Name: application of atomic force microscopy to detect early osteoarthritis
Uploaded: 2020-05-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis at JoVE.com

Vi takker vores medforfattere fra den oprindelige publikation for deres hjælp og støtte.

De menneskelige brusk prøver blev fremstillet fra patienter, der gennemgår total knæ artroplastik i Department of Ortopædkirurgi af Universitetshospitalet i Tuebingen, Tyskland, og Winghofer-hospital, Rottenburg a.N., Tyskland, for slutstadiet OA i knæet. Fuld godkendelse af instituttets, institutions- og lokale etiske udvalg blev opnået, inden undersøgelsen påbegyndes (projektnummer 674/2016BO2). Der blev modtaget skriftligt informeret samtykke fra alle patienter før deltagelse. Metoderne blev udført i overens...

<ol>
	<li>Guilak, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pericellular+matrix+as+a+transducer+of+biomechanical+and+biochemical+signals+in+articular+cartilage.">The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).</li><li>Peters, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protective+role+of+the+pericellular+matrix+in+chondrocyte+apoptosis.">The protective role of the pericellular matrix in chondrocyte apoptosis.</a> Tissue Engineering Part A. 17 (15-16), 2017-2024 (2011).</li><li>Larson, C. M., Kelley, S. S., Blackwood, A. D., Banes, A. J., Lee, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+of+the+native+chondrocyte+pericellular+matrix+results+in+significantly+improved+matrix+production.">Retention of the native chondrocyte pericellular matrix results in significantly improved matrix production.</a> Matrix Biology. 21 (4), 349-359 (2002).</li><li>Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+horizontal+patterns+in+the+spatial+organization+of+superficial+zone+chondrocytes+of+human+joints.">Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints.</a> Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).</li><li>Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontally+oriented+clusters+of+multiple+chondrons+in+the+superficial+zone+of+ankle,+but+not+knee+articular+cartilage.">Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage.</a> The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).</li><li>Rolauffs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+preclinical+osteoarthritis:+the+angular+spatial+organization+permits+early+diagnosis.">Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis.</a> Arthritis Rheumatology. 63 (6), 1637-1647 (2011).</li><li>Maver, U., Velnar, T., Gaber&#353;&#269;ek, M., Planin&#353;ek, O., Fin&#353;gar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progressive+use+of+atomic+force+microscopy+in+biomedical+applications.">Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 80, 96-111 (2016).</li><li>Polini, A., Yang, F., Ramalingam, M., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+characterization+of+nanofiber+composites.">Physicochemical characterization of nanofiber composites.</a> Nanofiber Composites for Biomedical Applications. , 97-115 (2017).</li><li>Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+biomechanical+properties+of+the+extracellular+and+pericellular+matrix+and+their+interconnection+throughout+the+course+of+osteoarthritis.">Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis.</a> Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).</li><li>Danalache, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+stiffness+and+biochemical+composition+of+the+pericellular+matrix+as+a+function+of+spatial+chondrocyte+organisation+in+osteoarthritic+cartilage.">Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).</li><li>Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+strategies+for+automated+AFM+force+curve+analysis--I.+Non-adhesive+indentation+of+soft,+inhomogeneous+materials.">Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).</li><li>Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+properties+of+human+mesenchymally-derived+stem+cells+and+primary+osteoblasts,+chondrocytes,+and+adipocytes.">Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes.</a> Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).</li><li>Thambyah, A., Nather, A., Goh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+articular+cartilage+covered+by+the+meniscus.">Mechanical properties of articular cartilage covered by the meniscus.</a> Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 580-588 (2006).</li><li>Choi, A. P., Zheng, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+Young's+modulus+and+Poisson's+ratio+of+soft+tissue+from+indentation+using+two+different-sized+indentors:+finite+element+analysis+of+the+finite+deformation+effect.">Estimation of Young's modulus and Poisson's ratio of soft tissue from indentation using two different-sized indentors: finite element analysis of the finite deformation effect.</a> Medical Biological Engineering Computing. 43 (2), 258-264 (2005).</li><li>Jin, H., Lewis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Poisson's+ratio+of+articular+cartilage+by+indentation+using+different-sized+indenters.">Determination of Poisson's ratio of articular cartilage by indentation using different-sized indenters.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 126 (2), 138-145 (2004).</li></ol>

Ved hjælp af AFM som en ny og kraftfuld teknik til at måle biologiske materialers biomekaniske egenskaber på nanoskalaniveau målte vi ECM'ens og PCM's elastiske egenskaber i den menneskelige osteoarthritiske ledbrusk. Bruskprøver blev udvalgt i henhold til deres fremherskende rumlige mønster af chondrocyt organisation som en billedbaseret biomarkør for lokal vævdegeneration. Som forventet blev der observeret et kraftigt fald i værdierne for elasticitet i både ECM og PCM langs den rumlige reorganisering af chond...

Ledbrusk er en avaskulær, aneuralvæv. Sparsomt spredte chondrocytter producere, organisere og vedligeholde en ekspansiv ekstracellulær matrix (ECM), hvor de er indlejret. Som en særskilt og specialiseret del af ECM, chondrocytter er omgivet af et tyndt lag af specialiserede matrix kendt som pericellulære matrix (PCM). PCM fungerer som en mechanosensitive celle-matrix interface1, der beskytter chondrocytes2 og modulerer deres biosyntetiske respons3. Som tidligere beskrevet4, i sund brusk, chondrocytter er arrangeret i specifikke, forskellige rumlige mønstre, der er specifikke for hvert væv lag og fælles4,5 og afhænger af fælles-specifikke mekaniske lastning mekanismer6. Disse mønstre skifter fra par og strenge i sund brusk til dobbelte strenge med debut af slidgigt (OA). Med yderligere progression af sygdommen danner chondrocytter små klynger, stigende gradvist i størrelse til store klynger i avanceret OA. Et fuldstændigt tab af enhver organisatorisk struktur og induktion af apoptose er observeret i slutstadiet OA. Således, chondrocyt cellulære arrangement kan bruges som et billede-baseret biomarkør for OA progression4.
Biomekaniske egenskaber af celler og væv ikke kun regulere deres form og funktion, men er også afgørende for at bevare deres vitalitet. Ændringer i elasticitet kan udbrede eller udløse udbrud af større sygdomme som kræft eller OA. Atomic force mikroskopi (AFM) har vist sig som et kraftfuldt redskab til kvalitativt og kvantitativt karakterisere de biomekaniske egenskaber af specifikke biologiske målstrukturer på en mikroskopisk skala, der måler en bred vifte af kraft, fra piconewton til mikronewton. Den vigtigste anvendelse af AFM er at måle overfladetopografien og de mekaniske egenskaber af prøver ved opløsning 7 af subnanometer. Måleanordningen består af tre hovedkomponenter: 1) En AFM-sonde, som er en skarp spids monteret på en cantilever og anvendes til direkte interaktion med prøvens overflade. Når der påføres kraft på kantiler, deformation af sidstnævnte sker i henhold til den målte vævs egenskaber. 2) Et optisk system, der projicerer en laserstråle på cantilever, som derefter afspejles til en detektorenhed. 3) En fotodiodedetektor, der fanger lyset afbøjet fra cantilever. Det konverterer de modtagne oplysninger om laser afbøjning af cantilever i en kraft kurve, der kan analyseres.
Hovedprincippet i AFM er således påvisning af den kraft, der virker mellem AFM-sonden og prøvens målstruktur. De opnåede kraftkurver beskriver målstrukturernes mekaniske egenskaber på prøveoverfladen som elasticitet, ladningsfordeling, magnetisering, udbyttestress og elastisk plastdeformationsdynamik8. En vigtig fordel ved AFM i forhold til andre billeddannelse teknikker er, at AFM kan bruges til at måle de mekaniske egenskaber af levende celler i medium eller væv i en indfødt tilstand uden at beskadige vævet. AFM kan fungere både under flydende eller tørre forhold. Der er ikke noget krav om forberedelse af prøver. AFM giver mulighed for at afbilde en prøve og måle dens mekaniske egenskaber samtidigt i prøver, der er tæt på fysiologiske forhold. I denne undersøgelse beskriver vi en ny tilgang til at vurdere OA progression ved at måle elasticiteten af PCM og ECM i indfødte ledbrusk. Korrelationen mellem rumlig organisering af chondrocytter med graden af lokal vævsdegeneration giver et helt nyt perspektiv for tidlig påvisning af OA. Den funktionelle relevans af disse mønstre er imidlertid endnu ikke blevet evalueret. Fordi den vigtigste funktion af ledbrusk er bærende ved lav friktion, skal vævet have elastiske egenskaber. AFM gør det muligt at måle ikke blot ecm'ens elasticitet, men også de rumlige cellemønstre, der er indlejret i deres PCM. Den observerede korrelation mellem elasticitet og rumlig mønsterændring af chondrocytterne er så stærk, at måling af elasticitet alene kan tillade stratificering af lokal vævsdegeneration.
Elastisk moduli af PCM og ECM blev vurderet i 35 μm tynde sektioner ved hjælp af et AFM-system integreret i et omvendt fasekontrastmikroskop, der tillod samtidig visualisering af bruskprøven. Denne protokol er baseret på en undersøgelse, der allerede er offentliggjort fra vores laboratorium9 og specifikt beskriver, hvordan man karakteriserer den rumlige arrangement af chondrocytter og hvordan man kan måle elasticiteten i deres tilknyttede PCM og ECM. Ved hver mønsterændring af chondrocytterne kan der også observeres betydelige ændringer i elasticiteten for både PCM og ECM, hvilket gør det muligt at bruge denne teknik til direkte at måle bruskstadens degeneration.
Denne validerede tilgang åbner en ny måde at evaluere OA progression og terapeutiske virkninger på tidlige stadier, før makroskopisk væv nedbrydning faktisk begynder at dukke op. Udførelse af AFM målinger konsekvent er en vanskelig proces. I den følgende protokol beskriver vi, hvordan du forbereder prøven, der skal måles ved AFM, hvordan man udfører de faktiske AFM målinger startende med forberedelse af cantilever, hvordan man kalibrerer AFM, og derefter hvordan man udfører målingerne. Trinvise instruktioner giver en klar og præcis tilgang til at opnå pålidelige data og tilvejebringe grundlæggende strategier for behandling og fortolkning af dem. Diskussionsafsnittet beskriver også de mest almindelige faldgruber ved denne strenge metode og indeholder nyttige fejlfindingstip.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscope (AFM)</td>
			<td>CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM head</td>
			<td>(CellHesion 200) JPK</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocompatible sample glue</td>
			<td>JPK Instruments AG, Berlin, Germany</td>
			<td>H000033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever</td>
			<td>tip C, k &#188; 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria</td>
			<td>AIO-TL-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)</td>
			<td>AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany</td>
			<td>L201306_03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium without L-glutamine</td>
			<td>(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)</td>
			<td>F1315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>07313-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater associated with AFM</td>
			<td>JPK Instruments AG, Berlin, Germany</td>
			<td>T-05-0117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>2023-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td>TPP93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands</td>
			<td>SA6255012</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of atomic force microscopy to detect early osteoarthritis

Biomekaniske egenskaber af celler og væv ikke kun regulere deres form og funktion, men er også afgørende for at bevare deres vitalitet. Ændringer i elasticitet kan udbrede eller udløse udbrud af større sygdomme som kræft eller slidgigt (OA). Atomic force mikroskopi (AFM) har vist sig som et stærkt redskab til kvalitativt og kvantitativt at karakterisere de biomekaniske egenskaber af specifikke biologiske målstrukturer på en mikroskopisk skala, måle kræfter i en række fra så lille som piconewton til mikronewton. Biomekaniske egenskaber er af særlig betydning i muskel- og skeletvæv, som udsættes for høje belastningsniveauer. OA som en degenerativ sygdom i brusk resulterer i afbrydelse af den pericellulære matrix (PCM) og den rumlige omlægning af chondrocytter indlejret i deres ekstracellulære matrix (ECM). Disruption i PCM og ECM har været forbundet med ændringer i bruskens biomekaniske egenskaber. I denne undersøgelse brugte vi AFM til at kvantificere disse ændringer i forhold til de specifikke ændringer i rumlige mønstre af chondrocytterne. Ved hver mønsterændring blev der observeret betydelige ændringer i elasticiteten for både PCM og ECM. Måling af den lokale elasticitet giver således mulighed for at drage direkte konklusioner om graden af lokal vævsdegeneration i OA.

Langs den fysiopatologiske model fra strenge til dobbelte strenge, til små og endelig til store klynger, både ECM (Figur 3A) og PCM (Figur 3B) elastisk moduli faldt betydeligt mellem hvert mønster ændring. Den eneste undtagelse var forskellen i ECM mellem strenge og dobbelte strenge (p = 0,072). Resultaterne viser, at ECM/PCM-forholdet (figur 4B) ikke ændrede sig væsentligt, mens der blev observeret et markant fald i de absolu...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis at JoVE.com

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Vi præsenterer en metode til at undersøge tidlige osteoarthritiske ændringer på celleniveau i ledbrusk ved hjælp af atomkraftmikroskopi (AFM).

Anvendelse af Atomic Force Mikroskopi til at opdage tidlig slidgigt

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Cellers og vævs biomekaniske egenskaber regulerer deres funktion og vitalitet. AFM giver mulighed for tidlig kvantificering af slidgigt på celleniveau baseret på elasticitetsmålinger. AFM tillader erhvervelse af målinger på celleniveau uden at beskadige prøven og med en høj opløsning, pålidelighed og følsomhed.Biomekaniske ændringer af ejendom forekommer tidligt i slidgigt. Måling af den lokale elasticitet i ledbrusk giver mulighed for at drage gyldige konklusioner om graden af lokal vævsdegeneration. For at evaluere degenerative ændringer i det menneskelige knæled skal du først bruge en skalpel til at skære ledbrusken som helhed fra underknoglen og integrere bruskprøven i vandopløseligt indlejringsmedium på Cryotome-knappen, der fryser under lav temperatur i Cryotome-enheden.Når prøven er frosset, anvendes et standard cryotome til at erhverve en 35 mikrometer tykke vævssektioner fra det øverste lag af ledbrusken og samle hver sektion på individuelle glasdias. Når alle sektionerne er opnået, skylles prøverne tre gange i frisk PBS i fem minutter pr. vask for at fjerne det vandopløselige indlejringsmedium. Fjern det første dias fra vasken.Efter dette, tilsæt to til tre dråber biokompatibel prøve lim pr sektion i individuelle AFM-kompatible Petri retter. Fjern eventuel overskydende opløsning fra prøven, og tryk forsigtigt kanterne af den tørrede sektion på limpletterne. Efter to minutter dækkes det sammenstædte væv med Leibovitz' L-15-medium uden L-glutamin, og retterne i en cellekulturskuvator, indtil prøverne skal analyseres.Afm-anordningen klargøres ved at justere en gasblok til måling i et flydende miljø på AFM-holderen, så den øverste overflade er parallel med holderen, og brug pincet til omhyggeligt at montere den valgte cantilever på glasblokkens overflade, så AFM-spidsen med mikrosfæren stikker ud over det polerede optiske plan. For at stabilisere cantilever på glasblokken, skub den metalliske fjeder ind i rillen af blokken, og brug pincet til at klemme toppen af cantilever med foråret. Placer forsigtigt glasblokken med cantilever på AFM-hovedet, og fastgør blokken med den integrerede låsemekanisme.Monter derefter AFM hovedet med cantilever på AFM enheden med foråret vender mod venstre. Prøven monteres på AFM-anordningen ved at anbringe prøve petriskålen på AFM-prøveholderen og indstille petriskålens varmeapparat til 37 grader Celsius. Efter ca. 20 minutter skal du åbne enhedssoftwaren og laserjusteringen og indflyvningsparametersættende vinduer.Tænd derefter steppermotoren, laserlyset og CCD-kameraet, og brug steppermotorfunktionen til at sænke cantilever i 100 mikrometertrin, indtil cantilever er helt nedsænket i mediet. Brug justeringsskruerne til at dirigere laseren oven på udkrævesen, og brug AFM-enhedsskruerne til at justere laserstrålen, så den reflekterede stråle falder ned på midten af fotodetektoren. Når laseren cantilever er blevet justeret, justere fotodetektoren efter behov for at indstille sumsignalet til en volt eller derover og de laterale og lodrette afbøjninger tæt på nul.For at opnå kalibreringskraftkurven skal du køre en scannertilgang med indflyvningsparametrene som angivet i tabellen. Når bunden af vævskulturskålen er nået, skal cantilever trækkes tilbage med 100 mikrometer. Konfigurer kørselsparametrene som angivet i tabellen.Og klik køre for at starte en måling og for at opnå en kalibrering kraft afstand kurve. Kraftkurven opnås som vist i figuren. På kalibreringskraftafstandskurven skal du vælge området for en lineær tilpasning af den tilbagetrukne kurve.Når den lineære pasform er på plads, vil værdierne blive gemt af softwaren. Så da målingerne udføres i medium ved 37 grader Celsius temperatur, indstille temperaturvariablen i softwaren til 37 grader for at efterligne de fysiologiske forhold så tæt som muligt. At identificere de konversite mønstre i brusk prøve sektioner, lokalisere og identificere de specifikke cellulære mønstre af ledbrusk fra slidgigt knæ på fasen kontrast mikroskop, som kan omfatte enkelt strenge, der tyder på sunde væv områder, dobbelt strenge, der tyder på begyndelsen af væv degeneration, små klynger, som er tegn på avanceret væv degeneration, og store klynger, der tyder på slutstadiet væv ødelæggelse.Når et specifikt ønsket mønster er blevet identificeret, skal cantileveren for pericellular matrixmålinger placeres tæt på cellerne og måle to steder pr. valgt mønster pr. matrixtype, ni gange pr. målested, herunder en stikprøvestørrelse, der er stor nok til at tage højde for mulige unøjagtigheder. Fokuser på den cellulære matrix af det mønster, der skal måles, og fastgør computermusen på det tidspunkt. Fokuser derefter på sonden og flyt spidsen af sonden til det punkt, der tidligere var fastsat af computerpilen.For at foretage målinger af den ekstracellulære matrix skal du vælge et område uden celler og udføre en indflyvning efterfulgt af en tilbagetrækning, således at cantilever er placeret 100 mikrometer over vævet. Klik derefter på kør for at starte målingerne ved hjælp af den setpunktsparameter, der opnås ved kalibrering af cantilever. For at behandle de opnåede data skal du åbne databehandlingssoftware, der er kompatibel med de data, der er hentet fra AFM-enheden, og vælge Hearst-modellen i softwaren til behandling af kraftafstandskurverne.Indstil Poisson-forholdet til 0,5, spidsen form som sfærisk, og spidsen radius til 12,5 mikrometer. Når alle parametrene er blevet justeret, vil resultaterne blive monteret, og Young's Modulus vil blive beregnet af softwaren. Langs den fysiopatologiske model fra strenge til dobbelte strenge og fra små til store klynger, både ekstracellulære og pericellular matrix elastisk moduli falde betydeligt mellem hvert mønster forandring undtagen mellem strenge og dobbelt strenge.Desuden ændrer det ekstracellulære pericellular matrixforhold sig ikke væsentligt, mens der konstateres et markant fald i de absolutte elasticitetsforskelle mellem de ekstracellulære og pericellular matricer. Elasticitetsværdier afhænger af forskellige betingelser, f.eks. AFM er således bedst egnet til at sammenligne forskellige forhold inden for samme eksperimentelle setup.Da AFM måler prøvens lokale elasticitet, skal sektionerne fastsættes for at muliggøre præcise målinger og for at undgå udkragelige skader. For yderligere at analysere de processer, der er ansvarlige for vævselasticitet ændringer, biokemisk kvantificering af strukturen af proteiner af interesse kan udføres via vestlige blots eller ELISA' er.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Kvantificering af mekaniske egenskaber af de Endothelial glycocalyx med Atomic Force Microscopy

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Måling af mekaniske egenskaber af levende celler bruge Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Shock Wave Application to Cell Cultures

Shock Wave Anvendelse cellekulturer

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Overflade Potentiel Måling af Bakterier Brug Kelvin Probe force mikroskopi

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Novel Atomic force mikroskopi Based Biopanning til isolering af Morfologi Specifikke reagenser mod TDP-43 varianter i amyotrofisk lateral sklerose

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force mikroskopi Imaging og Kraft spektroskopi af understøttede lipiddobbeltlag

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Høj kapacitet trækkraft mikroskopi ved hjælp af PDMS afslører dosis-afhængige effekter af omdanne vækstfaktor-β på epitelial-til-Mesenchymal overgang

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Fabrikation og implementering af en reference-fri trækkraft mikroskopi platform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...