Name: application of atomic force microscopy to detect early osteoarthritis
Uploaded: 2020-05-24T14:00:00
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Wir danken unseren Co-Autoren aus der Originalpublikation für ihre Hilfe und Unterstützung.

Die menschlichen Knorpelproben wurden von Patienten entnommen, die sich einer totalen Kniearthroplastik in der Klinik für Orthopädische Chirurgie des Universitätsklinikums Tübingen und dem Winghofer-Krankenhaus Rottenburg a.N. für die Endphase des Knies unterziehen. Vor Beginn der Studie wurde die vollständige Genehmigung des Abteilungs-, institutionellen und lokalen Ethikausschusses eingeholt (Projektnummer 674/2016BO2). Vor der Teilnahme wurde von allen Patienten eine schriftliche Einwilligung in Kenntnis der Sac...

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	<li>Guilak, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pericellular+matrix+as+a+transducer+of+biomechanical+and+biochemical+signals+in+articular+cartilage.">The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).</li><li>Peters, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protective+role+of+the+pericellular+matrix+in+chondrocyte+apoptosis.">The protective role of the pericellular matrix in chondrocyte apoptosis.</a> Tissue Engineering Part A. 17 (15-16), 2017-2024 (2011).</li><li>Larson, C. M., Kelley, S. S., Blackwood, A. D., Banes, A. J., Lee, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+of+the+native+chondrocyte+pericellular+matrix+results+in+significantly+improved+matrix+production.">Retention of the native chondrocyte pericellular matrix results in significantly improved matrix production.</a> Matrix Biology. 21 (4), 349-359 (2002).</li><li>Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+horizontal+patterns+in+the+spatial+organization+of+superficial+zone+chondrocytes+of+human+joints.">Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints.</a> Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).</li><li>Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontally+oriented+clusters+of+multiple+chondrons+in+the+superficial+zone+of+ankle,+but+not+knee+articular+cartilage.">Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage.</a> The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).</li><li>Rolauffs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+preclinical+osteoarthritis:+the+angular+spatial+organization+permits+early+diagnosis.">Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis.</a> Arthritis Rheumatology. 63 (6), 1637-1647 (2011).</li><li>Maver, U., Velnar, T., Gaber&#353;&#269;ek, M., Planin&#353;ek, O., Fin&#353;gar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progressive+use+of+atomic+force+microscopy+in+biomedical+applications.">Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 80, 96-111 (2016).</li><li>Polini, A., Yang, F., Ramalingam, M., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+characterization+of+nanofiber+composites.">Physicochemical characterization of nanofiber composites.</a> Nanofiber Composites for Biomedical Applications. , 97-115 (2017).</li><li>Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+biomechanical+properties+of+the+extracellular+and+pericellular+matrix+and+their+interconnection+throughout+the+course+of+osteoarthritis.">Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis.</a> Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).</li><li>Danalache, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+stiffness+and+biochemical+composition+of+the+pericellular+matrix+as+a+function+of+spatial+chondrocyte+organisation+in+osteoarthritic+cartilage.">Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).</li><li>Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+strategies+for+automated+AFM+force+curve+analysis--I.+Non-adhesive+indentation+of+soft,+inhomogeneous+materials.">Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).</li><li>Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+properties+of+human+mesenchymally-derived+stem+cells+and+primary+osteoblasts,+chondrocytes,+and+adipocytes.">Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes.</a> Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).</li><li>Thambyah, A., Nather, A., Goh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+articular+cartilage+covered+by+the+meniscus.">Mechanical properties of articular cartilage covered by the meniscus.</a> Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 580-588 (2006).</li><li>Choi, A. P., Zheng, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+Young's+modulus+and+Poisson's+ratio+of+soft+tissue+from+indentation+using+two+different-sized+indentors:+finite+element+analysis+of+the+finite+deformation+effect.">Estimation of Young's modulus and Poisson's ratio of soft tissue from indentation using two different-sized indentors: finite element analysis of the finite deformation effect.</a> Medical Biological Engineering Computing. 43 (2), 258-264 (2005).</li><li>Jin, H., Lewis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Poisson's+ratio+of+articular+cartilage+by+indentation+using+different-sized+indenters.">Determination of Poisson's ratio of articular cartilage by indentation using different-sized indenters.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 126 (2), 138-145 (2004).</li></ol>

Mit AFM als neuartige und leistungsstarke Technik zur Messung der biomechanischen Eigenschaften biologischer Materialien auf nanoskaliger Ebene haben wir die elastischen Eigenschaften von ECM und PCM im menschlichen osteoarthritischen Gelenkknorpel gemessen. Knorpelproben wurden nach ihrem vorherrschenden räumlichen Muster der Chondrozytenorganisation als bildbasierter Biomarker für die lokale Gewebedegeneration ausgewählt. Erwartungsgemäß wurde ein starker Rückgang der Elastizitätswerte sowohl von ECM als auch vo...

Gelenkknorpel ist ein avaskuläres, aneurales Gewebe. Spärlich verstreute Chondrozyten produzieren, organisieren und pflegen eine expansive extrazelluläre Matrix (ECM), in die sie eingebettet sind. Als eigenständiger und spezialisierter Teil des ECM sind Chondrozyten von einer dünnen Schicht spezialisierter Matrix umgeben, die als perizelluläre Matrix (PCM) bekannt ist. Das PCM fungiert als mechanosensitive Zellmatrix-Schnittstelle1, die die Chondrozyten2 schützt und ihre biosynthetische Reaktion moduliert3. Wie bereits beschrieben4, sind Chondrozyten in gesunden Knorpeln in spezifischen, unterschiedlichen räumlichen Mustern angeordnet, die für jede Gewebeschicht und jedes Gelenk4,5 spezifisch sind und von gelenkspezifischen mechanischen Lademechanismen abhängen6. Diese Muster ändern sich mit Beginn der Arthrose (OA) von Paaren und Saiten im gesunden Knorpel zu Doppeltenitern. Mit dem weiteren Fortschreiten der Krankheit bilden die Chondrozyten kleine Cluster, die allmählich zu großen Clustern in fortgeschrittenen OA anwachsen. Ein vollständiger Verlust jeglicher Organisationsstruktur und Induktion von Apoptose wird in der Endstufe OA beobachtet. Somit kann Chondrozyten-Zellanordnung als bildbasierter Biomarker für OA-Progression4verwendet werden.
Biomechanische Eigenschaften von Zellen und Geweben regulieren nicht nur ihre Form und Funktion, sondern sind auch entscheidend für die Erhaltung ihrer Vitalität. Veränderungen der Elastizität können sich ausbreiten oder den Beginn von schweren Krankheiten wie Krebs oder OA auslösen. Die Atomkraftmikroskopie (AFM) hat sich zu einem leistungsfähigen Werkzeug entwickelt, um die biomechanischen Eigenschaften spezifischer biologischer Zielstrukturen auf mikroskopischer Ebene qualitativ und quantitativ zu charakterisieren und dabei ein breites Spektrum an Kraft von Piconewton bis Mikronewton zu messen. Die Hauptanwendung von AFM ist die Messung der Oberflächentopographie und der mechanischen Eigenschaften von Proben mit Subnanometer-Auflösung7. Das Messgerät besteht aus drei Hauptkomponenten: 1) Eine AFM-Sonde, die eine scharfe Spitze ist, die auf einem Ausleger montiert ist und für die direkte Interaktion mit der Oberfläche der Probe verwendet wird. Wenn Kraft auf den Ausleger ausgeübt wird, tritt eine Verformung des letzteren entsprechend den Eigenschaften des gemessenen Gewebes auf. 2) Ein optisches System, das einen Laserstrahl auf den Ausleger projiziert, der dann auf eine Detektoreinheit reflektiert wird. 3) Ein Photodiodendetektor, der das vom Ausleger abgelenkte Licht einfängt. Es wandelt die empfangenen Informationen über die Laserverformung durch den Ausleger in eine Kraftkurve um, die analysiert werden kann.
Das Hauptprinzip von AFM ist daher die Detektion der Kraft, die zwischen der AFM-Sonde und der Zielstruktur der Probe wirkt. Die erhaltenen Kraftkurven beschreiben die mechanischen Eigenschaften der Zielstrukturen auf der Probenoberfläche wie Elastizität, Ladungsverteilung, Magnetisierung, Streckgrenze und elastische plastische Verformungsdynamik8. Ein wichtiger Vorteil von AFM gegenüber anderen bildgebenden Verfahren ist, dass AFM verwendet werden kann, um die mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen in mittleren oder Geweben in einem nativen Zustand zu messen, ohne das Gewebe zu beschädigen. AFM kann sowohl in flüssigen als auch trockenen Bedingungen betrieben werden. Eine Probenvorbereitung ist nicht erforderlich. AFM bietet die Möglichkeit, eine Probe abzubilden und ihre mechanischen Eigenschaften gleichzeitig in Proben zu messen, die sich in der Nähe physiologischer Bedingungen befinden. In der vorliegenden Studie beschreiben wir einen neuartigen Ansatz zur Beurteilung der OA-Progression, indem wir die Elastizität von PCM und ECM im nativen Gelenkknorpel messen. Die Korrelation der räumlichen Organisation von Chondrozyten mit dem Grad der lokalen Gewebedegeneration bietet eine völlig neue Perspektive für die Früherkennung von OA. Die funktionale Relevanz dieser Muster wurde jedoch bisher nicht bewertet. Da die Hauptfunktion des Gelenkknorpels das Tragen bei geringer Reibung ist, muss das Gewebe elastische Eigenschaften besitzen. AFM ermöglicht es, nicht nur die Elastizität des ECM zu messen, sondern auch die räumlichen zellulären Muster, die in ihr PCM eingebettet sind. Die beobachtete Korrelation der Elastizität mit der räumlichen Musteränderung der Chondrozyten ist so stark, dass die Messung der Elastizität allein eine Schichtung der lokalen Gewebedegeneration ermöglichen kann.
Die elastischen Module des PCM und des ECM wurden in 35 m dünnen Abschnitten mit einem Invertierten Phasenkontrastmikroskop untersucht, das eine gleichzeitige Visualisierung der Knorpelprobe ermöglichte. Dieses Protokoll basiert auf einer bereits aus unserem Labor9 veröffentlichten Studie und beschreibt speziell, wie die räumliche Anordnung der Chondrozyten charakterisiert und wie die Elastizität der zugehörigen PCM und ECM gemessen werden kann. Bei jeder Musteränderung der Chondrozyten können auch signifikante Veränderungen der Elastizität sowohl für das PCM als auch für das ECM beobachtet werden, so dass diese Technik verwendet werden kann, um das Stadium der Degeneration des Knorpels direkt zu messen.
Dieser validierte Ansatz eröffnet eine neue Möglichkeit, die OA-Progression und die therapeutischen Wirkungen in frühen Stadien zu bewerten, bevor der makroskopische Gewebeabbau tatsächlich auftritt. AFM-Messungen konsequent durchzuführen, ist ein mühsamer Prozess. Im folgenden Protokoll beschreiben wir, wie man die von AFM zu messende Probe vorbereitet, wie man die tatsächlichen AFM-Messungen ab der Vorbereitung des Auslegers durchführt, wie man den AFM kalibriert und wie man dann die Messungen durchführt. Schritt-für-Schritt-Anleitungen geben einen klaren und präzisen Ansatz, um zuverlässige Daten zu erhalten und grundlegende Strategien für deren Verarbeitung und Interpretation bereitzustellen. Im Diskussionsabschnitt werden auch die häufigsten Fallstricke dieser strengen Methode beschrieben und hilfreiche Tipps zur Fehlerbehebung gegeben.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscope (AFM)</td>
			<td>CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM head</td>
			<td>(CellHesion 200) JPK</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocompatible sample glue</td>
			<td>JPK Instruments AG, Berlin, Germany</td>
			<td>H000033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever</td>
			<td>tip C, k &#188; 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria</td>
			<td>AIO-TL-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)</td>
			<td>AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany</td>
			<td>L201306_03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium without L-glutamine</td>
			<td>(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)</td>
			<td>F1315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>07313-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater associated with AFM</td>
			<td>JPK Instruments AG, Berlin, Germany</td>
			<td>T-05-0117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>2023-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td>TPP93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands</td>
			<td>SA6255012</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of atomic force microscopy to detect early osteoarthritis

Biomechanische Eigenschaften von Zellen und Geweben regulieren nicht nur ihre Form und Funktion, sondern sind auch entscheidend für die Erhaltung ihrer Vitalität. Veränderungen der Elastizität können sich ausbreiten oder das Auslösen von schweren Krankheiten wie Krebs oder Arthrose (OA) auslösen. Die Atomkraftmikroskopie (AFM) hat sich zu einem starken Werkzeug entwickelt, um die biomechanischen Eigenschaften spezifischer biologischer Zielstrukturen auf mikroskopischer Ebene qualitativ und quantitativ zu charakterisieren und Kräfte in einem Bereich von so klein wie dem Piconewton bis zum Mikronewton zu messen. Biomechanische Eigenschaften sind von besonderer Bedeutung bei Muskel-Skelett-Geweben, die hohen Belastungen ausgesetzt sind. OA als degenerative Erkrankung des Knorpels führt zur Störung der perizellulären Matrix (PCM) und zur räumlichen Neuanordnung der in ihre extrazelluläre Matrix (ECM) eingebetteten Chondrozyten. Störungen in PCM und ECM wurden mit Veränderungen der biomechanischen Eigenschaften des Knorpels in Verbindung gebracht. In der vorliegenden Studie haben wir AFM verwendet, um diese Veränderungen in Bezug auf die spezifischen räumlichen Musteränderungen der Chondrozyten zu quantifizieren. Mit jeder Musteränderung wurden signifikante Veränderungen der Elastizität sowohl für das PCM als auch für das ECM beobachtet. Die Messung der lokalen Elastizität ermöglicht somit direkte Rückschlüsse auf den Grad der lokalen Gewebedegeneration in OA.

Entlang des physiopathologischen Modells von Saiten zu Doppelsaiten, zu kleinen und schließlich zu großen Clustern, verringerten sich sowohl ECM (Abbildung 3A) als auch PCM (Abbildung 3B) elastische Module zwischen jeder Musteränderung signifikant. Die einzige Ausnahme war der Unterschied im ECM zwischen Zeichenfolgen und Doppelzeichenfolgen (p = 0,072). Die Ergebnisse zeigen, dass sich das ECM/PCM-Verhältnis (Abbildung 4B) nich...

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Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Wir präsentieren eine Methode zur Untersuchung früher osteoarthritischer Veränderungen auf zellulärer Ebene im Gelenkknorpel mittels Atomkraftmikroskopie (AFM).

Anwendung der Atomkraftmikroskopie zur Erkennung früher Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Die biomechanischen Eigenschaften von Zellen und Geweben regulieren ihre Funktion und Vitalität. AFM ermöglicht die frühe Quantifizierung von Arthrose auf zellulärer Ebene basierend auf Elastizitätsmessungen. AFM ermöglicht die Erfassung von Messungen auf zellulärer Ebene, ohne die Probe zu beschädigen und mit einer hohen Auflösung, Zuverlässigkeit und Empfindlichkeit.Biomechanische Eigenschaftsänderungen treten früh bei Arthrose auf. Die Messung der lokalen Elastizität des Gelenkknorpels ermöglicht es, stichhaltige Rückschlüsse auf den Grad der lokalen Gewebedegeneration zu ziehen. Um degenerative Veränderungen innerhalb des menschlichen Kniegelenks zu bewerten, verwenden Sie zunächst ein Skalpell, um den Gelenkknorpel als Ganzes aus dem subchondralen Knochen zu schneiden und die Knorpelprobe in ein wasserlösliches Einbettmedium auf dem Cryotome-Knopf einzubetten, der bei niedriger Temperatur im Cryotome-Gerät gefriert.Wenn die Probe eingefroren ist, verwenden Sie ein Standard-Kryotome, um einen 35 Mikrometer dicken Gewebeabschnitt aus der obersten Schicht des Gelenkknorpels zu erfassen und jeden Abschnitt auf einzelne Glasschlitten zu sammeln. Wenn alle Abschnitte erhalten sind, spülen Sie die Proben dreimal in frischem PBS für fünf Minuten pro Wäsche, um das wasserlösliche Einbettmedium zu entfernen. Entfernen Sie die erste Folie aus der Wäsche.Danach zwei bis drei Tropfen biokompatiblen Probenkleber pro Abschnitt in einzelne AFM-kompatible Petrischalen geben. Entfernen Sie überschüssige Lösung aus der Probe und drücken Sie vorsichtig die Ränder des getrockneten Abschnitts auf die Klebeflecken. Nach zwei Minuten die geklebten Gewebe ohne L-Glutamin vorsichtig mit Leibovitz' L-15-Medium bedecken und die Gerichte in einen Zellkultur-Inkubator legen, bis die Proben analysiert werden sollen.Um das AFM-Gerät vorzubereiten, stellen Sie einen Gasblock für die Messung in einer flüssigen Umgebung auf dem AFM-Halter so ein, dass die obere Oberfläche parallel zum Halter ist, und verwenden Sie eine Pinzette, um den ausgewählten Ausleger sorgfältig auf die Oberfläche des Glasblocks zu montieren, so dass die AFM-Spitze mit der Mikrosphäre über die polierte optische Ebene ragt. Um den Ausleger auf dem Glasblock zu stabilisieren, schieben Sie die metallische Feder in die Nut des Blocks, und verwenden Sie eine Pinzette, um die Oberseite des Auslegers mit der Feder zu klemmen. Stellen Sie den Glasstein mit dem Ausleger vorsichtig auf den AFM-Kopf und sichern Sie ihn mit dem integrierten Verriegelungsmechanismus.Dann montieren Sie den AFM-Kopf mit dem Ausleger auf das AFM-Gerät mit der Feder nach links. Um die Probe auf das AFM-Gerät zu montieren, legen Sie die Probe Petrischale auf den AFM-Probenhalter und stellen Sie die Petrischale auf 37 Grad Celsius. Öffnen Sie nach ca. 20 Minuten die Gerätesoftware und die Laserausrichtung und nähern Sie parametereinstellungsfenster an.Schalten Sie als Nächstes den Schrittmotor, das Laserlicht und die CCD-Kamera ein und verwenden Sie die Schrittmotorfunktion, um den Ausleger in 100 Mikrometer-Schritten zu senken, bis der Ausleger vollständig in das Medium getaucht ist. Verwenden Sie die Einstellschrauben, um den Laser auf die Oberseite des Auslegers zu richten, und verwenden Sie die AFM-Geräteschrauben, um den Laserstrahl so einzustellen, dass der reflektierte Strahl auf die Mitte des Photodetektors fällt. Sobald der Laserausleger eingestellt wurde, stellen Sie den Photodetektor nach Bedarf ein, um das Summensignal auf einen Volt oder höher und die seitlichen und vertikalen Verformungen nahe Null einzustellen.Um die Kalibrierkraftkurve zu erhalten, führen Sie einen Scanneransatz mit den in der Tabelle angegebenen Anflugparametern aus. Sobald der Boden der Gewebekulturschale erreicht ist, ziehen Sie den Ausleger um 100 Mikrometer zurück. Richten Sie die Ausführungsparameter ein, wie in der Tabelle angegeben.Und klicken Sie auf Ausführen, um eine Messung zu starten und eine Kalibrierkraftentfernungskurve zu erhalten. Die Kraftkurve wird wie in der Abbildung dargestellt ermittelt. Wählen Sie in der Abstandskurve der Kalibrierkraft den Bereich für eine lineare Anpassung der eingefahrenen Kurve aus.Sobald die lineare Passung vorhanden ist, werden die Werte von der Software gespeichert. Wenn die Messungen dann in Mittelbei 37 Grad Celsius durchgeführt werden, stellen Sie die Temperaturvariable in der Software auf 37 Grad ein, um die physiologischen Bedingungen so genau wie möglich nachzuahmen. Um die Konversitenmuster in den Knorpelprobenabschnitten zu identifizieren, lokalisieren und identifizieren Sie die spezifischen zellulären Muster des Gelenkknorpels aus dem osteoarthritischen Knie auf dem Phasenkontrastmikroskop, das einzelne Saiten enthalten kann, die auf gesunde Gewebebereiche hinweisen, Doppelsaiten, die auf den Beginn der Gewebedegeneration hinweisen, kleine Cluster, die Anzeichen einer fortgeschrittenen Gewebedegeneration sind, und große Cluster, die auf eine Gewebezerstörung im Endstadium hinweisen.Sobald ein bestimmtes gewünschtes Muster identifiziert wurde, positionieren Sie den Ausleger bei perizellulären Matrixmessungen in unmittelbarer Nähe zu den Zellen und messen zwei Standorte pro gewähltem Muster pro Matrixtyp, neunmal pro Messstelle, einschließlich einer Stichprobengröße, die groß genug ist, um mögliche Ungenauigkeiten zu berücksichtigen. Konzentrieren Sie sich auf die zelluläre Matrix des zu messenden Musters und fixieren Sie die Computermaus an diesem Punkt. Konzentrieren Sie sich anschließend auf die Sonde, und bewegen Sie die Spitze der Sonde auf den Punkt, der zuvor durch den Computerpfeil festgelegt wurde.Um Messungen der extrazellulären Matrix durchzuführen, wählen Sie einen Bereich ohne Zellen aus und führen sie einen Ansatz durch, gefolgt von einem Rückzug, so dass der Ausleger 100 Mikrometer über dem Gewebe positioniert ist. Klicken Sie dann auf Ausführen, um die Messungen zu starten, indem Sie den Sollwertparameter verwenden, der durch Kalibrierung des Auslegers erhalten wurde. Um die erhaltenen Daten zu verarbeiten, öffnen Sie eine Datenverarbeitungssoftware, die mit den vom AFM-Gerät erhaltenen Daten kompatibel ist, und wählen Sie in der Software das Hearst-Modell für die Verarbeitung der Kraftentfernungskurven aus.Legen Sie das Poisson-Verhältnis auf 0,5, die Spitzenform als kugelförmig und den Spitzenradius auf 12,5 Mikrometer fest. Sobald alle Parameter angepasst wurden, werden die Ergebnisse angepasst und der Young es Modulus wird von der Software berechnet. Entlang des physiopathologischen Modells von Saiten zu Doppelsaiten und von kleinen zu großen Clustern nehmen sowohl extrazelluläre als auch perizelluläre Matrix-Elastikmodule zwischen jeder Musteränderung signifikant ab, außer zwischen Strings und Doppelsaiten.Darüber hinaus ändert sich das extrazelluläre-perizelläre Matrixverhältnis nicht signifikant, während eine deutliche Abnahme der absoluten Unterschiede in der Elastizität zwischen den extrazellulären und perizellulären Matrizen beobachtet wird. Elastizitätswerte hängen von verschiedenen Bedingungen ab, z. B. der Einzugstiefe oder den Auslegerspitzeneigenschaften. AFM eignet sich daher am besten für den Vergleich verschiedener Bedingungen innerhalb desselben Versuchsaufbaus.Da der AFM die lokale Elastizität der Probe misst, müssen die Abschnitte fixiert werden, um präzise Messungen zu ermöglichen und Auslegerschäden zu vermeiden. Um die Prozesse, die für Gewebeelastizitätsänderungen verantwortlich sind, weiter zu analysieren, kann die biochemische Quantifizierung der Struktur von Proteinen von Interesse über westliche Flecken oder ELISAs durchgeführt werden.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Bakterielle Immobilisierung für Imaging von Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Forschung

Biotechnik

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Visualisierung von rekombinanten DNA-und Protein-Komplexe mit Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Die Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften des Endothelial Glykokalyx mit Atomic Force Microscopy

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Shock Wave Application to Cell Cultures

Shock Wave Anwendung auf Zellkulturen

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Oberflächenpotentialmessung von Bakterien mit Kelvin-Sonde Kraftmikroskopie

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Novel Rasterkraftmikroskopie.Wie Biopanning für Isolierung von Morphologie Spezifische Reagenzien gegen TDP-43 Varianten in Amyotrophe Lateralsklerose

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Hochdurchsatz-Traktionskraftmikroskopie mit PDMS zeigt dosisabhängige Effekte transformierender Wachstumsfaktoren auf den epitheliaal-mesenchymalen Übergang

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Herstellung und Implementierung einer referenzfreien Traktionskraftmikroskopie-Plattform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...