Name: application of atomic force microscopy to detect early osteoarthritis
Uploaded: 2020-05-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis at JoVE.com

Wij danken onze co-auteurs van de oorspronkelijke publicatie voor hun hulp en steun.

De menselijke kraakbeenmonsters werden verkregen van patiënten die totale kniearthroplastie ondergingen in de afdeling Orthopedische Chirurgie van het Universitair Ziekenhuis van Tuebingen, Duitsland, en het Winghofer-ziekenhuis, Rottenburg a.N., Duitsland, voor eindfase OA van de knie. Volledige departementale, institutionele en lokale ethische commissie goedkeuring werden verkregen vóór aanvang van de studie (projectnummer 674/2016BO2). Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd ontvangen van alle patiënten voor...

<ol>
	<li>Guilak, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pericellular+matrix+as+a+transducer+of+biomechanical+and+biochemical+signals+in+articular+cartilage.">The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).</li><li>Peters, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protective+role+of+the+pericellular+matrix+in+chondrocyte+apoptosis.">The protective role of the pericellular matrix in chondrocyte apoptosis.</a> Tissue Engineering Part A. 17 (15-16), 2017-2024 (2011).</li><li>Larson, C. M., Kelley, S. S., Blackwood, A. D., Banes, A. J., Lee, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+of+the+native+chondrocyte+pericellular+matrix+results+in+significantly+improved+matrix+production.">Retention of the native chondrocyte pericellular matrix results in significantly improved matrix production.</a> Matrix Biology. 21 (4), 349-359 (2002).</li><li>Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+horizontal+patterns+in+the+spatial+organization+of+superficial+zone+chondrocytes+of+human+joints.">Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints.</a> Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).</li><li>Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontally+oriented+clusters+of+multiple+chondrons+in+the+superficial+zone+of+ankle,+but+not+knee+articular+cartilage.">Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage.</a> The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).</li><li>Rolauffs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+preclinical+osteoarthritis:+the+angular+spatial+organization+permits+early+diagnosis.">Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis.</a> Arthritis Rheumatology. 63 (6), 1637-1647 (2011).</li><li>Maver, U., Velnar, T., Gaber&#353;&#269;ek, M., Planin&#353;ek, O., Fin&#353;gar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progressive+use+of+atomic+force+microscopy+in+biomedical+applications.">Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 80, 96-111 (2016).</li><li>Polini, A., Yang, F., Ramalingam, M., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+characterization+of+nanofiber+composites.">Physicochemical characterization of nanofiber composites.</a> Nanofiber Composites for Biomedical Applications. , 97-115 (2017).</li><li>Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+biomechanical+properties+of+the+extracellular+and+pericellular+matrix+and+their+interconnection+throughout+the+course+of+osteoarthritis.">Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis.</a> Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).</li><li>Danalache, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+stiffness+and+biochemical+composition+of+the+pericellular+matrix+as+a+function+of+spatial+chondrocyte+organisation+in+osteoarthritic+cartilage.">Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).</li><li>Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+strategies+for+automated+AFM+force+curve+analysis--I.+Non-adhesive+indentation+of+soft,+inhomogeneous+materials.">Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).</li><li>Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+properties+of+human+mesenchymally-derived+stem+cells+and+primary+osteoblasts,+chondrocytes,+and+adipocytes.">Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes.</a> Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).</li><li>Thambyah, A., Nather, A., Goh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+articular+cartilage+covered+by+the+meniscus.">Mechanical properties of articular cartilage covered by the meniscus.</a> Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 580-588 (2006).</li><li>Choi, A. P., Zheng, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+Young's+modulus+and+Poisson's+ratio+of+soft+tissue+from+indentation+using+two+different-sized+indentors:+finite+element+analysis+of+the+finite+deformation+effect.">Estimation of Young's modulus and Poisson's ratio of soft tissue from indentation using two different-sized indentors: finite element analysis of the finite deformation effect.</a> Medical Biological Engineering Computing. 43 (2), 258-264 (2005).</li><li>Jin, H., Lewis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Poisson's+ratio+of+articular+cartilage+by+indentation+using+different-sized+indenters.">Determination of Poisson's ratio of articular cartilage by indentation using different-sized indenters.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 126 (2), 138-145 (2004).</li></ol>

Met behulp van AFM als een nieuwe en krachtige techniek om de biomechanische eigenschappen van biologische materialen op nanoschaalniveau te meten, maten we de elastische eigenschappen van de ECM en PCM in menselijk artrose articulair kraakbeen. Kraakbeenmonsters werden geselecteerd op basis van hun overheersende ruimtelijke patroon van de chondrocyteorganisatie als een op afbeeldingen gebaseerde biomarker voor lokale weefseldegeneratie. Zoals verwacht werd een sterke daling van de waarde van elasticiteit van zowel ECM a...

Gewrichtskraakbeen is een avasculair, aneural weefsel. Dunverspreide chondrocyten produceren, organiseren en onderhouden een expansieve extracellulaire matrix (ECM) waarin ze zijn ingebed. Als een duidelijk en gespecialiseerd onderdeel van de ECM, zijn chondrocyten omgeven door een dunne laag van gespecialiseerde matrix bekend als de pericellulaire matrix (PCM). De PCM fungeert als een mechanogevoelige cel-matrix interface1 die de chondrocyten2 beschermt en hun biosynthetische responsmoduleert 3. Zoals eerder beschreven4, in gezond kraakbeen, zijn de chondrocyten gerangschikt in specifieke, verschillende ruimtelijke patronen die specifiek zijn voor elke weefsellaag en gewricht4,5 en zijn afhankelijk van gewrichtsspecifieke mechanische laadmechanismen6. Deze patronen veranderen van paren en snaren in gezond kraakbeen tot dubbele snaren met het begin van artrose (OA). Met verdere progressie van de ziekte vormen de chondrocyten kleine clusters, die geleidelijk in omvang toenemen tot grote clusters in geavanceerde OA. Een volledig verlies van een organisatiestructuur en inductie van apoptose wordt waargenomen in eindfase OA. Zo kan chondrocyte cellulaire regeling worden gebruikt als een beeldgebaseerde biomarker voor OA progressie4.
Biomechanische eigenschappen van cellen en weefsels regelen niet alleen hun vorm en functie, maar zijn ook cruciaal voor het behoud van hun vitaliteit. Veranderingen in elasticiteit kunnen zich voortplanten of leiden tot het begin van belangrijke ziekten zoals kanker of OA. Atoomkrachtmicroscopie (AFM) is uitgegroeid tot een krachtig instrument om de biomechanische eigenschappen van specifieke biologische doelstructuren op microscopische schaal, meten van een breed scala aan kracht, van piconewton tot de micronewton, kwalitatief en kwantitatief te karakteriseren. De belangrijkste toepassing van de AFM is het meten van de oppervlaktetopografie en mechanische eigenschappen van monsters bij subnanometer resolutie7. Het meetapparaat bestaat uit drie hoofdcomponenten: 1) Een AFM-sonde, die een scherpe punt is die op een cantilever is gemonteerd en wordt gebruikt voor de directe interactie met het oppervlak van het monster. Wanneer kracht wordt toegepast op de cantilever, treedt vervorming van de laatste op volgens de eigenschappen van het gemeten weefsel. 2) Een optisch systeem dat een laserstraal projecteert op de cantilever, die vervolgens wordt gereflecteerd op een detectoreenheid. 3) Een fotodiode detector die het licht afbuigen van de cantilever vangt. Het zet de ontvangen informatie over de laser afbuiging door de cantilever in een kracht curve die kan worden geanalyseerd.
Het belangrijkste principe van de AFM is dus de detectie van de kracht tussen de AFM-sonde en de doelstructuur van het monster. De verkregen krachtkrommen beschrijven de mechanische eigenschappen van de doelstructuren op het monsteroppervlak, zoals elasticiteit, ladingsverdeling, magnetisatie, opbrengstspanning en elastische plastische vervormingsdynamiek8. Een belangrijk voordeel van de AFM ten opzichte van andere beeldvormingstechnieken is dat de AFM kan worden gebruikt om de mechanische eigenschappen van levende cellen in medium of weefsels in een inheemse staat te meten zonder het weefsel te beschadigen. AFM kan zowel in vloeibare als droge omstandigheden werken. Er is geen vereiste voor de voorbereiding van de monsters. DE AFM biedt de mogelijkheid om een monster in beeld te brengen en tegelijkertijd zijn mechanische eigenschappen te meten in monsters die in de buurt van fysiologische omstandigheden zijn. In deze studie beschrijven we een nieuwe benadering om OA-progressie te beoordelen door de elasticiteit van het PCM en de ECM in inheems gewrichtskraakbeen te meten. De correlatie van ruimtelijke organisatie van chondrocyten met de mate van lokale weefseldegeneratie biedt een compleet nieuw perspectief voor vroege detectie van OA. De functionele relevantie van deze patronen is echter nog niet geëvalueerd. Omdat de belangrijkste functie van gewrichtskraakbeen dragend is bij lage wrijving, moet het weefsel elastische eigenschappen hebben. AFM maakt het meten van niet alleen de elasticiteit van de ECM, maar ook van de ruimtelijke cellulaire patronen ingebed in hun PCM. De waargenomen correlatie van elasticiteit met ruimtelijke patroonverandering van de chondrocyten is zo sterk dat alleen al het meten van elasticiteit stratificatie van lokale weefseldegeneratie mogelijk kan zijn.
Elastische moduli van de PCM en ECM werden beoordeeld in 35 μm-dunne secties met behulp van een AFM-systeem geïntegreerd in een omgekeerde fase contrast microscoop die gelijktijdige visualisatie van het kraakbeen monster toegestaan. Dit protocol is gebaseerd op een studie die al is gepubliceerd vanuit ons laboratorium9 en beschrijft specifiek hoe de ruimtelijke ordening van de chondrocyten kan worden gekarakteriseerd en hoe de elasticiteit van hun bijbehorende PCM en ECM kan worden gemeten. Bij elke patroonverandering van de chondrocyten kunnen ook significante veranderingen in elasticiteit worden waargenomen voor zowel het PCM als de ECM, waardoor deze techniek kan worden gebruikt om het stadium van degeneratie van het kraakbeen direct te meten.
Deze gevalideerde aanpak opent een nieuwe manier om OA-progressie en therapeutische effecten in een vroeg stadium te evalueren voordat macroscopische weefselafbraak daadwerkelijk begint te verschijnen. Consequent AFM-metingen uitvoeren is een moeizaam proces. In het volgende protocol beschrijven we hoe het monster kan worden gemeten door de AFM, hoe de werkelijke AFM-metingen worden uitgevoerd te beginnen met de voorbereiding van de cantilever, hoe de AFM te kalibreren en vervolgens hoe de metingen uit te voeren. Stapsgewijze instructies geven een duidelijke en beknopte aanpak om betrouwbare gegevens te verkrijgen en basisstrategieën te bieden voor de verwerking en interpretatie ervan. De discussie sectie beschrijft ook de meest voorkomende valkuilen van deze rigoureuze methode en biedt nuttige tips voor het oplossen van problemen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscope (AFM)</td>
			<td>CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM head</td>
			<td>(CellHesion 200) JPK</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocompatible sample glue</td>
			<td>JPK Instruments AG, Berlin, Germany</td>
			<td>H000033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever</td>
			<td>tip C, k &#188; 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria</td>
			<td>AIO-TL-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)</td>
			<td>AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany</td>
			<td>L201306_03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium without L-glutamine</td>
			<td>(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)</td>
			<td>F1315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>07313-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater associated with AFM</td>
			<td>JPK Instruments AG, Berlin, Germany</td>
			<td>T-05-0117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>2023-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td>TPP93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands</td>
			<td>SA6255012</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of atomic force microscopy to detect early osteoarthritis

Biomechanische eigenschappen van cellen en weefsels regelen niet alleen hun vorm en functie, maar zijn ook cruciaal voor het behoud van hun vitaliteit. Veranderingen in elasticiteit kunnen zich voortplanten of het begin van belangrijke ziekten zoals kanker of artrose (OA) veroorzaken. Atoomkrachtmicroscopie (AFM) is uitgegroeid tot een sterk instrument om de biomechanische eigenschappen van specifieke biologische doelstructuren op microscopische schaal kwalitatief en kwantitatief te karakteriseren, meetkrachten in een bereik van zo klein als de piconewton tot de micronewton. Biomechanische eigenschappen zijn van bijzonder belang in spier- en skeletweefsels, die worden blootgesteld aan hoge niveaus van spanning. OA als een degeneratieve ziekte van het kraakbeen resulteert in de verstoring van de pericellulaire matrix (PCM) en de ruimtelijke herschikking van de chondrocyten ingebed in hun extracellulaire matrix (ECM). Verstoring in PCM en ECM is geassocieerd met veranderingen in de biomechanische eigenschappen van kraakbeen. In deze studie gebruikten we de AFM om deze veranderingen te kwantificeren in relatie tot de specifieke ruimtelijke patroonveranderingen van de chondrocyten. Bij elke patroonwijziging werden significante veranderingen in elasticiteit waargenomen voor zowel het PCM als de ECM. Het meten van de lokale elasticiteit maakt het dus mogelijk om directe conclusies te trekken over de mate van lokale weefseldegeneratie in OA.

Langs het fysiopathologische model van snaren tot dubbele snaren, tot kleine en uiteindelijk tot grote clusters, daalden zowel ECM (Figuur 3A) als PCM (Figuur 3B) elastische moduli aanzienlijk tussen elke patroonverandering. De enige uitzondering was het verschil in ECM tussen snaren en dubbele snaren (p = 0,072). Uit de resultaten blijkt dat de ECM/PCM-ratio (figuur 4B) niet significant is veranderd, terwijl een duidelijke daling v...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis at JoVE.com

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

We presenteren een methode om vroege artroseveranderingen op cellulair niveau in gewrichtskraakbeen te onderzoeken met behulp van atoomkrachtmicroscopie (AFM).

Toepassing van Atomic Force Microscopie om vroege artrose op te sporen

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

De biomechanische eigenschappen van cellen en weefsels reguleren hun functie en vitaliteit. AFM maakt het mogelijk om artrose op cellulair niveau vroegtijdig te kwantificeren op basis van elasticiteitsmetingen. De AFM staat het mogelijk om metingen op cellulair niveau te nemen zonder het monster te beschadigen en met een hoge resolutie, betrouwbaarheid en gevoeligheid.Biomechanische veranderingen in het bezit optreden vroeg bij artrose. Het meten van de lokale elasticiteit van gewrichtskraakbeen maakt het mogelijk geldige conclusies te trekken over de mate van lokale weefseldegeneratie. Om degeneratieve veranderingen in het menselijk kniegewricht te evalueren, gebruikt u eerst een scalpel om het gewrichtskraakbeen als geheel uit het subchondrale bot te snijden en het kraakbeenmonster in te bedden in in wateroplosbaar inbeddingsmedium op de Cryotome-knop die onder lage temperatuur in het Cryotome-apparaat bevriest.Wanneer het monster is bevroren, gebruik dan een standaard Cryotome om een 35 micrometer dikke delen van weefsel te verwerven uit de bovenste laag van het gewrichtskraakbeen, het verzamelen van elke sectie op individuele glazen dia's. Wanneer alle secties zijn verkregen, spoel de monsters drie keer in verse PBS gedurende vijf minuten per wasbeurt om het in water oplosbare inbedding medium te verwijderen. Haal de eerste schuif uit de was.Voeg hierna twee tot drie druppels biocompatibele monsterlijm per sectie toe in afzonderlijke AFM-compatibele petrischaaltjes. Verwijder een overtollige oplossing uit het monster en druk voorzichtig de randen van de gedroogde sectie op de lijmvlekken. Bedek na twee minuten de gebonden weefsels voorzichtig met Leibovitz's L-15-medium zonder L-glutamine en plaats de gerechten in een celkweek incubator totdat de monsters moeten worden geanalyseerd.Om het AFM-apparaat voor te bereiden, stelt u een gasblok aan voor het meten in een vloeibare omgeving op de AFM-houder, zodat het bovenste oppervlak parallel aan de houder is, en gebruikt u een pincet om de geselecteerde cantilever zorgvuldig op het oppervlak van het glazen blok te monteren, zodat de AFM-tip met de microsfeer over het gepolijste optische vlak uitsteekt. Om de cantilever op het glazen blok te stabiliseren, schuift u de metalen veer in de groef van het blok en gebruikt u een pincet om de bovenkant van de cantilever met de veer te klemmen. Plaats het glazen blok voorzichtig met de cantilever op het AFM-hoofd en zet het blok vast met het geïntegreerde vergrendelingsmechanisme.Monteer vervolgens de AFM-kop met de cantilever op het AFM-apparaat met de veer naar links gericht. Om het monster op het AFM-apparaat te monteren, plaatst u de monster petrischaal op de AFM-monsterhouder en stelt u de petrischaalverwarming in op 37 graden Celsius. Open na ongeveer 20 minuten de apparaatsoftware en laseruitlijning en benaderingsparameterinstelling vensters.Schakel vervolgens de steppermotor, het laserlicht en de CCD-camera in en gebruik de steppermotorfunctie om de cantilever in stappen van 100 micrometer te verlagen totdat de cantilever volledig in het medium is ondergedompeld. Gebruik de verstelschroeven om de laser bovenop de cantilever te richten en gebruik de AFM-apparaatschroeven om de laserstraal aan te passen zodat de gereflecteerde straal op het midden van de fotodetector valt. Zodra de laser cantilever is aangepast, pas de fotodetector zo nodig om de som signaal in te stellen op een volt of hoger en de laterale en verticale afbuigingen tot bijna nul.Voer een scannerbenadering uit met de naderingsparameters zoals aangegeven in de tabel om de curve van de kalibratiekracht te verkrijgen. Zodra de bodem van de weefselkweek schotel is bereikt, trek de cantilever door 100 micrometer. Stel de runparameters in zoals aangegeven in de tabel.En klik op run om een meting te starten en om een kalibratie kracht afstand curve te verkrijgen. De krachtcurve wordt verkregen zoals geïllustreerd in de figuur. Selecteer op de curve kalibratiekrachtafstand het gebied voor een lineaire pasvorm van de ingetrokken curve.Zodra de lineaire pasvorm op zijn plaats is, worden de waarden opgeslagen door de software. Vervolgens, terwijl de metingen in medium worden uitgevoerd op de temperatuur van 37 graden Celsius, stelt u de temperatuurvariabele in de software in op 37 graden om de fysiologische omstandigheden zo dicht mogelijk na te bootsen. Om de conversite patronen in de kraakbeenmonstersecties te identificeren, de specifieke cellulaire patronen van gewrichtskraakbeen van de osteoarthritische knie op de fasecontrastmicroscoop te lokaliseren, die enkele koorden kunnen omvatten die wijzen op gezonde weefselgebieden, dubbele snaren die wijzen op het begin van weefseldegeneratie, kleine clusters, die tekenen zijn van geavanceerde weefseldegeneratie, en grote clusters, die wijzen op weefselvernietiging in de eindfase.Zodra een specifiek gewenst patroon is geïdentificeerd, voor pericellulaire matrixmetingen, plaats de cantilever in de nabijheid van de cellen en meet twee locaties per gekozen patroon per matrixtype, negen keer per meetplaats inclusief een monstergrootte die groot genoeg is om rekening te houden met mogelijke onnauwkeurigheden. Focus op de cellulaire matrix van het patroon dat moet worden gemeten en bevestig de computermuis op dat punt. Focus vervolgens op de sonde en verplaats de punt van de sonde naar het punt dat eerder door de computerpijl is bevestigd.Als u metingen van de extracellulaire matrix wilt uitvoeren, selecteert u een gebied zonder cellen en voert u een nadering uit die wordt gevolgd door een intrekking, zodat de cantilever 100 micrometer boven het weefsel wordt geplaatst. Klik vervolgens op uitvoeren om de metingen te starten, met behulp van de setpoint parameter verkregen door kalibratie van de cantilever. Om de verkregen gegevens te verwerken, opent u software voor gegevensverwerking die compatibel is met de gegevens die zijn verkregen van het AFM-apparaat en selecteert u het Hearst-model in de software voor het verwerken van de krachtafstandscurven.Stel de Poisson-verhouding in op 0,5, de tipvorm als bolvormig en de tipradius op 12,5 micrometer. Zodra alle parameters zijn aangepast, worden de resultaten gemonteerd en wordt de Young's Modulus berekend door de software. Langs het fysiopathologische model van snaren tot dubbele snaren en van kleine tot grote clusters, zowel extracellulaire als pericellulaire matrix elastische moduli aanzienlijk afnemen tussen elke patroonverandering, behalve tussen snaren en dubbele snaren.Bovendien verandert de extracellulaire-pericellulaire matrixverhouding niet significant, terwijl een duidelijke afname van de absolute verschillen in elasticiteit tussen de extracellulaire en pericellulaire matrices wordt waargenomen. Elasticiteitswaarden zijn afhankelijk van verschillende omstandigheden, zoals de inkepingsdiepte of de eigenschappen van de cantilevertip. De AFM is dus het meest geschikt om verschillende voorwaarden binnen dezelfde experimentele opzet te vergelijken.Aangezien de AFM de lokale elasticiteit van het monster meet, moeten de secties worden vastgesteld om nauwkeurige metingen mogelijk te maken en cantileverschade te voorkomen. Om de processen die verantwoordelijk zijn voor weefselelasticiteitsveranderingen verder te analyseren, kan biochemische kwantificering van de structuur van interessant zijnde eiwitten worden uitgevoerd via westerse vlekken of ELISA's.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Bacteriële Immobilisatie for Imaging door Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Visualisatie van Recombinant DNA en eiwit complexen met behulp van Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Het kwantificeren van de mechanische eigenschappen van de Endotheliale Kalende haarvaten met Atomic Force Microscopy

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Het meten van de mechanische eigenschappen van levende cellen door gebruik Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Shock Wave Application to Cell Cultures

Shock Wave Toepassing op celculturen

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Oppervlakte Potentieel Meting van Bacteriën Met behulp Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Roman Atomic Force Microscopy Based Biopanning voor isolatie van morfologie specifieke reagentia tegen TDP-43 Varianten in Amyotrofische Lateraal Sclerose

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic Force Microscopy Imaging en Force Spectroscopie van Ondersteunde lipidendubbellagen

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Hoge doorvoer Tractiekracht microscopie met behulp van PDM'S onthult dosisafhankelijke effecten van het transformeren van groei factor-β op de epitheliale-naar-mesenchymale overgang

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Fabricage en implementatie van een referentie vrije aandrijfkracht microscopie platform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...