Name: application of atomic force microscopy to detect early osteoarthritis
Uploaded: 2020-05-24T14:00:00
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Ringraziamo i nostri co-autori della pubblicazione originale per il loro aiuto e supporto.

I campioni di cartilagine umana sono stati ottenuti da pazienti sottoposti a artroplastica totale del ginocchio nel Dipartimento di Chirurgia Ortopedica dell'Ospedale Universitario di Tuebingen, Germania, e l'ospedale Winghofer, Rottenburg a.N., Germania, per l'OA allo stadio finale del ginocchio. Prima dell'inizio dello studio (progetto numero 674/2016BO2). Il consenso informato scritto è stato ricevuto da tutti i pazienti prima della partecipazione. I metodi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida approv...

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	<li>Guilak, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pericellular+matrix+as+a+transducer+of+biomechanical+and+biochemical+signals+in+articular+cartilage.">The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).</li><li>Peters, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protective+role+of+the+pericellular+matrix+in+chondrocyte+apoptosis.">The protective role of the pericellular matrix in chondrocyte apoptosis.</a> Tissue Engineering Part A. 17 (15-16), 2017-2024 (2011).</li><li>Larson, C. M., Kelley, S. S., Blackwood, A. D., Banes, A. J., Lee, G. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontally+oriented+clusters+of+multiple+chondrons+in+the+superficial+zone+of+ankle,+but+not+knee+articular+cartilage.">Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage.</a> The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).</li><li>Rolauffs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+preclinical+osteoarthritis:+the+angular+spatial+organization+permits+early+diagnosis.">Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis.</a> Arthritis Rheumatology. 63 (6), 1637-1647 (2011).</li><li>Maver, U., Velnar, T., Gaber&#353;&#269;ek, M., Planin&#353;ek, O., Fin&#353;gar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progressive+use+of+atomic+force+microscopy+in+biomedical+applications.">Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 80, 96-111 (2016).</li><li>Polini, A., Yang, F., Ramalingam, M., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+characterization+of+nanofiber+composites.">Physicochemical characterization of nanofiber composites.</a> Nanofiber Composites for Biomedical Applications. , 97-115 (2017).</li><li>Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. 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C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+strategies+for+automated+AFM+force+curve+analysis--I.+Non-adhesive+indentation+of+soft,+inhomogeneous+materials.">Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).</li><li>Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+properties+of+human+mesenchymally-derived+stem+cells+and+primary+osteoblasts,+chondrocytes,+and+adipocytes.">Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes.</a> Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).</li><li>Thambyah, A., Nather, A., Goh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+articular+cartilage+covered+by+the+meniscus.">Mechanical properties of articular cartilage covered by the meniscus.</a> Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 580-588 (2006).</li><li>Choi, A. P., Zheng, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+Young's+modulus+and+Poisson's+ratio+of+soft+tissue+from+indentation+using+two+different-sized+indentors:+finite+element+analysis+of+the+finite+deformation+effect.">Estimation of Young's modulus and Poisson's ratio of soft tissue from indentation using two different-sized indentors: finite element analysis of the finite deformation effect.</a> Medical Biological Engineering Computing. 43 (2), 258-264 (2005).</li><li>Jin, H., Lewis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Poisson's+ratio+of+articular+cartilage+by+indentation+using+different-sized+indenters.">Determination of Poisson's ratio of articular cartilage by indentation using different-sized indenters.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 126 (2), 138-145 (2004).</li></ol>

Utilizzando L'AFM come nuova e potente tecnica per misurare le proprietà biomeccaniche dei materiali biologici a livello su nanoscala, abbiamo misurato le proprietà elastiche dell'ECM e del PCM nella cartilagine articolare osteoartritica umana. I campioni della cartilagine sono stati selezionati in base al loro modello spaziale predominante dell'organizzazione dei condrociti come biomarcatore basato su immagini per la degenerazione dei tessuti locali. Come previsto, è stato osservato un forte calo dei valori di elasti...

La cartilagine articolare è un tessuto avascolare e aneurale. Condrociti scarsamente sparsi producono, organizzano e mantengono una matrice extracellulare espansiva (ECM) in cui sono incorporati. Come parte distinta e specializzata dell'ECM, i condrociti sono circondati da un sottile strato di matrice specializzata noto come matrice pericellulare (PCM). Il PCM agisce come un'interfaccia a matrice cellulare meccanosensitive1 che protegge i condrociti2 e modula la loro risposta biosintetica3. Come descritto in precedenza4, nella cartilagine sana, i condrociti sono disposti in modelli spaziali specifici e distinti specifici per ogni strato di tessuto e giunto4,5 e dipendono da meccanismi di caricamento meccanico specifici per le articolazioni6. Questi modelli cambiano da coppie e stringhe in cartilagine sana a stringhe doppie con l'inizio dell'osteoartrite (OA). Con l'ulteriore progressione della malattia i condrociti formano piccoli cluster, aumentando gradualmente a grandi cluster nell'OA avanzato. Una perdita completa di qualsiasi struttura organizzativa e induzione di apoptosi è osservata nella fase finale OA. Pertanto, la disposizione cellulare del condrocito può essere utilizzata come biomarcatore basato sull'immagine per la progressione OA4.
Le proprietà biomeccaniche di cellule e tessuti non solo ne regolano la forma e la funzione, ma sono anche cruciali per mantenere la loro vitalità. I cambiamenti nell'elasticità possono propagarsi o innescare l'insorgenza di gravi malattie come il cancro o l'OA. La microscopia a forza atomica (AFM) è emersa come un potente strumento per caratterizzare qualitativamente e quantitativamente le proprietà biomeccaniche di specifiche strutture di bersaglio biologico su scala microscopica, misurando un'ampia gamma di forza, dal piconewton al micronewton. L'applicazione principale di AFM è quella di misurare la topografia superficiale e le proprietà meccaniche dei campioni alla risoluzione subnanometrica7. Il dispositivo di misura è costituito da tre componenti principali: 1) Una sonda AFM, che è una punta affilata montata su un sbalzo e viene utilizzata per l'interazione diretta con la superficie del campione. Quando la forza viene applicata al cantilever, la deformazione di quest'ultimo avviene in base alle proprietà del tessuto misurato. 2) Un sistema ottico che proietta un raggio laser sul cantilever, che viene poi riflesso in un'unità di rilevamento. 3) Un rilevatore di fotodiodo che cattura la luce deviata dallo sbalzo. Converte le informazioni ricevute per quanto riguarda la deflessione laser dal cantilever in una curva di forza che può essere analizzata.
Pertanto, il principio principale dell'AFM è il rilevamento della forza che agisce tra la sonda AFM e la struttura bersaglio del campione. Le curve di forza ottenute descrivono le proprietà meccaniche delle strutture bersaglio sulla superficie del campione come elasticità, distribuzione della carica, magnetizzazione, sollecitazione della resa e dinamica di deformazione plastica elastica8. Un importante vantaggio dell'AFM rispetto ad altre tecniche di imaging è che l'AFM può essere utilizzato per misurare le proprietà meccaniche delle cellule vive in media o tessuti in uno stato nativo senza danneggiare il tessuto. AFM può operare sia in condizioni liquide che a secco. Non vi è alcun requisito per la preparazione del campione. AFM offre la possibilità di immaginare un campione e misurarne simultaneamente le proprietà meccaniche in campioni che sono condizioni quasi fisiologiche. Nel presente studio descriviamo un nuovo approccio per valutare la progressione dell'OA misurando l'elasticità del PCM e dell'ECM nella cartilagine articolare nativa. La correlazione dell'organizzazione spaziale dei condrociti con il grado di degenerazione locale dei tessuti fornisce una prospettiva completamente nuova per la diagnosi precoce dell'OA. La rilevanza funzionale di questi modelli non è stata tuttavia valutata finora. Poiché la funzione principale della cartilagine articolare è il carico che porta a basso attrito, il tessuto deve possedere proprietà elastiche. AFM permette di misurare non solo l'elasticità dell'ECM, ma anche dei modelli cellulari spaziali incorporati nel loro PCM. La correlazione osservata dell'elasticità con il cambiamento del modello spaziale dei condrociti è così forte che misurare l'elasticità da sola può consentire la stratificazione della degenerazione del tessuto locale.
La modulina elastica del PCM e dell'ECM è stata valutata in sezioni sottili sfere di 35 m utilizzando un sistema AFM integrato in un microscopio a contrasto di fase invertito che permetteva la visualizzazione simultanea del campione cartilagineo. Questo protocollo si basa su uno studio già pubblicato dal nostro laboratorio9 e descrive specificamente come caratterizzare la disposizione spaziale dei condrociti e come misurare l'elasticità dei loro PCM ed ECM associati. Con ogni cambiamento di modello dei condrociti, si possono osservare cambiamenti significativi nell'elasticità sia per il PCM che per l'ECM, consentendo di utilizzare questa tecnica per misurare direttamente lo stadio di degenerazione della cartilagine.
Questo approccio convalidato apre un nuovo modo per valutare la progressione dell'OA e gli effetti terapeutici nelle prime fasi prima che la degradazione del tessuto macroscopico inizi effettivamente ad apparire. L'esecuzione coerente delle misurazioni AFM è un processo arduo. Nel seguente protocollo viene descritto come preparare il campione da misurare con AFM, come eseguire le misurazioni AFM effettive a partire dalla preparazione del cantilever, come calibrare l'AFM e quindi come eseguire le misurazioni. Le istruzioni passo-passo forniscono un approccio chiaro e conciso per ottenere dati affidabili e fornire strategie di base per elaborarli e interpretarli. La sezione di discussione descrive anche le insidie più comuni di questo metodo rigoroso e fornisce utili suggerimenti per la risoluzione dei problemi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscope (AFM)</td>
			<td>CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM head</td>
			<td>(CellHesion 200) JPK</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocompatible sample glue</td>
			<td>JPK Instruments AG, Berlin, Germany</td>
			<td>H000033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever</td>
			<td>tip C, k &#188; 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria</td>
			<td>AIO-TL-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)</td>
			<td>AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany</td>
			<td>L201306_03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium without L-glutamine</td>
			<td>(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)</td>
			<td>F1315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>07313-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater associated with AFM</td>
			<td>JPK Instruments AG, Berlin, Germany</td>
			<td>T-05-0117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>2023-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td>TPP93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands</td>
			<td>SA6255012</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of atomic force microscopy to detect early osteoarthritis

Le proprietà biomeccaniche di cellule e tessuti non solo ne regolano la forma e la funzione, ma sono anche cruciali per mantenere la loro vitalità. I cambiamenti nell'elasticità possono propagare o innescare l'insorgenza di gravi malattie come il cancro o l'osteoartrite (OA). La microscopia a forza atomica (AFM) è emersa come un forte strumento per caratterizzare qualitativamente e quantitativamente le proprietà biomeccaniche di specifiche strutture di target biologiche su scala microscopica, misurando le forze in un intervallo da piccolo come il piconewton al micronewton. Le proprietà biomeccaniche sono di particolare importanza nei tessuti muscolo-scheletrici, che sono soggetti ad alti livelli di ceppo. L'OA come malattia degenerativa della cartilagine provoca l'interruzione della matrice pericellulare (PCM) e la riorganizzazione spaziale dei condrociti incorporati nella loro matrice extracellulare (ECM). L'interruzione nel PCM e nell'ECM è stata associata a cambiamenti nelle proprietà biomeccaniche della cartilagine. Nel presente studio abbiamo usato l'AFM per quantificare questi cambiamenti in relazione ai cambiamenti specifici del modello spaziale dei condrociti. Con ogni cambiamento di modello, sono stati osservati cambiamenti significativi nell'elasticità sia per il PCM che per l'ECM. Misurare l'elasticità locale permette quindi di trarre conclusioni dirette sul grado di degenerazione del tessuto locale in OA.

Lungo il modello fisiopatologico dalle stringhe alle stringhe doppie, ai piccoli e infine ai grandi cluster, sia ECM (Figura 3A) che PCM (Figura 3B) elastico diminuito in modo significativo tra ogni modifica del modello. L'unica eccezione è stata la differenza in ECM tra le stringhe e le stringhe doppie (p - 0,072). I risultati mostrano che il rapporto ECM/PCM (Figura 4B) non è cambiato in modo significativo, mentre è stata osser...

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Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Presentiamo un metodo per studiare i primi cambiamenti osteoartritici a livello cellulare nella cartilagine articolare utilizzando la microscopia a forza atomica (AFM).

Applicazione della microscopia a forza atomica per rilevare l'osteoartrite precoce

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Le proprietà biomeccaniche di cellule e tessuti regolano la loro funzione e vitalità. L'AFM consente la quantificazione precoce dell'osteoartrite a livello cellulare sulla base di misurazioni dell'elasticità. AFM consente l'acquisizione di misure a livello cellulare senza danneggiare il campione e con un'alta risoluzione, affidabilità e sensibilità.I cambiamenti di proprietà biomeccanica si verificano all'inizio dell'osteoartrite. La misurazione dell'elasticità locale della cartilagine articolare consente di trarre valide conclusioni sul grado di degenerazione dei tessuti locali. Per valutare i cambiamenti degenerativi all'interno dell'articolazione del ginocchio umano, utilizzare prima un bisturi per tagliare la cartilagine articolare nel suo complesso dall'osso subcondrale e incorporare il campione di cartilagine nel mezzo di incorporamento solubile in acqua sulla manopola Cryotome che si congela a bassa temperatura nel dispositivo Cryotome.Quando il campione si è congelato, utilizzare un criotomo standard per acquisire sezioni di tessuto spesse 35 micrometri dallo strato più alto della cartilagine articolare, raccogliendo ogni sezione su singoli vetrini. Una volta ottenute tutte le sezioni, sciacquare i campioni tre volte in PBS fresco per cinque minuti per lavaggio per rimuovere il mezzo di incorporamento solubile in acqua. Rimuovere la prima diapositiva dal lavaggio.Successivamente, aggiungere da due a tre gocce di colla per campione biocompatibile per sezione in singole piastre di Petri compatibili con AFM. Rimuovere la soluzione in eccesso dal campione e premere delicatamente i bordi della sezione essiccata sulle macchie di colla. Dopo due minuti, coprire attentamente i tessuti incollati con il mezzo L-15 di Leibovitz senza L-glutammina e posizionare i piatti in un incubatore di coltura cellulare fino a quando i campioni devono essere analizzati.Per preparare il dispositivo AFM, regolare un blocco di gas per la misurazione in un ambiente liquido sul supporto AFM in modo che la superficie superiore sia parallela al supporto e utilizzare una pinzetta per montare con cura il sbalzo selezionato sulla superficie del blocco di vetro in modo che la punta AFM con la microsfera sporge sul piano ottico lucido. Per stabilizzare la sbalzo sul blocco di vetro, far scorrere la molla metallica nella scanalatura del blocco e utilizzare una pinzetta per bloccare la parte superiore della sbalzo con la molla. Posizionare con cura il blocco di vetro con il sbalzino sulla testa AFM e fissare il blocco con il meccanismo di bloccaggio integrato.Quindi montare la testa AFM con la sbalziola sul dispositivo AFM con la molla rivolta a sinistra. Per montare il campione sul dispositivo AFM, posizionare la piastra di Petri del campione sul portacampioni AFM e impostare il riscaldatore della piastra di Petri su 37 gradi Celsius. Dopo circa 20 minuti, aprire il software del dispositivo e l'allineamento laser e avvicinarsi alle finestre di impostazione dei parametri.Successivamente, accendere il motore stepper, la luce laser e la fotocamera CCD e utilizzare la funzione motore stepper per abbassare la sbalziera in passi di 100 micrometri fino a quando il cantilever non è completamente immerso nel mezzo. Utilizzare le viti di regolazione per dirigere il laser sopra il cantilever e utilizzare le viti del dispositivo AFM per regolare il raggio laser in modo che il fascio riflesso cada al centro del fotorivelante. Una volta regolato il cantilever laser, regolare il fotodetector in base alle esigenze per impostare il segnale di somma su un volt o superiore e le deformazioni laterali e verticali a quasi zero.Per ottenere la curva di forza di calibrazione, eseguire un approccio dello scanner con i parametri di approccio indicati nella tabella. Una volta raggiunto il fondo del piatto di coltura tissutale, ritrarre il cantilever di 100 micrometri. Impostare i parametri di esecuzione come indicato nella tabella.Quindi fare clic su Esegui per avviare una misurazione e ottenere una curva di distanza della forza di calibrazione. La curva di forza è ottenuta come illustrato nella figura. Sulla curva di distanza della forza di calibrazione, selezionate la regione per una vestibilità lineare della curva retrattile.Una volta che la vestibilità lineare è in atto, i valori verranno salvati dal software. Quindi, poiché le misurazioni vengono eseguite in mezzo a 37 gradi Celsius temperatura, impostare la variabile di temperatura nel software a 37 gradi per imitare le condizioni fisiologiche il più vicino possibile. Per identificare i modelli conversite nelle sezioni del campione di cartilagine, individuare e identificare i modelli cellulari specifici della cartilagine articolare dal ginocchio osteoartritico al microscopio a contrasto di fase, che possono includere singole stringhe indicative di aree tissutali sane, doppie stringhe indicative dell'inizio della degenerazione tissutale, piccoli ammassi, che sono segni di degenerazione avanzata dei tessuti, e grandi cluster, indicativi della distruzione dei tessuti allo stadio finale.Una volta identificato uno specifico modello desiderato, per le misurazioni della matrice pericellulare, posizionare il cantilever in prossimità delle cellule e misurare due siti per modello scelto per tipo di matrice, nove volte per sito di misurazione, compresa una dimensione del campione abbastanza grande da tenere conto di possibili imprecisioni. Concentrati sulla matrice cellulare del modello da misurare e fissa il mouse del computer in quel punto. Quindi, concentrati sulla sonda e sposta la punta della sonda nel punto precedentemente fissato dalla freccia del computer.Per eseguire misurazioni della matrice extracellulare, selezionare una regione senza cellule ed eseguire un approccio seguito da una retrazione in modo che il cantilever sia posizionato a 100 micrometri sopra il tessuto. Quindi fare clic su esegui per avviare le misurazioni, utilizzando il parametro setpoint ottenuto dalla calibrazione del cantilever. Per elaborare i dati ottenuti, aprire un software di elaborazione dati compatibile con i dati ottenuti dal dispositivo AFM e selezionare il modello Hearst nel software per l'elaborazione delle curve di distanza di forza.Impostare il rapporto Poisson su 0,5, la forma della punta come sferica e il raggio della punta a 12,5 micrometri. Una volta che tutti i parametri sono stati regolati, i risultati saranno montati e il modulo di Young sarà calcolato dal software. Lungo il modello fisiopatologico dalle stringhe alle stringhe doppie e dai cluster piccoli a quelli grandi, sia i moduli elastici a matrice extracellulare che pericellulare diminuiscono significativamente tra ogni cambiamento di pattern tranne che tra stringhe e stringhe doppie.Inoltre, il rapporto matrice extracellulare-pericellulare non cambia in modo significativo, mentre si osserva una marcata diminuzione delle differenze assolute di elasticità tra le matrici extracellulari e pericellulari. I valori di elasticità dipendono da varie condizioni come la profondità di indentazione o le proprietà della punta a sbalzino. AFM è quindi più adatto a confrontare condizioni diverse all'interno della stessa configurazione sperimentale.Poiché l'AFM misura l'elasticità locale del campione, le sezioni devono essere fissate in posizione per consentire misurazioni precise ed evitare danni a sbalzi. Per analizzare ulteriormente i processi responsabili dei cambiamenti di elasticità tissutale, la quantificazione biochimica della struttura delle proteine di interesse può essere eseguita tramite macchie occidentali o ELISA.

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