Name: application of atomic force microscopy to detect early osteoarthritis
Uploaded: 2020-05-24T14:00:00
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Agradecemos aos nossos co-autores da publicação original pela ajuda e apoio.

As amostras de cartilagem humana foram obtidas de pacientes submetidos a artroplastia total do joelho no Departamento de Cirurgia Ortopédica do Hospital Universitário de Tuebingen, Alemanha, e no Hospital Winghofer, Rottenburg a.N., Alemanha, para o estágio final do joelho. A aprovação do comitê de ética departamental, institucional e local foi obtida antes do início do estudo (projeto nº 674/2016BO2). O consentimento informado por escrito foi recebido de todos os pacientes antes da participação. Os métodos f...

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	<li>Guilak, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pericellular+matrix+as+a+transducer+of+biomechanical+and+biochemical+signals+in+articular+cartilage.">The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).</li><li>Peters, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protective+role+of+the+pericellular+matrix+in+chondrocyte+apoptosis.">The protective role of the pericellular matrix in chondrocyte apoptosis.</a> Tissue Engineering Part A. 17 (15-16), 2017-2024 (2011).</li><li>Larson, C. M., Kelley, S. S., Blackwood, A. D., Banes, A. J., Lee, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+of+the+native+chondrocyte+pericellular+matrix+results+in+significantly+improved+matrix+production.">Retention of the native chondrocyte pericellular matrix results in significantly improved matrix production.</a> Matrix Biology. 21 (4), 349-359 (2002).</li><li>Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+horizontal+patterns+in+the+spatial+organization+of+superficial+zone+chondrocytes+of+human+joints.">Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints.</a> Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).</li><li>Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontally+oriented+clusters+of+multiple+chondrons+in+the+superficial+zone+of+ankle,+but+not+knee+articular+cartilage.">Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage.</a> The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).</li><li>Rolauffs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+preclinical+osteoarthritis:+the+angular+spatial+organization+permits+early+diagnosis.">Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis.</a> Arthritis Rheumatology. 63 (6), 1637-1647 (2011).</li><li>Maver, U., Velnar, T., Gaber&#353;&#269;ek, M., Planin&#353;ek, O., Fin&#353;gar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progressive+use+of+atomic+force+microscopy+in+biomedical+applications.">Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 80, 96-111 (2016).</li><li>Polini, A., Yang, F., Ramalingam, M., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+characterization+of+nanofiber+composites.">Physicochemical characterization of nanofiber composites.</a> Nanofiber Composites for Biomedical Applications. , 97-115 (2017).</li><li>Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+biomechanical+properties+of+the+extracellular+and+pericellular+matrix+and+their+interconnection+throughout+the+course+of+osteoarthritis.">Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis.</a> Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).</li><li>Danalache, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+stiffness+and+biochemical+composition+of+the+pericellular+matrix+as+a+function+of+spatial+chondrocyte+organisation+in+osteoarthritic+cartilage.">Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).</li><li>Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+strategies+for+automated+AFM+force+curve+analysis--I.+Non-adhesive+indentation+of+soft,+inhomogeneous+materials.">Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).</li><li>Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+properties+of+human+mesenchymally-derived+stem+cells+and+primary+osteoblasts,+chondrocytes,+and+adipocytes.">Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes.</a> Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).</li><li>Thambyah, A., Nather, A., Goh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+articular+cartilage+covered+by+the+meniscus.">Mechanical properties of articular cartilage covered by the meniscus.</a> Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 580-588 (2006).</li><li>Choi, A. P., Zheng, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+Young's+modulus+and+Poisson's+ratio+of+soft+tissue+from+indentation+using+two+different-sized+indentors:+finite+element+analysis+of+the+finite+deformation+effect.">Estimation of Young's modulus and Poisson's ratio of soft tissue from indentation using two different-sized indentors: finite element analysis of the finite deformation effect.</a> Medical Biological Engineering Computing. 43 (2), 258-264 (2005).</li><li>Jin, H., Lewis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Poisson's+ratio+of+articular+cartilage+by+indentation+using+different-sized+indenters.">Determination of Poisson's ratio of articular cartilage by indentation using different-sized indenters.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 126 (2), 138-145 (2004).</li></ol>

Utilizando a AFM como uma técnica nova e poderosa para medir as propriedades biomecânicas dos materiais biológicos em um nível de nanoescala, medimos as propriedades elásticas do ECM e do PCM na cartilagem articular osteoartrítica humana. As amostras de cartilagem foram selecionadas de acordo com seu padrão espacial predominante de organização de condrócitos como um biomarcador à base de imagem para degeneração tecidual local. Como esperado, observou-se forte declínio nos valores de elasticidade tanto do EC...

Cartilagem articular é um tecido avascular, aneural. Os condrócitos pouco dispersos produzem, organizam e mantêm uma matriz extracelular expansiva (ECM) na qual estão incorporados. Como parte distinta e especializada do ECM, os condrócitos são cercados por uma fina camada de matriz especializada conhecida como matriz pericelular (PCM). O PCM atua como uma interface mecanosensível de matriz celular1 que protege os condrócitos2 e modula sua resposta biossintética3. Como descrito anteriormente4, na cartilagem saudável, os condrócitos são dispostos em padrões espaciais específicos e distintos que são específicos para cada camada tecidual e articulação4,5 e dependem de mecanismos de carga mecânicos específicos da articulação6. Esses padrões mudam de pares e cordas em cartilagem saudável para cordas duplas com o início da osteoartrite (OA). Com a progressão da doença, os condrócitos formam pequenos aglomerados, aumentando gradualmente em tamanho para grandes aglomerados em OA avançado. Observa-se uma perda completa de qualquer estrutura organizacional e indução de apoptose no estágio final. Assim, o arranjo celular condrócito pode ser usado como um biomarcador baseado em imagem para progressão de OA4.
As propriedades biomecânicas das células e tecidos não apenas regulam sua forma e função, mas também são cruciais para manter sua vitalidade. Mudanças na elasticidade podem propagar ou desencadear o início de doenças graves como câncer ou OA. A microscopia de força atômica (AFM) emergiu como uma poderosa ferramenta para caracterizar qualitativamente e quantitativamente as propriedades biomecânicas de estruturas-alvo biológicas específicas em escala microscópica, medindo uma ampla gama de força, do piconewton ao micronewton. A principal aplicação da AFM é medir a topografia superficial e as propriedades mecânicas das amostras na resolução subnanômetro7. O dispositivo de medição consiste em três componentes principais: 1) Uma sonda AFM, que é uma ponta afiada montada em um cantilever e é usada para a interação direta com a superfície da amostra. Quando a força é aplicada ao cantilever, a deformação deste último ocorre de acordo com as propriedades do tecido medido. 2) Um sistema óptico que projeta um raio laser no cantilever, que é então refletido em uma unidade detectora. 3) Um detector de fotodiodo que capta a luz desviada do cantilever. Ele converte as informações recebidas sobre a deflexão do laser pelo cantilever em uma curva de força que pode ser analisada.
Assim, o princípio principal da AFM é a detecção da força atuando entre a sonda AFM e a estrutura-alvo da amostra. As curvas de força obtidas descrevem as propriedades mecânicas das estruturas-alvo na superfície da amostra como elasticidade, distribuição de carga, magnetização, estresse de rendimento e dinâmica de deformação plástica elástica8. Uma vantagem importante da AFM em relação a outras técnicas de imagem é que a AFM pode ser usada para medir as propriedades mecânicas das células vivas em médio ou tecido em um estado nativo sem danificar o tecido. A AFM pode operar tanto em condições líquidas quanto secas. Não há necessidade de preparação da amostra. A AFM oferece a possibilidade de visualizar um espécime e medir suas propriedades mecânicas simultaneamente em espécimes próximos a condições fisiológicas. No presente estudo descrevemos uma nova abordagem para avaliar a progressão da OA medindo a elasticidade do PCM e do ECM na cartilagem articular nativa. A correlação da organização espacial dos condrócitos com o grau de degeneração do tecido local fornece uma perspectiva completamente nova para a detecção precoce de OA. A relevância funcional desses padrões não foi avaliada até agora, no entanto. Como a principal função da cartilagem articular é o rolamento de carga em baixo atrito, o tecido deve possuir propriedades elásticas. A AFM permite medir não apenas a elasticidade do ECM, mas também os padrões celulares espaciais incorporados em seu PCM. A correlação observada de elasticidade com a mudança de padrão espacial dos condrócitos é tão forte que medir a elasticidade sozinha pode permitir a estratificação da degeneração do tecido local.
Moduli elástico do PCM e ECM foram avaliados em seções de 35 μm-thin utilizando um sistema AFM integrado em um microscópio de contraste de fase invertido que permitiu a visualização simultânea da amostra de cartilagem. Este protocolo baseia-se em um estudo já publicado em nosso laboratório9 e descreve especificamente como caracterizar o arranjo espacial dos condrócitos e como medir a elasticidade de seu PCM e ECM associados. A cada mudança de padrão dos condrócitos, mudanças significativas na elasticidade também podem ser observadas tanto para o PCM quanto para o ECM, permitindo que essa técnica seja usada para medir diretamente o estágio de degeneração da cartilagem.
Esta abordagem validada abre uma nova maneira de avaliar a progressão da OA e os efeitos terapêuticos em estágios iniciais antes que a degradação do tecido macroscópico realmente comece a aparecer. Realizar medições de AFM de forma consistente é um processo árduo. No protocolo a seguir descrevemos como preparar a amostra a ser medida pela AFM, como realizar as medições aftosas reais começando com a preparação do cantilever, como calibrar o AFM e, em seguida, como realizar as medições. As instruções passo a passo fornecem uma abordagem clara e concisa para obter dados confiáveis e fornecer estratégias básicas para processá-los e interpretá-los. A seção de discussão também descreve as armadilhas mais comuns deste método rigoroso e fornece dicas úteis para solucionar problemas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscope (AFM)</td>
			<td>CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM head</td>
			<td>(CellHesion 200) JPK</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocompatible sample glue</td>
			<td>JPK Instruments AG, Berlin, Germany</td>
			<td>H000033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever</td>
			<td>tip C, k &#188; 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria</td>
			<td>AIO-TL-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)</td>
			<td>AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany</td>
			<td>L201306_03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium without L-glutamine</td>
			<td>(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)</td>
			<td>F1315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>07313-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater associated with AFM</td>
			<td>JPK Instruments AG, Berlin, Germany</td>
			<td>T-05-0117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>2023-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td>TPP93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands</td>
			<td>SA6255012</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of atomic force microscopy to detect early osteoarthritis

As propriedades biomecânicas das células e tecidos não apenas regulam sua forma e função, mas também são cruciais para manter sua vitalidade. Mudanças na elasticidade podem propagar ou desencadear o início de doenças graves como câncer ou osteoartrite (OA). A microscopia de força atômica (AFM) emergiu como uma forte ferramenta para caracterizar qualitativamente e quantitativamente as propriedades biomecânicas de estruturas-alvo biológicas específicas em escala microscópica, medindo forças em uma faixa tão pequena quanto o piconewton até o micronewton. As propriedades biomecânicas são de especial importância nos tecidos musculoesqueléticos, que são submetidos a altos níveis de tensão. AA como uma doença degenerativa da cartilagem resulta na ruptura da matriz pericelular (PcM) e no rearranjo espacial dos condrócitos incorporados em sua matriz extracelular (ECM). A interrupção no PCM e no ECM tem sido associada a alterações nas propriedades biomecânicas da cartilagem. No presente estudo utilizou-se a AFM para quantificar essas alterações em relação às mudanças específicas do padrão espacial dos condrócitos. A cada mudança de padrão, foram observadas mudanças significativas na elasticidade tanto para o PCM quanto para o ECM. Medir a elasticidade local permite, assim, tirar conclusões diretas sobre o grau de degeneração do tecido local em OA.

Ao longo do modelo fisiopatológico de cordas a cordas duplas, para pequenos e finalmente para grandes aglomerados, tanto ecm(Figura 3A) quanto PCM(Figura 3B)moduli elástico diminuiu significativamente entre cada mudança de padrão. A única exceção foi a diferença de ECM entre cordas e cordas duplas (p = 0,072). Os resultados mostram que a razão ECM/PCM (Figura 4B) não mudou significativamente, enquanto observou-se uma dimin...

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Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Apresentamos um método para investigar alterações osteoartríticas precoces no nível celular na cartilagem articular usando microscopia de força atômica (AFM).

Aplicação de microscopia de força atômica para detectar osteoartrite precoce

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

As propriedades biomecânicas das células e tecidos regulam sua função e vitalidade. A AFM permite a quantificação precoce da osteoartrite no nível celular com base em medidas de elasticidade. A AFM permite a aquisição de medições a nível celular sem danificar a amostra e com alta resolução, confiabilidade e sensibilidade.Mudanças na propriedade biomecânica ocorrem no início da osteoartrite. Medir a elasticidade local da cartilagem articular permite que conclusões válidas sejam tiradas sobre o grau de degeneração do tecido local. Para avaliar as alterações degenerativas dentro da articulação do joelho humano, primeiro use um bisturi para cortar a cartilagem articular como um todo do osso subcondral e incorporar a amostra de cartilagem em meio de incorporação solúvel em água no botão Cryotome que congela sob baixa temperatura no dispositivo Cryotome.Quando a amostra estiver congelada, use um Cryotome padrão para adquirir uma parte de 35 micrômetros de espessura de tecido a partir da camada superior da cartilagem articular, coletando cada seção em lâminas de vidro individuais. Quando todas as seções tiverem sido obtidas, enxágue as amostras três vezes em PBS fresco por cinco minutos por lavagem para remover o meio de incorporação solúvel em água. Remova o primeiro slide da lavagem.Depois disso, adicione duas a três gotas de cola de amostra biocompatível por seção em placas de Petri compatíveis com AFM individuais. Remova qualquer solução em excesso da amostra e pressione suavemente as bordas da seção seca sobre as manchas de cola. Após dois minutos, cubra cuidadosamente os tecidos ligados com o meio L-15 de Leibovitz sem L-glutamina e coloque os pratos em uma incubadora de cultura celular até que as amostras sejam analisadas.Para preparar o dispositivo AFM, ajuste um bloco de gás para medir em um ambiente líquido no suporte AFM para que a superfície superior seja paralela ao suporte, e use pinças para montar cuidadosamente o cantilever selecionado na superfície do bloco de vidro para que a ponta AFM com a microesfera se projete sobre o plano óptico polido. Para estabilizar a cantilever no bloco de vidro, deslize a mola metálica para a ranhura do bloco e use pinças para fixar a parte superior do cantilever com a mola. Coloque cuidadosamente o bloco de vidro com a cantilever na cabeça AFM e fixe o bloco com o mecanismo de bloqueio integrado.Em seguida, monte a cabeça AFM com a cantilever sobre o dispositivo AFM com a mola voltada para a esquerda. Para montar a amostra no dispositivo AFM, coloque a placa de Petri na amostra do suporte de amostras AFM e coloque o aquecedor da placa de Petri a 37 graus Celsius. Após cerca de 20 minutos, abra o software do dispositivo e o alinhamento a laser e a aproximação do parâmetro de configuração das janelas.Em seguida, ligue o motor do estepe, a luz laser e a câmera CCD e use a função do motor do estepe para baixar o cantilever em 100 passos de micrômetro até que o cantilever esteja totalmente submerso no meio. Use os parafusos de ajuste para direcionar o laser em cima do cantilever e use os parafusos do dispositivo AFM para ajustar o raio laser para que o feixe refletido caia sobre o centro do fotodetetor. Uma vez que o cantilever laser tenha sido ajustado, ajuste o fotodetetor conforme necessário para definir o sinal de soma para um volt ou superior e as deflexões laterais e verticais para perto de zero.Para obter a curva de força de calibração, execute uma abordagem do scanner com os parâmetros de aproximação indicados na tabela. Uma vez que a parte inferior do prato de cultura tecidual é atingido, retraia o cantilever por 100 micrômetros. Configure os parâmetros de execução conforme indicado na tabela.E clique em executar para iniciar uma medição e obter uma curva de distância de força de calibração. A curva de força é obtida como ilustrada na figura. Na curva de distância da força de calibração, selecione a região para um ajuste linear da curva retraída.Uma vez que o ajuste linear esteja no lugar, os valores serão salvos pelo software. Em seguida, como as medidas são realizadas em média a 37 graus Celsius temperatura, definir a variável de temperatura no software para 37 graus para imitar as condições fisiológicas o mais próximo possível. Para identificar os padrões conversite nas seções da amostra de cartilagem, localize e identifique os padrões celulares específicos da cartilagem articular do joelho osteoartriético no microscópio de contraste de fase, que podem incluir cordas únicas indicativas de áreas de tecido saudável, cordas duplas indicativas do início da degeneração tecidual, pequenos aglomerados, que são sinais de degeneração avançada do tecido, e grandes aglomerados, indicativo de destruição do tecido em estágio final.Uma vez identificado um padrão específico desejado, para medições da matriz pericelular, posicione o cantilever próximo às células e meça dois locais por padrão escolhido por tipo de matriz, nove vezes por local de medição, incluindo um tamanho amostral grande o suficiente para explicar possíveis imprecisões. Concentre-se na matriz celular do padrão a ser medido e fixe o mouse do computador nesse ponto. Em seguida, concentre-se na sonda e mova a ponta da sonda para o ponto previamente fixado pela seta do computador.Para realizar medições da matriz extracelular, selecione uma região sem células e realize uma abordagem seguida de uma retração para que o cantilever esteja posicionado 100 micrômetros acima do tecido. Em seguida, clique em executar para iniciar as medições, usando o parâmetro de setpoint obtido pela calibração do cantilever. Para processar os dados obtidos, abra o software de processamento de dados compatível com os dados obtidos do dispositivo AFM e selecione o modelo Hearst no software para processar as curvas de distância de força.Defina a razão Poisson para 0,5, a forma da ponta como esférica e o raio de ponta para 12,5 micrômetros. Uma vez que todos os parâmetros tenham sido ajustados, os resultados serão ajustados e o Módulo do Jovem será calculado pelo software. Ao longo do modelo fisiopatológico de cordas a cordas duplas e de pequenos a grandes aglomerados, tanto a matriz extracelular quanto a matriz pericelular elástica moduli diminuem significativamente entre cada mudança de padrão, exceto entre cordas e cordas duplas.Além disso, a razão da matriz extracelular-pericelular não muda significativamente, enquanto uma diminuição acentuada das diferenças absolutas de elasticidade entre as matrizes extracelular e pericelular é observada. Os valores de elasticidade dependem de várias condições, como a profundidade do recuo ou as propriedades da ponta cantilever. A AFM é, portanto, mais adequada para comparar condições diferentes dentro da mesma configuração experimental.Como o AFM mede a elasticidade local da amostra, as seções precisam ser fixadas para permitir medições precisas e evitar danos cantilever. Para analisar melhor os processos responsáveis pelas alterações de elasticidade tecidual, a quantificação bioquímica da estrutura de proteínas de interesse pode ser realizada através de manchas ocidentais ou ELISAs.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

A imobilização de bactérias for Imaging por Microscopia de Força Atômica

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Bioengenharia

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Visualização do DNA recombinante e Complexos de Proteínas Usando Microscopia de Força Atômica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Quantificar as propriedades mecânicas do Glicocálix endotelial com Microscopia de Força Atômica

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Shock Wave Application to Cell Cultures

Choque aplicação de ondas de culturas de células

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Superfície de Medição de Potencial de Bactérias Usando Kelvin Probe Microscopia de Força

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Novel Microscopia de Força Atômica bioprospecção Based para Isolamento de Morfologia reagentes específicos contra TDP-43 variantes em Esclerose Lateral Amiotrófica

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Projeção de imagem atômica e força Espectroscopia de Bicamadas Lipídicas suportados

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Microscopia de força de tração de alta produtividade usando PDMS revela efeitos dose-dependentes do fator de crescimento transformador-β na transição epitelial-para-mesenquimal

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Fabricação e implementação de uma plataforma de microscopia de força de tração sem referência

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...