188; 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria</td>
			<td>AIO-TL-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)</td>
			<td>AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany</td>
			<td>L201306_03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium without L-glutamine</td>
			<td>(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)</td>
			<td>F1315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>07313-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater associated with AFM</td>
			<td>JPK Instruments AG, Berlin, Germany</td>
			<td>T-05-0117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>2023-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td>TPP93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands</td>
			<td>SA6255012</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of atomic force microscopy to detect early osteoarthritis

الخصائص الميكانيكية الحيوية للخلايا والأنسجة ليس فقط تنظيم شكلها ووظيفتها ولكن أيضا حاسمة للحفاظ على حيويتها. يمكن أن تنتشر التغيرات في المرونة أو تؤدي إلى ظهور أمراض رئيسية مثل السرطان أو هشاشة العظام (OA). وقد برز المجهر القوة الذرية (AFM) كأداة قوية لتوصيف الخصائص الميكانيكية الحيوية للهياكل المستهدفة البيولوجية المحددة على نطاق مجهري، وقياس القوى في نطاق صغير مثل بيكونيوتن إلى ميكرونيوتن. خصائص البيوميكانيكية ذات أهمية خاصة في الأنسجة العضلية الهيكلية، والتي تتعرض لمستويات عالية من الإجهاد. OA كمرض تنكسي من الغضروف يؤدي إلى تعطيل المصفوفة المحيطة بالخلية (PCM) وإعادة ترتيب المكانية من chondrocytes جزءا لا يتجزأ من مصفوفة خارج الخلية (ECM). وقد ارتبط اضطراب في PCM وECM مع تغييرات في الخصائص الميكانيكية الحيوية للغضاريف. في هذه الدراسة استخدمنا AFM لقياس هذه التغيرات فيما يتعلق بتغيرات النمط المكاني المحددة للشوندروكويت. ومع كل تغير في النمط، لوحظت تغيرات كبيرة في المرونة بالنسبة لكل من PCM وECM. وبالتالي فإن قياس المرونة المحلية يسمح باستخلاص استنتاجات مباشرة حول درجة انحطاط الأنسجة المحلية في OA.

على طول النموذج physiopathological من السلاسل إلى سلاسل مزدوجة ، إلى صغيرة وأخيرا إلى مجموعات كبيرة ، كل من ECM(الشكل 3A)وPCM(الشكل 3B)مودولي مرنة انخفضت بشكل كبير بين كل تغيير نمط. الاستثناء الوحيد كان الفرق في ECM بين السلاسل والسلاسل المزدوجة (p = 0.072). تظهر النتائج أن نسبة...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis at JoVE.com

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

نحن نقدم طريقة للتحقيق في التغيرات المبكرة هشاشة العظام على المستوى الخلوي في الغضروف المفصلي باستخدام المجهر القوة الذرية (AFM).

تطبيق المجهر القوة الذرية للكشف عن هشاشة العظام في وقت مبكر

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

تنظم الخصائص البيوميكانيكية للخلايا والأنسجة وظيفتها وحيويتها. AFM يسمح القياس الكمي المبكر للهشاشة العظمية على المستوى الخلوي على أساس قياسات المرونة. AFM يسمح عمليات الاستحواذ على القياسات على مستوى خلوي دون الإضرار بالعينة وبدقة عالية، وموثوقية، وحساسية.تحدث التغيرات في الممتلكات الميكانيكية الحيوية في وقت مبكر من هشاشة العظام. قياس المرونة المحلية للغضاريف المفصلية يسمح استخلاص استنتاجات صحيحة حول درجة انحطاط الأنسجة المحلية. لتقييم التغيرات التنكسية داخل مفصل الركبة البشرية، استخدم أولاً مشرطًا لقطع الغضروف المفصلي ككل من العظام تحت الصدرية وتضمين عينة الغضاريف في وسط تضمين قابل للذوبان في الماء على مقبض Cryotome الذي يتجمد تحت درجة حرارة منخفضة في جهاز Cryotome.عندما تكون العينة قد جمدت، استخدم Cryotome القياسية للحصول على 35 ميكرومتر سميكة أجزاء من الأنسجة من الطبقة العليا من الغضروف المفصلي، وجمع كل قسم على الشرائح الزجاجية الفردية. عندما يتم الحصول على جميع الأقسام ، شطف العينات ثلاث مرات في PBS الطازجة لمدة خمس دقائق لكل غسل لإزالة وسيط التضمين القابل للذوبان في الماء. إزالة الشريحة الأولى من غسل.بعد ذلك، أضف إلى اثنين إلى ثلاث قطرات من الغراء عينة متوافقة بيولوجيا في القسم الواحد في أطباق بيتري متوافقة مع AFM الفردية. إزالة أي حل الزائدة من العينة واضغط بلطف على حواف القسم المجفف على بقع الغراء. بعد دقيقتين، قم بتغطية الأنسجة المستعبدة بعناية باستخدام متوسط L-15 من Leibovitz بدون L-الجلوتامين ووضع الأطباق في حاضنة لثقافة الخلايا حتى يتم تحليل العينات.لإعداد جهاز AFM، ضبط كتلة الغاز لقياس في بيئة سائلة على حامل AFM إلى أن السطح العلوي موازية لحامل، واستخدام ملاقط لتركيب بعناية cantilever مختارة على سطح كتلة الزجاج بحيث تلميح AFM مع microsphere يبرز على الطائرة البصرية مصقول. لتحقيق الاستقرار في النتليفر على الكتلة الزجاجية، حرك الربيع المعدني في أخدود الكتلة، واستخدم الملاقط لتضييق الخناق على الجزء العلوي من النتليفر مع الربيع. ضع الكتلة الزجاجية بعناية مع الـ cantilever على رأس AFM وقم بتأمين الكتلة مع آلية القفل المتكاملة.ثم قم بتركيب رأس AFM مع الـ cantilever على جهاز AFM مع مواجهة الربيع إلى اليسار. لتركيب العينة على جهاز AFM، ضع طبق بيتري عينة على حامل عينة AFM وتعيين سخان طبق بيتري إلى 37 درجة مئوية. بعد حوالي 20 دقيقة، افتح برنامج الجهاز ومحاذاة الليزر ويندوز إعداد معلمة النهج.بعد ذلك، بدوره على المحرك السائر، والضوء الليزر، وكاميرا CCD واستخدام وظيفة المحرك السائر لخفض cantilever في 100 micrometer الخطوات حتى يتم غمر تماما cantilever في الوسط. استخدام مسامير التكيف لتوجيه الليزر على رأس cantilever واستخدام مسامير الجهاز AFM لضبط شعاع الليزر بحيث يقع شعاع ينعكس على مركز ضوئي. مرة واحدة تم تعديل كانتيليف الليزر، ضبط الضوئية حسب الضرورة لتعيين إشارة المجموع إلى فولت واحد أو أعلى والانحرافات الجانبي والرأسي إلى ما يقرب من الصفر.للحصول على منحنى قوة المعايرة، قم بتشغيل نهج الماسح الضوئي مع معلمات النهج كما هو موضح في الجدول. بمجرد الوصول إلى الجزء السفلي من طبق ثقافة الأنسجة ، تراجع عن المكنتر من قبل 100 ميكرومتر. قم بإعداد معلمات التشغيل كما هو موضح في الجدول.وانقر تشغيل لبدء القياس والحصول على منحنى المسافة قوة المعايرة. يتم الحصول على منحنى القوة كما هو موضح في الشكل. في منحنى مسافة قوة المعايرة، حدد المنطقة لاحتواء خطي للمنحنى المتراجع.مرة واحدة تناسب خطي في مكان، سيتم حفظ القيم من قبل البرنامج. ثم كما يتم تنفيذ القياسات في المتوسط في درجة حرارة 37 درجة مئوية، تعيين متغير درجة الحرارة في البرنامج إلى 37 درجة لمحاكاة الظروف الفسيولوجية بأكبر قدر ممكن. لتحديد أنماط conversite في أقسام عينة الغضاريف، وتحديد وتحديد الأنماط الخلوية المحددة للغضاريف المفصلية من الركبة العظمية على المجهر النقيض المرحلة، والتي قد تشمل سلاسل واحدة تدل على مناطق الأنسجة السليمة، والسلاسل المزدوجة التي تدل على بداية انحطاط الأنسجة، ومجموعات صغيرة، والتي هي علامات على انحطاط الأنسجة المتقدمة، ومجموعات كبيرة، تدل على تدمير الأنسجة في نهاية المرحلة.وبمجرد تحديد نمط معين مطلوب، لوضع قياسات المصفوفة ال pericellular، و cantilever على مقربة من الخلايا وقياس موقعين لكل نمط مختار لكل نوع مصفوفة، تسع مرات لكل موقع قياس بما في ذلك حجم عينة كبيرة بما يكفي لحساب عدم الدقة المحتملة. التركيز على مصفوفة الخلوية من نمط لقياس وإصلاح فأرة الكمبيوتر في تلك المرحلة. بعد ذلك ، ركز على المسبار ونقل طرف المسبار إلى النقطة التي تم تثبيتها مسبقًا بواسطة سهم الكمبيوتر.لإجراء قياسات المصفوفة خارج الخلية، حدد منطقة بدون أي خلايا وقم بإجراء نهج يتبعه تراجع بحيث يتم وضع الكنتليف 100 ميكرومتر فوق الأنسجة. ثم انقر فوق تشغيل لبدء القياسات، وذلك باستخدام المعلمة setpoint التي تم الحصول عليها عن طريق معايرة cantilever. لمعالجة البيانات التي تم الحصول عليها، فتح برامج معالجة البيانات المتوافقة مع البيانات التي تم الحصول عليها من جهاز AFM وحدد نموذج هيرست في البرنامج لمعالجة منحنيات مسافة القوة.تعيين نسبة Poisson إلى 0.5، وشكل التلميح كروية، ونصف قطر الطرف إلى 12.5 ميكرومتر. وبمجرد تعديل جميع المعايير، سيتم تركيب النتائج وسيتم حساب معامل يونغ من قبل البرنامج. على طول النموذج فيزيووباولوجي من سلاسل إلى سلاسل مزدوجة ومن مجموعات صغيرة إلى كبيرة، كل من خارج الخلية ومصفوفة مرنة المغير مرنة انخفاض كبير بين كل تغيير نمط باستثناء بين السلاسل والسلاسل مزدوجة.وبالإضافة إلى ذلك، فإن نسبة المصفوفة خارج الخلية لا تتغير تغيرا كبيرا، في حين لوحظ انخفاض ملحوظ في الاختلافات المطلقة في المرونة بين المصفوفات خارج الخلية والعيّن. تعتمد قيم المرونة على ظروف مختلفة مثل عمق المسافة البادئة أو خصائص تلميح cantilever. وبالتالي فإن AFM هي الأنسب لمقارنة الظروف المختلفة داخل الإعداد التجريبي نفسه.كما يقيس AFM المرونة المحلية للعينة، يجب أن تكون الأجزاء ثابتة في مكانها للسماح بقياس دقيق وتجنب تلف cantilever. لمزيد من تحليل العمليات المسؤولة عن التغيرات في مرونة الأنسجة، يمكن إجراء القياس الكمي الكيميائي الحيوي لهيكل البروتينات ذات الأهمية عبر البقع الغربية أو ELISAs.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

الشلل البكتيرية للتصوير بواسطة الفحص المجهري القوة الذرية

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

التصور من الحمض النووي المؤتلف والمجمعات البروتين باستخدام الميكروسكوب القوة الذرية

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

قياس الخواص الميكانيكية للالكنان السكري غشائي مع مجهر القوة الذرية

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

قياس الخواص الميكانيكية للخلايا الحية باستخدام المجهر القوة الذرية

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Shock Wave Application to Cell Cultures

صدمة الموجة التطبيق إلى الخلية الثقافات

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

سطح القياس المحتمل للبكتيريا عن طريق كلفن التحقيق قوة المجهر

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

رواية القوة الذرية المجهر Biopanning استنادا لعزل مورفولوجيا الكواشف محددة ضد المتغيرات TDP-43 في الضموري العضلي الجانبي التصلب

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

قوة الذرية المجهر التصوير وقوة التحليل الطيفي لدعم الدهن طبقات ثنائية

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

عالية الإنتاجية الجر قوة الفحص المجهري باستخدام PDMS يكشف عن الآثار التي تعتمد على الجرعة من تحويل عامل النمو-β على الانتقال الظهاري إلى Mesenchymal

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

تصنيع وتنفيذ منصة المجهر قوه السحب المرجعية الحرة

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...