Name: application of atomic force microscopy to detect early osteoarthritis
Uploaded: 2020-05-24T14:00:00
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Nous remercions nos co-auteurs de la publication originale pour leur aide et leur soutien.

Les échantillons de cartilage humain ont été obtenus auprès de patients subissant une arthroplastie totale du genou dans le département de chirurgie orthopédique de l’hôpital universitaire de Tuebingen, en Allemagne, et de l’hôpital Winghofer, Rottenburg a.N., Allemagne, pour l’OA de phase finale du genou. L’approbation complète des comités d’éthique ministériels, institutionnels et locaux a été obtenue avant le début de l’étude (projet numéro 674/2016BO2). Le consentement éclairé écrit a ...

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	<li>Guilak, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pericellular+matrix+as+a+transducer+of+biomechanical+and+biochemical+signals+in+articular+cartilage.">The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).</li><li>Peters, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protective+role+of+the+pericellular+matrix+in+chondrocyte+apoptosis.">The protective role of the pericellular matrix in chondrocyte apoptosis.</a> Tissue Engineering Part A. 17 (15-16), 2017-2024 (2011).</li><li>Larson, C. M., Kelley, S. S., Blackwood, A. D., Banes, A. J., Lee, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+of+the+native+chondrocyte+pericellular+matrix+results+in+significantly+improved+matrix+production.">Retention of the native chondrocyte pericellular matrix results in significantly improved matrix production.</a> Matrix Biology. 21 (4), 349-359 (2002).</li><li>Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+horizontal+patterns+in+the+spatial+organization+of+superficial+zone+chondrocytes+of+human+joints.">Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints.</a> Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).</li><li>Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontally+oriented+clusters+of+multiple+chondrons+in+the+superficial+zone+of+ankle,+but+not+knee+articular+cartilage.">Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage.</a> The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).</li><li>Rolauffs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+preclinical+osteoarthritis:+the+angular+spatial+organization+permits+early+diagnosis.">Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis.</a> Arthritis Rheumatology. 63 (6), 1637-1647 (2011).</li><li>Maver, U., Velnar, T., Gaber&#353;&#269;ek, M., Planin&#353;ek, O., Fin&#353;gar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progressive+use+of+atomic+force+microscopy+in+biomedical+applications.">Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 80, 96-111 (2016).</li><li>Polini, A., Yang, F., Ramalingam, M., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+characterization+of+nanofiber+composites.">Physicochemical characterization of nanofiber composites.</a> Nanofiber Composites for Biomedical Applications. , 97-115 (2017).</li><li>Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+biomechanical+properties+of+the+extracellular+and+pericellular+matrix+and+their+interconnection+throughout+the+course+of+osteoarthritis.">Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis.</a> Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).</li><li>Danalache, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+stiffness+and+biochemical+composition+of+the+pericellular+matrix+as+a+function+of+spatial+chondrocyte+organisation+in+osteoarthritic+cartilage.">Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).</li><li>Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+strategies+for+automated+AFM+force+curve+analysis--I.+Non-adhesive+indentation+of+soft,+inhomogeneous+materials.">Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).</li><li>Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+properties+of+human+mesenchymally-derived+stem+cells+and+primary+osteoblasts,+chondrocytes,+and+adipocytes.">Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes.</a> Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).</li><li>Thambyah, A., Nather, A., Goh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+articular+cartilage+covered+by+the+meniscus.">Mechanical properties of articular cartilage covered by the meniscus.</a> Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 580-588 (2006).</li><li>Choi, A. P., Zheng, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+Young's+modulus+and+Poisson's+ratio+of+soft+tissue+from+indentation+using+two+different-sized+indentors:+finite+element+analysis+of+the+finite+deformation+effect.">Estimation of Young's modulus and Poisson's ratio of soft tissue from indentation using two different-sized indentors: finite element analysis of the finite deformation effect.</a> Medical Biological Engineering Computing. 43 (2), 258-264 (2005).</li><li>Jin, H., Lewis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Poisson's+ratio+of+articular+cartilage+by+indentation+using+different-sized+indenters.">Determination of Poisson's ratio of articular cartilage by indentation using different-sized indenters.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 126 (2), 138-145 (2004).</li></ol>

En utilisant l’AFM comme une technique nouvelle et puissante pour mesurer les propriétés biomécaniques des matériaux biologiques à un niveau à l’échelle nanométrique, nous avons mesuré les propriétés élastiques de l’ECM et du PCM dans le cartilage articulaire ostéoarthritique humain. Des échantillons de cartilage ont été sélectionnés en fonction de leur modèle spatial prédominant de l’organisation de chondrocyte comme biomarqueur basé sur l’image pour la dégénérescence locale de tissu. C...

Le cartilage articulaire est un tissu aneural vasculaire. Les chondrocytes peu dispersés produisent, organisent et maintiennent une vaste matrice extracellulaire (ECM) dans laquelle elles sont intégrées. En tant que partie distincte et spécialisée de l’ECM, les chondrocytes sont entourés d’une fine couche de matrice spécialisée connue sous le nom de matrice périellulaire (PCM). Le PCM agit comme une interface mécanosensitive de matrice cellulaire1 qui protège les chondrocytes2 et module leur réponse biosynthétique3. Comme décrit précédemment4, dans le cartilage sain, les chondrocytes sont disposés dans des modèles spatiaux spécifiques et distincts qui sont spécifiques pour chaque couche de tissu et l’articulation4,5 et dépendent des mécanismes de chargement mécaniques spécifiques aux articulations6. Ces modèles changent des paires et des cordes dans le cartilage sain aux cordes doubles avec le début de l’arthrose (OA). Avec une progression plus poussée de la maladie, les chondrocytes forment de petits amas, augmentant graduellement en taille à de grands groupes dans l’œil avancé. Une perte complète de n’importe quelle structure organisationnelle et l’induction de l’apoptosis est observée dans l’OA de phase finale. Ainsi, l’arrangement cellulaire de chondrocyte peut être employé comme biomarqueur basé sur l’image pour la progressiond’OA 4.
Les propriétés biomécaniques des cellules et des tissus non seulement régulent leur forme et leur fonction, mais sont également cruciales pour maintenir leur vitalité. Les changements dans l’élasticité peuvent propager ou déclencher l’apparition de maladies majeures comme le cancer ou l’œd de l’œux. La microscopie de force atomique (AFM) est apparue comme un outil puissant pour caractériser qualitativement et quantitativement les propriétés biomécaniques de structures cibles biologiques spécifiques à l’échelle microscopique, mesurant un large éventail de forces, du piconewton au micronewton. L’application principale de l’AFM est de mesurer la topographie de surface et les propriétés mécaniques des échantillons à la résolution du sous-nanomètre7. Le dispositif de mesure se compose de trois composants principaux : 1) Une sonde AFM, qui est une pointe pointue montée sur un porte-à-faux et est utilisée pour l’interaction directe avec la surface de l’échantillon. Lorsque la force est appliquée au porte-à-faux, la déformation de ce dernier se produit selon les propriétés du tissu mesuré. 2) Un système optique qui projette un faisceau laser sur le porte-à-faux, qui est ensuite réfléchi à une unité de détecteur. 3) Un détecteur de photodiode qui attrape la lumière déviée du porte-à-faux. Il convertit les informations reçues concernant la déviation laser par le porte-à-faux en une courbe de force qui peut être analysée.
Ainsi, le principe principal de l’AFM est la détection de la force agissant entre la sonde AFM et la structure cible de l’échantillon. Les courbes de force obtenues décrivent les propriétés mécaniques des structures cibles sur la surface de l’échantillon comme l’élasticité, la distribution de charge, la magnétisation, le stress de rendement et la dynamique élastique de déformation plastique8. Un avantage important de l’AFM par rapport à d’autres techniques d’imagerie est que l’AFM peut être utilisé pour mesurer les propriétés mécaniques des cellules vivantes dans les tissus moyens ou dans un état indigène sans endommager le tissu. L’AFM peut fonctionner à la fois dans des conditions liquides ou sèches. Il n’est pas nécessaire de préparer l’échantillon. L’AFM offre la possibilité d’imager un spécimen et de mesurer ses propriétés mécaniques simultanément chez des spécimens proches de conditions physiologiques. Dans la présente étude, nous décrivons une nouvelle approche pour évaluer la progression de l’œuvre d’oE en mesurant l’élasticité du PCM et de l’ECM dans le cartilage articulaire indigène. La corrélation de l’organisation spatiale des chondrocytes avec le degré de dégénérescence locale des tissus fournit une perspective complètement nouvelle pour la détection précoce de l’œux. La pertinence fonctionnelle de ces modèles n’a toutefois pas été évaluée jusqu’à présent. Parce que la fonction principale du cartilage articulaire est la charge portante à faible friction, le tissu doit posséder des propriétés élastiques. L’AFM permet de mesurer non seulement l’élasticité de l’ECM, mais aussi les modèles cellulaires spatiaux intégrés dans leur PCM. La corrélation observée de l’élasticité avec le changement de modèle spatial des chondrocytes est si forte que la mesure de l’élasticité seule peut permettre la stratification de la dégénérescence locale des tissus.
Des moduli élastiques du PCM et de l’ECM ont été évalués en sections minces de 35 m à l’aide d’un système AFM intégré dans un microscope de contraste de phase inversé qui a permis une visualisation simultanée de l’échantillon de cartilage. Ce protocole est basé sur une étude déjà publiée à partir de notre laboratoire9 et décrit spécifiquement comment caractériser l’arrangement spatial des chondrocytes et comment mesurer l’élasticité de leur PCM et ECM associés. Avec chaque changement de modèle des chondrocytes, des changements significatifs dans l’élasticité peuvent également être observés pour le PCM et l’ECM, permettant à cette technique d’être utilisée pour mesurer directement le stade de dégénérescence du cartilage.
Cette approche validée ouvre une nouvelle façon d’évaluer la progression de l’arthrose et les effets thérapeutiques à un stade précoce avant que la dégradation macroscopique des tissus commence réellement à apparaître. L’exécution cohérente des mesures de l’AFM est un processus ardu. Dans le protocole suivant, nous décrivons comment préparer l’échantillon à mesurer par l’AFM, comment effectuer les mesures réelles de l’AFM en commençant par la préparation du porte-à-faux, comment calibrer l’AFM, puis comment effectuer les mesures. Les instructions étape par étape donnent une approche claire et concise pour obtenir des données fiables et fournir des stratégies de base pour le traitement et l’interprétation. La section de discussion décrit également les pièges les plus courants de cette méthode rigoureuse et fournit des conseils utiles de dépannage.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscope (AFM)</td>
			<td>CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM head</td>
			<td>(CellHesion 200) JPK</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocompatible sample glue</td>
			<td>JPK Instruments AG, Berlin, Germany</td>
			<td>H000033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever</td>
			<td>tip C, k &#188; 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria</td>
			<td>AIO-TL-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)</td>
			<td>AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany</td>
			<td>L201306_03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium without L-glutamine</td>
			<td>(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)</td>
			<td>F1315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>07313-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater associated with AFM</td>
			<td>JPK Instruments AG, Berlin, Germany</td>
			<td>T-05-0117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>2023-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td>TPP93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands</td>
			<td>SA6255012</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of atomic force microscopy to detect early osteoarthritis

Les propriétés biomécaniques des cellules et des tissus non seulement régulent leur forme et leur fonction, mais sont également cruciales pour maintenir leur vitalité. Les changements dans l’élasticité peuvent propager ou déclencher l’apparition de maladies majeures comme le cancer ou l’arthrose (arthrose). La microscopie de force atomique (AFM) est apparue comme un outil solide pour caractériser qualitativement et quantitativement les propriétés biomécaniques de structures cibles biologiques spécifiques à l’échelle microscopique, mesurant les forces dans une gamme allant du piconewton au microton. Les propriétés biomécaniques sont d’une importance particulière dans les tissus musculo-squelettiques, qui sont soumis à des niveaux élevés de tension. L’œil de maladie dégénérative du cartilage entraîne la perturbation de la matrice périellulaire (PCM) et le réarrangement spatial des chondrocytes intégrés dans leur matrice extracellulaire (ECM). La perturbation du PCM et de l’ECM a été associée à des changements dans les propriétés biomécaniques du cartilage. Dans la présente étude, nous avons utilisé l’AFM pour quantifier ces changements par rapport aux changements spécifiques de modèle spatial des chondrocytes. À chaque changement de modèle, des changements significatifs dans l’élasticité ont été observés pour le PCM et l’ECM. La mesure de l’élasticité locale permet ainsi de tirer des conclusions directes sur le degré de dégénérescence locale des tissus dans l’œuvre d’oE.

Le long du modèle physiopathologique des cordes aux cordes doubles, en passant par les petits et enfin les gros groupes, ECM(figure 3A) et PCM(figure 3B)moduli élastique ont diminué de manière significative entre chaque changement de modèle. La seule exception était la différence d’ECM entre les cordes et les cordes doubles (p - 0,072). Les résultats montrent que le ratio ECM/PCM(figure 4B) n’a pas changé de façon sign...

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Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Nous présentons une méthode pour étudier les changements ostéoarthritiques tôt au niveau cellulaire dans le cartilage articulaire en utilisant la microscopie de force atomique (AFM).

Application de la microscopie de force atomique pour détecter l’arthrose précoce

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Les propriétés biomécaniques des cellules et des tissus régulent leur fonction et leur vitalité. L’AFM permet la quantification précoce de l’arthrose au niveau cellulaire basée sur des mesures d’élasticité. L’AFM permet l’acquisition de mesures au niveau cellulaire sans endommager l’échantillon et avec une haute résolution, fiabilité et sensibilité.Les changements de propriété biomécanique se produisent tôt dans l’ostéoarthrite. La mesure de l’élasticité locale du cartilage articulaire permet de tirer des conclusions valables sur le degré de dégénérescence des tissus locaux. Pour évaluer les changements dégénératifs dans l’articulation du genou humain, utilisez d’abord un scalpel pour couper le cartilage articulaire dans son ensemble de l’os subchondral et intégrer l’échantillon de cartilage dans le milieu d’intégration soluble dans l’eau sur le bouton Cryotome qui gèle sous basse température dans le dispositif Cryotome.Lorsque l’échantillon est gelé, utilisez un Cryotome standard pour acquérir une section de tissu de 35 micromètres d’épaisseur à partir de la couche supérieure du cartilage articulaire, recueillant chaque section sur des toboggans en verre individuels. Lorsque toutes les sections ont été obtenues, rincer les échantillons trois fois dans du PBS frais pendant cinq minutes par lavage pour enlever le milieu d’intégration soluble dans l’eau. Retirer la première diapositive du lavage.Après cela, ajouter deux à trois gouttes de colle d’échantillon biocompatible par section dans des boîtes de Pétri compatibles avec l’AFM. Retirez tout excès de solution de l’échantillon et appuyez doucement sur les bords de la section séchée sur les taches de colle. Après deux minutes, couvrir soigneusement les tissus collés avec le milieu L-15 de Leibovitz sans L-glutamine et placer les plats dans un incubateur de culture cellulaire jusqu’à ce que les échantillons doivent être analysés.Pour préparer l’appareil AFM, ajustez un bloc de gaz pour mesurer dans un environnement liquide sur le support AFM à ce que la surface supérieure est parallèle au support, et utilisez des pinces à épiler pour monter soigneusement le porte-à-faux sélectionné sur la surface du bloc de verre de sorte que la pointe AFM avec la microsphère dépasse sur le plan optique poli. Pour stabiliser le porte-à-faux sur le bloc de verre, faites glisser le ressort métallique dans la rainure du bloc et utilisez des pinces à épiler pour serrer le dessus du porte-à-faux avec le ressort. Placez soigneusement le bloc de verre avec le porte-à-faux sur la tête de l’AFM et fixez le bloc avec le mécanisme de verrouillage intégré.Montez ensuite la tête de l’AFM avec le porte-à-faux sur l’appareil AFM avec le ressort orienté vers la gauche. Pour monter l’échantillon sur l’appareil AFM, placez l’échantillon de boîte de Petri sur le porte-échantillon AFM et réglez le chauffe-vaisselle Petri à 37 degrés Celsius. Après environ 20 minutes, ouvrez le logiciel de l’appareil et l’alignement laser et approchez les fenêtres de réglage des paramètres.Ensuite, allumez le moteur stepper, la lumière laser et la caméra CCD et utilisez la fonction moteur stepper pour abaisser le porte-à-faux en 100 étapes de micromètre jusqu’à ce que le porte-à-faux soit complètement immergé dans le milieu. Utilisez les vis d’ajustement pour diriger le laser sur le dessus du porte-à-faux et utilisez les vis du dispositif AFM pour régler le faisceau laser de sorte que le faisceau réfléchi tombe sur le centre du photodétecteur. Une fois que le porte-à-faux laser a été ajusté, réglez le photodétecteur au besoin pour régler le signal de somme à un volt ou au-dessus et les déviations latérales et verticales à près de zéro.Pour obtenir la courbe de force d’étalonnage, exécutez une approche scanner avec les paramètres d’approche indiqués dans le tableau. Une fois que le fond du plat de culture tissulaire est atteint, rétractez le porte-à-faux de 100 micromètres. Configurer les paramètres d’exécuter comme indiqué dans le tableau.Et cliquez sur exécuter pour démarrer une mesure et pour obtenir une courbe de distance de force d’étalonnage. La courbe de force est obtenue comme illustré dans la figure. Sur la courbe de distance de force d’étalonnage, sélectionnez la région pour un ajustement linéaire de la courbe rétractée.Une fois que l’ajustement linéaire est en place, les valeurs seront enregistrées par le logiciel. Ensuite, comme les mesures sont effectuées en moyenne à 37 degrés Celsius de température, réglez la variable de température dans le logiciel à 37 degrés pour imiter les conditions physiologiques aussi étroitement que possible. Pour identifier les modèles conversites dans les sections d’échantillon de cartilage, localisez et identifiez les modèles cellulaires spécifiques du cartilage articulaire du genou arthrose sur le microscope de contraste de phase, qui peut inclure des cordes simples indicatives des secteurs sains de tissu, des doubles cordes indicatif du début de la dégénérescence de tissu, de petits amas, qui sont des signes de dégénérescence avancée de tissu, et de grands amas, indicatifs de destruction de tissu de phase finale.Une fois qu’un modèle spécifique désiré a été identifié, pour les mesures de matrice péricellulaire, placez le porte-à-faux à proximité des cellules et mesurez deux emplacements par modèle choisi par type de matrice, neuf fois par site de mesure, y compris une taille d’échantillon suffisamment grande pour tenir compte des inexactitudes possibles. Concentrez-vous sur la matrice cellulaire du modèle à mesurer et à fixer la souris de l’ordinateur à ce moment-là. Ensuite, concentrez-vous sur la sonde et déplacez la pointe de la sonde au point précédemment fixé par la flèche de l’ordinateur.Pour effectuer des mesures de la matrice extracellulaire, sélectionnez une région sans cellules et effectuez une approche suivie d’une rétractation de sorte que le porte-à-faux soit positionné à 100 micromètres au-dessus du tissu. Cliquez ensuite sur exécuter pour démarrer les mesures, en utilisant le paramètre de point défini obtenu par étalonnage du porte-à-faux. Pour traiter les données obtenues, ouvrir un logiciel de traitement des données compatible avec les données obtenues à partir de l’appareil AFM et sélectionner le modèle Hearst dans le logiciel pour le traitement des courbes de distance de force.Réglez le rapport Poisson à 0,5, la forme de la pointe comme sphérique, et le rayon de pointe à 12,5 micromètres. Une fois que tous les paramètres auront été ajustés, les résultats seront ajustés et le Modulus du Jeune sera calculé par le logiciel. Le long du modèle physiopathologique, des cordes aux doubles cordes et des petites aux grandes grappes, le moduli élastique de matrice extracellulaire et péricellulaire diminue considérablement entre chaque changement de motif, sauf entre les cordes et les doubles cordes.En outre, le rapport de matrice extracellulaire-péricellulaire ne change pas de manière significative, tandis qu’une diminution marquée des différences absolues d’élasticité entre les matrices extracellulaires et péricellulaires est observée. Les valeurs d’élasticité dépendent de diverses conditions telles que la profondeur d’indentation ou les propriétés de pointe en porte-à-faux. AFM est donc le mieux adapté à la comparaison de conditions différentes dans la même configuration expérimentale.Comme l’AFM mesure l’élasticité locale de l’échantillon, les sections doivent être fixées afin de permettre des mesures précises et d’éviter les dommages causés par le porte-à-faux. Pour analyser davantage les processus responsables des changements d’élasticité des tissus, la quantification biochimique de la structure des protéines d’intérêt peut être effectuée par l’intermédiaire de taches occidentales ou d’ELISAs.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Immobilisation bactérienne pour l&#39;imagerie par microscopie à force atomique

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

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Bio-ingénierie

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Visualisation de l&#39;ADN recombinant et des complexes de protéines par microscopie à force atomique

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

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Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mesurer les propriétés mécaniques des cellules vivantes par microscopie à force atomique

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