Name: application of atomic force microscopy to detect early osteoarthritis
Uploaded: 2020-05-24T14:00:00
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Agradecemos a nuestros coautores de la publicación original por su ayuda y apoyo.

Las muestras de cartílago humano se obtuvieron de pacientes sometidos a artroplastia total de rodilla en el Departamento de Cirugía Ortopédica del Hospital Universitario de Tuebingen, Alemania, y del Winghofer-hospital, Rottenburg a.N., Alemania, para la etapa final de la OA de la rodilla. Se obtuvo la aprobación completa del comité ético local, institucional y local antes del inicio del estudio (número de proyecto 674/2016BO2). Se recibió el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes antes de la...

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	<li>Guilak, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pericellular+matrix+as+a+transducer+of+biomechanical+and+biochemical+signals+in+articular+cartilage.">The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).</li><li>Peters, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protective+role+of+the+pericellular+matrix+in+chondrocyte+apoptosis.">The protective role of the pericellular matrix in chondrocyte apoptosis.</a> Tissue Engineering Part A. 17 (15-16), 2017-2024 (2011).</li><li>Larson, C. M., Kelley, S. S., Blackwood, A. D., Banes, A. J., Lee, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+of+the+native+chondrocyte+pericellular+matrix+results+in+significantly+improved+matrix+production.">Retention of the native chondrocyte pericellular matrix results in significantly improved matrix production.</a> Matrix Biology. 21 (4), 349-359 (2002).</li><li>Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+horizontal+patterns+in+the+spatial+organization+of+superficial+zone+chondrocytes+of+human+joints.">Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints.</a> Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).</li><li>Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontally+oriented+clusters+of+multiple+chondrons+in+the+superficial+zone+of+ankle,+but+not+knee+articular+cartilage.">Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage.</a> The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).</li><li>Rolauffs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+preclinical+osteoarthritis:+the+angular+spatial+organization+permits+early+diagnosis.">Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis.</a> Arthritis Rheumatology. 63 (6), 1637-1647 (2011).</li><li>Maver, U., Velnar, T., Gaber&#353;&#269;ek, M., Planin&#353;ek, O., Fin&#353;gar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progressive+use+of+atomic+force+microscopy+in+biomedical+applications.">Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 80, 96-111 (2016).</li><li>Polini, A., Yang, F., Ramalingam, M., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+characterization+of+nanofiber+composites.">Physicochemical characterization of nanofiber composites.</a> Nanofiber Composites for Biomedical Applications. , 97-115 (2017).</li><li>Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+biomechanical+properties+of+the+extracellular+and+pericellular+matrix+and+their+interconnection+throughout+the+course+of+osteoarthritis.">Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis.</a> Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).</li><li>Danalache, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+stiffness+and+biochemical+composition+of+the+pericellular+matrix+as+a+function+of+spatial+chondrocyte+organisation+in+osteoarthritic+cartilage.">Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).</li><li>Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+strategies+for+automated+AFM+force+curve+analysis--I.+Non-adhesive+indentation+of+soft,+inhomogeneous+materials.">Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).</li><li>Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+properties+of+human+mesenchymally-derived+stem+cells+and+primary+osteoblasts,+chondrocytes,+and+adipocytes.">Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes.</a> Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).</li><li>Thambyah, A., Nather, A., Goh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+articular+cartilage+covered+by+the+meniscus.">Mechanical properties of articular cartilage covered by the meniscus.</a> Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 580-588 (2006).</li><li>Choi, A. P., Zheng, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+Young's+modulus+and+Poisson's+ratio+of+soft+tissue+from+indentation+using+two+different-sized+indentors:+finite+element+analysis+of+the+finite+deformation+effect.">Estimation of Young's modulus and Poisson's ratio of soft tissue from indentation using two different-sized indentors: finite element analysis of the finite deformation effect.</a> Medical Biological Engineering Computing. 43 (2), 258-264 (2005).</li><li>Jin, H., Lewis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Poisson's+ratio+of+articular+cartilage+by+indentation+using+different-sized+indenters.">Determination of Poisson's ratio of articular cartilage by indentation using different-sized indenters.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 126 (2), 138-145 (2004).</li></ol>

Utilizando AFM como una técnica novedosa y poderosa para medir las propiedades biomecánicas de los materiales biológicos a un nivel nanoescala, medimos las propiedades elásticas del ECM y pcM en el cartílago articular osteoartrítico humano. Las muestras de cartílago se seleccionaron de acuerdo con su patrón espacial predominante de organización de condrocitos como un biomarcador basado en imágenes para la degeneración del tejido local. Como era de esperar, se observó una fuerte disminución en los valores de ...

El cartílago articular es un tejido avascular y aneural. Los condrocitos escasamente dispersos producen, organizan y mantienen una matriz extracelular expansiva (ECM) en la que están incrustados. Como parte distinta y especializada del ECM, los condrocitos están rodeados por una fina capa de matriz especializada conocida como matriz pericelular (PCM). El PCM actúa como una interfaz de matriz celular sensible al mecanosensible 1 que protege los condrocitos2 y modula su respuesta biosintética3. Como se describió anteriormente4, en cartílago sano, los condrocitos están dispuestos en patrones espaciales específicos y distintos que son específicos para cada capa de tejido y articulación4,5 y dependen de los mecanismos de carga mecánica específicos de la articulación6. Estos patrones cambian de pares y cuerdas en cartílago sano a cuerdas dobles con la aparición de osteoartritis (OA). Con una mayor progresión de la enfermedad, los condrocitos forman pequeños racimos, aumentando gradualmente en tamaño a grandes racimos en OA avanzado. Una pérdida completa de cualquier estructura organizativa e inducción de la apoptosis se observa en la etapa final OA. Por lo tanto, la disposición celular de condrocitos se puede utilizar como un biomarcador basado en imágenes para la progresión de OA4.
Las propiedades biomecánicas de las células y tejidos no sólo regulan su forma y función, sino que también son cruciales para mantener su vitalidad. Los cambios en la elasticidad pueden propagar o desencadenar la aparición de enfermedades importantes como el cáncer o la OA. La microscopía de fuerza atómica (AFM) ha surgido como una poderosa herramienta para caracterizar cualitativa y cuantitativamente las propiedades biomecánicas de estructuras biológicas específicas a escala microscópica, midiendo una amplia gama de fuerza, desde piconewton hasta la micronewton. La principal aplicación de AFM es medir la topografía superficial y las propiedades mecánicas de las muestras a la resolución del subnómetro7. El dispositivo de medición consta de tres componentes principales: 1) Una sonda AFM, que es una punta afilada montada en un voladizo y se utiliza para la interacción directa con la superficie de la muestra. Cuando se aplica la fuerza al voladizo, la deformación de este último se produce de acuerdo con las propiedades del tejido medido. 2) Un sistema óptico que proyecta un rayo láser en el voladizo, que luego se refleja en una unidad detectora. 3) Un detector de fotodiodo que capta la luz desviada del voladizo. Convierte la información recibida sobre la desviación láser por el voladizo en una curva de fuerza que se puede analizar.
Por lo tanto, el principio principal de AFM es la detección de la fuerza que actúa entre la sonda AFM y la estructura objetivo de la muestra. Las curvas de fuerza obtenidas describen las propiedades mecánicas de las estructuras objetivo en la superficie de la muestra como elasticidad, distribución de carga, magnetización, tensión de rendimiento y dinámica de deformación plástica elástica8. Una ventaja importante de La AFM sobre otras técnicas de diagnóstico por imágenes es que el AFM se puede utilizar para medir las propiedades mecánicas de las células vivas en medios o tejidos en un estado nativo sin dañar el tejido. AFM puede funcionar tanto en condiciones líquidas como secas. No hay ningún requisito para la preparación de la muestra. AFM ofrece la posibilidad de tomar imágenes de una muestra y medir sus propiedades mecánicas simultáneamente en especímenes que están cerca de condiciones fisiológicas. En el presente estudio describimos un enfoque novedoso para evaluar la progresión de la OA midiendo la elasticidad del PCM y el ECM en el cartílago articular nativo. La correlación de la organización espacial de los condrocitos con el grado de degeneración del tejido local proporciona una perspectiva completamente nueva para la detección temprana de OA. Sin embargo, la relevancia funcional de estos patrones no se ha evaluado hasta ahora. Debido a que la función principal del cartílago articular es la carga que tiene una fricción baja, el tejido debe poseer propiedades elásticas. AFM permite medir no sólo la elasticidad del ECM, sino también de los patrones celulares espaciales incrustados en su PCM. La correlación observada de elasticidad con el cambio de patrón espacial de los condrocitos es tan fuerte que la medición de la elasticidad por sí sola puede permitir la estratificación de la degeneración del tejido local.
Los módulos elásticos del PCM y el ECM se evaluaron en secciones de 35 m de grosor utilizando un sistema AFM integrado en un microscopio de contraste de fase invertido que permitía la visualización simultánea de la muestra de cartílago. Este protocolo se basa en un estudio ya publicado en nuestro laboratorio9 y describe específicamente cómo caracterizar la disposición espacial de los condrocitos y cómo medir la elasticidad de su PCM y ECM asociados. Con cada cambio de patrón de los condrocitos, también se pueden observar cambios significativos en la elasticidad tanto para el PCM como para el ECM, permitiendo que esta técnica se utilice para medir directamente la etapa de degeneración del cartílago.
Este enfoque validado abre una nueva manera de evaluar la progresión de la OA y los efectos terapéuticos en las primeras etapas antes de que la degradación del tejido macroscópico realmente comience a aparecer. Realizar mediciones de AFM consistentemente es un proceso arduo. En el siguiente protocolo describimos cómo preparar la muestra a medir por AFM, cómo realizar las mediciones reales de AFM comenzando con la preparación del voladizo, cómo calibrar el AFM, y luego cómo realizar las mediciones. Las instrucciones paso a paso proporcionan un enfoque claro y conciso para obtener datos confiables y proporcionar estrategias básicas para procesarlos e interpretarlos. La sección de discusión también describe los escollos más comunes de este método riguroso y proporciona consejos útiles para la solución de problemas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscope (AFM)</td>
			<td>CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM head</td>
			<td>(CellHesion 200) JPK</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocompatible sample glue</td>
			<td>JPK Instruments AG, Berlin, Germany</td>
			<td>H000033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever</td>
			<td>tip C, k &#188; 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria</td>
			<td>AIO-TL-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)</td>
			<td>AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany</td>
			<td>L201306_03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium without L-glutamine</td>
			<td>(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)</td>
			<td>F1315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>07313-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater associated with AFM</td>
			<td>JPK Instruments AG, Berlin, Germany</td>
			<td>T-05-0117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>2023-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td>TPP93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands</td>
			<td>SA6255012</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of atomic force microscopy to detect early osteoarthritis

Las propiedades biomecánicas de las células y tejidos no sólo regulan su forma y función, sino que también son cruciales para mantener su vitalidad. Los cambios en la elasticidad pueden propagar o desencadenar la aparición de enfermedades importantes como el cáncer u osteoartritis (OA). La microscopía de fuerza atómica (AFM) ha surgido como una herramienta fuerte para caracterizar cualitativa y cuantitativamente las propiedades biomecánicas de estructuras biológicas específicas a escala microscópica, midiendo fuerzas en un rango tan pequeño como el piconewton hasta el micronewton. Las propiedades biomecánicas son de especial importancia en los tejidos musculoesqueléticos, que están sometidos a altos niveles de tensión. OA como una enfermedad degenerativa del cartílago resulta en la interrupción de la matriz pericelular (PCM) y la reorganización espacial de los condrocitos incrustados en su matriz extracelular (ECM). La interrupción en PCM y ECM se ha asociado con cambios en las propiedades biomecánicas del cartílago. En el presente estudio utilizamos AFM para cuantificar estos cambios en relación con los cambios específicos del patrón espacial de los condrocitos. Con cada cambio de patrón, se observaron cambios significativos en la elasticidad para el PCM y el ECM. La medición de la elasticidad local permite sacar conclusiones directas sobre el grado de degeneración del tejido local en OA.

A lo largo del modelo fisiopatológico de cadenas a cuerdas dobles, a pequeños y finalmente a clústeres grandes, tanto ECM(Figura 3A)como módulos elásticos PCM(Figura 3B)disminuyeron significativamente entre cada cambio de patrón. La única excepción fue la diferencia en ECM entre cadenas y cadenas dobles (p - 0.072). Los resultados muestran que la relación ECM/PCM(Figura 4B) no cambió significativamente, mientras que se obs...

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Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Presentamos un método para investigar los cambios osteoartríticos tempranos a nivel celular en el cartílago articular mediante el uso de microscopía de fuerza atómica (AFM).

Aplicación de microscopía de fuerza atómica para detectar la osteoartritis temprana

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Las propiedades biomecánicas de las células y tejidos regulan su función y vitalidad. AFM permite la cuantificación temprana de la osteoartritis a nivel celular basada en mediciones de elasticidad. AFM permite la adquisición de mediciones a nivel celular sin dañar la muestra y con una alta resolución, fiabilidad y sensibilidad.Los cambios biomecánicos de la propiedad ocurren temprano en la osteoartritis. La medición de la elasticidad local del cartílago articular permite extraer conclusiones válidas sobre el grado de degeneración del tejido local. Para evaluar los cambios degenerativos dentro de la articulación de la rodilla humana, primero utilice un bisturí para cortar el cartílago articular como un todo del hueso subcondral e incrustar la muestra de cartílago en medio de incrustación soluble en agua en la perilla De Cryotome que se congela a baja temperatura en el dispositivo Cryotome.Cuando la muestra se haya congelado, utilice un Cryotome estándar para adquirir secciones de tejido de 35 micrómetros de espesor de la capa superior del cartílago articular, recogiendo cada sección en diapositivas de vidrio individuales. Una vez obtenidas todas las secciones, enjuague las muestras tres veces en PBS fresco durante cinco minutos por lavado para retirar el medio de incrustación soluble en agua. Retire la primera diapositiva del lavado.Después de esto, agregue dos o tres gotas de pegamento de muestra biocompatible por sección en platos Petri individuales compatibles con AFM. Retire cualquier exceso de solución de la muestra y presione suavemente los bordes de la sección seca sobre las manchas de pegamento. Después de dos minutos, cubra cuidadosamente los tejidos unidos con el medio L-15 de Leibovitz sin L-glutamina y coloque los platos en una incubadora de cultivo celular hasta que se analicen las muestras.Para preparar el dispositivo AFM, ajuste un bloque de gas para medir en un entorno líquido en el soporte AFM a que la superficie superior sea paralela al soporte, y utilice pinzas para montar cuidadosamente el voladizo seleccionado en la superficie del bloque de vidrio de modo que la punta AFM con la microesfera sobresalga sobre el plano óptico pulido. Para estabilizar el voladizo en el bloque de vidrio, deslice el resorte metálico en la ranura del bloque y utilice pinzas para sujetar la parte superior del voladizo con el resorte. Coloque cuidadosamente el bloque de vidrio con el voladizo en el cabezal AFM y fije el bloque con el mecanismo de bloqueo integrado.A continuación, monte el cabezal AFM con el voladizo en el dispositivo AFM con el resorte orientado hacia la izquierda. Para montar la muestra en el dispositivo AFM, coloque la muestra de placa Petri en el portacuchillas AFM y ajuste el calentador de platos Petri a 37 grados Centígrados. Después de unos 20 minutos, abra el software del dispositivo y las ventanas de configuración de parámetros de aproximación y alineación láser.A continuación, encienda el motor paso a paso, la luz láser y la cámara CCD y utilice la función de motor paso a paso para bajar el voladizo en pasos de 100 micrómetros hasta que el voladizo esté completamente sumergido en el medio. Utilice los tornillos de ajuste para dirigir el láser en la parte superior del voladizo y utilice los tornillos del dispositivo AFM para ajustar el rayo láser de modo que el haz reflejado caiga en el centro del fotodetector. Una vez ajustado el voladizo láser, ajuste el fotodetector según sea necesario para ajustar la señal de suma a un voltio o superior y las desviaciones laterales y verticales a cerca de cero.Para obtener la curva de fuerza de calibración, ejecute un enfoque de escáner con los parámetros de aproximación indicados en la tabla. Una vez que se alcance la parte inferior de la planta de cultivo de tejido, retraiga el voladizo en 100 micrómetros. Configure los parámetros de ejecución como se indica en la tabla.Y haga clic en ejecutar para iniciar una medición y obtener una curva de distancia de fuerza de calibración. La curva de fuerza se obtiene como se ilustra en la figura. En la curva de distancia de fuerza de calibración, seleccione la región para un ajuste lineal de la curva retraída.Una vez que el ajuste lineal está en su lugar, los valores serán guardados por el software. A continuación, a medida que las mediciones se realizan en medio a 37 grados Celsius temperatura, establezca la variable de temperatura en el software en 37 grados para imitar las condiciones fisiológicas lo más estrechamente posible. Para identificar los patrones de conversita en las secciones de la muestra de cartílago, localice e identifique los patrones celulares específicos del cartílago articular a partir de la rodilla osteoartrítica en el microscopio de contraste de fase, que pueden incluir cadenas simples indicativas de áreas de tejido sano, doble cadena indicativa del comienzo de la degeneración tisular, pequeños racimos, que son signos de degeneración avanzada del tejido, y grandes racimos, indicativos de la destrucción del tejido final.Una vez que se ha identificado un patrón deseado específico, para mediciones de matriz pericelular, coloque el voladizo cerca de las celdas y mida dos sitios por patrón elegido por tipo de matriz, nueve veces por sitio de medición, incluyendo un tamaño de muestra lo suficientemente grande como para tener en cuenta posibles inexactitudes. Concéntrese en la matriz celular del patrón a medir y fije el ratón de la computadora en ese punto. A continuación, concéntrese en la sonda y mueva la punta de la sonda al punto previamente fijado por la flecha del equipo.Para realizar mediciones de la matriz extracelular, seleccione una región sin células y realice un enfoque seguido de una retracción para que el voladizo se coloque 100 micrómetros por encima del tejido. A continuación, haga clic en Ejecutar para iniciar las mediciones, utilizando el parámetro de consigna obtenido mediante la calibración del voladizo. Para procesar los datos obtenidos, abra el software de procesamiento de datos compatible con los datos obtenidos del dispositivo AFM y seleccione el modelo Hearst en el software para procesar las curvas de distancia de fuerza.Establezca la relación de Poisson en 0,5, la forma de la punta como esférica y el radio de la punta en 12,5 micrómetros. Una vez ajustados todos los parámetros, se ajustarán los resultados y el programa de Young's Modulus será calculado por el software. A lo largo del modelo fisiopatológico de cuerdas a cadenas dobles y de racimos pequeños a grandes, los módulos elásticos de matriz extracelular y pericelular disminuyen significativamente entre cada cambio de patrón, excepto entre cadenas y cadenas dobles.Además, la relación de matriz extracelular-pericelular no cambia significativamente, mientras que se observa una marcada disminución en las diferencias absolutas de elasticidad entre las matrices extracelulares y pericelulares. Los valores de elasticidad dependen de varias condiciones, como la profundidad de sangría o las propiedades de punta en voladizo. Por lo tanto, AFM es el más adecuado para comparar diferentes condiciones dentro de la misma configuración experimental.Como el AFM mide la elasticidad local de la muestra, las secciones deben fijarse en su lugar para permitir mediciones precisas y evitar daños en voladizo. Para analizar más a fondo los procesos responsables de los cambios de elasticidad tisular, la cuantificación bioquímica de la estructura de las proteínas de interés se puede realizar a través de manchas occidentales o ELISAs.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Inmovilización de bacterias para tratamiento de imágenes de microscopía de fuerza atómica

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Investigación

Bioingeniería

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La visualización de ADN recombinante y complejos de proteínas utilizando microscopía de fuerza atómica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

La cuantificación de las propiedades mecánicas de la glicocálix endotelial con la Microscopía de Fuerza Atómica

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Medición de las propiedades mecánicas de las células vivas mediante microscopía de fuerza atómica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

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Shock Wave aplicación a los cultivos celulares

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Superficie de medición de potencial de bacterias usando Kelvin Sonda de Microscopía de Fuerza

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Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Novela Microscopía de Fuerza Atómica Based biopanning para el aislamiento de Morfología reactivos específicos contra la TDP-43 variantes en la esclerosis lateral amiotrófica

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Fuerza Atómica Microscopía Imaging y Fuerza Espectroscopia de admitidos Bilayers lípidos

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

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Microscopía de fuerza de tracción de alto rendimiento Mediante PDMS revela efectos dependientes de la dosis de transformar el factor de crecimiento en la transición epitelial a mesenquimal

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

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Fabricación e implementación de una plataforma de microscopía de fuerza de tracción sin referencia

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