Name: double in utero electroporation to target temporally and spatially separated cell populations
Uploaded: 2020-06-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations at JoVE.com

De auteurs bedanken Cristina Andrés Carbonell en leden van de Animal Care-faciliteit van de Universidad de Valencia voor technische bijstand. We willen ook Isabel Fariñas en Sacramento R. Ferrón bedanken voor reagentia en het delen van hun apparatuur met ons. I.M.W wordt gefinancierd door een Garantía Juvenil contract uit de Conselleria de Educación de Valencia (GJIDI/2018/A/221), D.dA.D wordt gefinancierd door de Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). C.Gil-Sanz heeft een Ramón y Cajal Grant (RYC-2015-19058) van het Spaanse Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN). Dit werk werd gefinancierd RYC-2015-19058 en SAF2017-82880-R (MICINN).

De hierin beschreven procedure is goedgekeurd door de ethische commissie belast met experimenten, het dierenwelzijn van de Universidad de Valencia en de Conselleria de Agricultura, Desarrollo Rural, Emergencia Climática y Transición Ecológica of the Comunidad Valenciana, and adheres to the guidelines of the International Council for Laboratory Animal Science (ICLAS) reviewed in the Real Decreto 53/2013 of the Spanish legislation as in the Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council.
<p class...

<ol>
	<li>Popovitchenko, T., Rasin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+post-transcriptional+mechanisms+of+the+development+of+neocortical+lamination.">Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102 (2017).</li><li>Mukhtar, T., Taylor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untangling+Cortical+Complexity+During+Development.">Untangling Cortical Complexity During Development.</a> Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+Visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li><li>Shimogori, T., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+application+with+in+utero+electroporation+in+mouse+embryonic+brain.">Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 50, 499-506 (2008).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+embryonic+mouse+central+nervous+system+cells+by+in+utero+electroporation.">Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 50, 507-511 (2008).</li><li>Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., M&#252;ller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reelin+Regulates+Cadherin+Function+via+Dab1/Rap1+to+Control+Neuronal+Migration+and+Lamination+in+the+Neocortex.">Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex.</a> Neuron. 69, 482-497 (2011).</li><li>Gil-Sanz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal-Retzius+cells+instruct+neuronal+migration+by+coincidence+signaling+between+secreted+and+contact-dependent+guidance+cues.">Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues.</a> Neuron. 79, 461-477 (2013).</li><li>Martinez-Garay, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin+2/4+signaling+via+PTP1B+and+catenins+is+crucial+for+nucleokinesis+during+radial+neuronal+migration+in+the+neocortex.">Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex.</a> Development. 143, 2121-2134 (2016).</li><li>Popovitchenko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+binding+protein+HuR+determines+the+differential+translation+of+autism-associated+FoxP+subfamily+members+in+the+developing+neocortex.">The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Bultje, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Par3+Regulates+Progenitor+Cell+Asymmetric+Division+via+Notch+Signaling+in+the+Developing+Neocortex.">Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex.</a> Neuron. 63, 189-202 (2009).</li><li>Rodr&#237;guez-Tornos, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cux1+Enables+Interhemispheric+Connections+of+Layer+II/III+Neurons+by+Regulating+Kv1-Dependent+Firing.">Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing.</a> Neuron. 89, 494-506 (2016).</li><li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation.">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).</li><li>Mire, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+activity+regulates+Robo1+transcription+to+mediate+a+switch+in+thalamocortical+axon+growth.">Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth.</a> Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).</li><li>Kawauchi, D., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+cascade+from+Math1+to+Mbh1+and+Mbh2+is+required+for+cerebellar+granule+cell+differentiation.">Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation.</a> Developmental Biology. 322, 345-354 (2008).</li><li>Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+electroporation+approaches+to+study+the+excitability+of+neuronal+subpopulations+and+single-cell+connectivity.">In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity.</a> Journal of Visualized Experiments. 120, e55139 (2017).</li><li>Bielle, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+origins+of+Cajal-Retzius+cells+at+the+borders+of+the+developing+pallium.">Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium.</a> Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).</li><li>Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+p73+and+Reelin+in+the+Developing+Human+Cortex.">Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex.</a> Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).</li><li>Takiguchi-Hayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Reelin-Positive+Marginal+Zone+Cells+from+the+Caudomedial+Wall+of+Telencephalic+Vesicles.">Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles.</a> Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).</li><li>Berry, M., Rogers, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migration+of+neuroblasts+in+the+developing+cerebral+cortex.">The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex.</a> Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).</li><li>Alc&#225;ntara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+and+cellular+patterns+of+reelin+mRNA+expression+in+the+forebrain+of+the+developing+and+adult+mouse.">Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse.</a> Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).</li><li>Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+loss+of+Cajal-Retzius+cells+does+not+disrupt+neocortical+layer+order.">Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order.</a> Development. 133, 537-545 (2006).</li><li>Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+radial+migration+in+early+development+of+the+cerebral+cortex.">Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex.</a> Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).</li><li>Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development,+specification,+and+diversity+of+callosal+projection+neurons.">Development, specification, and diversity of callosal projection neurons.</a> Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).</li><li>Thomson, A. M., Bannister, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaminar+Connections+in+the+Neocortex.">Interlaminar Connections in the Neocortex.</a> Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).</li><li>Zarrinpar, A., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+connections+to+specific+types+of+layer+6+neurons+in+the+rat+visual+cortex.">Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).</li><li>Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+Transcallosal+Projections+Are+Present+throughout+the+Mouse+Cortex.">Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36 (2017).</li><li>DeFelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+the+brain,+the+human+nature+of+cortical+circuits,+and+intellectual+creativity.">The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29 (2011).</li><li>Velmeshev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genomics+identifies+cell+type&#8211;specific+molecular+changes+in+autism.">Single-cell genomics identifies cell type&#8211;specific molecular changes in autism.</a> Science. 364, 685-689 (2019).</li></ol>

De studie van celcelinteracties in vivo in regio's met een hoge cellulaire dichtheid zoals de hersenschors is een complexe taak. Traditionele benaderingen, waaronder het gebruik van antilichamen om neurites te etiketteren, zijn niet geschikt vanwege het ontbreken van specifieke markers voor verschillende celpopulaties. Het gebruik van transgene murinemodellen, waarbij een bepaald celtype een fluorescerend eiwit uitdrukt, is nuttig om de neuronale processen te visualiseren, maar dit hangt af van de beschikbaarheid van der...

De hersenschors is een zeer complexe en ingewikkeld georganiseerde structuur. Om een dergelijke mate van organisatie te bereiken, corticale projectie neuronen gaan door middel van complexe ontwikkelingsprocessen die hun temporele generatie vereisen, migratie naar hun eindbestemming in de corticale plaat, en de oprichting van korte- en lange afstand verbindingen1,2. Lange tijd was de klassieke manier om corticogenese te bestuderen gebaseerd op het gebruik van knock-out- of knock-in murinemodellen van genen van belang. Deze strategie, en met name het gebruik van voorwaardelijke knock-outmuizen, is echter tijdrovend en duur en levert soms extra problemen op met betrekking tot het bestaan van genetische redundantie of het ontbreken van specifieke CRE-drivers, onder andere kwesties. Een van de benaderingen die ontstond om te proberen deze problemen aan te pakken en die tegenwoordig op grote schaal wordt gebruikt om corticale ontwikkeling te bestuderen is in utero elektroporatie3,4. In utero elektroporatie is een techniek die wordt gebruikt voor somatische transgenese, waardoor in vivo targeting van neurale stamcellen en hun nakomelingen. Deze methode kan worden gebruikt om cellen te labelen door de expressie van fluorescerende eiwitten5,6, voor genmanipulatie in vivo (d.w.z. winst of verlies van functietesten)7,8,9, voor het isoleren van elektrogevormde cortices in vitro en culturing cellen8,10. Bovendien, in utero elektroporatie maakt tijdelijke en regionale controle van het beoogde gebied. Deze techniek heeft tal van toepassingen en is op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van neuronale migratie, stamceldeling, neuronale connectiviteit, en andere onderwerpen8,9,11,12.
Het huidige manuscript beschrijft het gebruik van een in utero elektroporatie variant, dubbel genoemd in utero elektroporatie, om de interacties van cellen in de hersenschors met verschillende temporele en ruimtelijke oorsprong te analyseren. Deze studies zijn uiterst complex om te voltooien bij het gebruik van murine modellen, omdat ze het gecombineerde gebruik van verschillende transgene lijnen vereisen. Enkele van de toepassingen van het protocol beschreven in dit document omvatten de studie van nauwe interacties tussen naburige cellen, evenals interacties tussen verre cellen door middel van lange afstand projecties. De methode vereist het uitvoeren van twee onafhankelijke in utero elektroporatie operaties, tijdelijk gescheiden en ruimtelijk, op dezelfde embryo's om verschillende cel populaties van belang te richten. Het voordeel van deze aanpak is de mogelijkheid van het manipuleren van de genfunctie in een of beide soorten neuronen met behulp van wilde type dieren. Bovendien kunnen deze functionele experimenten worden gecombineerd met de expressie van cytoplasmatische of membraangelabelde fluorescerende eiwitten om de fijne morfologie van gerichte cellen, inclusief dendrieten en axonen, te visualiseren en mogelijke verschillen in cellulaire interacties te analyseren in vergelijking met een controle (d.w.z. cellen die alleen zijn gelabeld met het fluorescerende eiwit).
Het hier afgebakende protocol is gericht op de studie van cellulaire interacties binnen de neocortex, maar deze strategie kan ook worden gebruikt om interacties met extracortical gebieden te onderzoeken die kunnen worden gericht met behulp van utero-elektroporatie, zoals het subpallium of de thalamus13,14, of celcelinteracties in andere structuren, zoals het cerebellum15. Targeting van verschillende gebieden is gebaseerd op de oriëntatie van de elektroden en op de ventrikel waar het DNA wordt geïnjecteerd (laterale, derde of vierde). Met de hier beschreven strategie kunnen we een aanzienlijk aantal cellen labelen, wat handig is om algemene veranderingen in connectiviteit/innervatie in functionele experimenten te evalueren. Niettemin, om fijne veranderingen in connectiviteit te bestuderen, kan men gewijzigde versies van in utero elektroporatie gebruiken om sparser het etiketteren te krijgen en enige cellen16te identificeren. Samengevat, dubbel in utero elektroporatie is een veelzijdige methode die het mogelijk maakt gericht tijdelijk en ruimtelijk gescheiden celpopulaties en het bestuderen van hun interacties in detail, hetzij in controleomstandigheden of in combinatie met functionele experimenten, aanzienlijk verminderen van tijdelijke en economische kosten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baby-mixter hemostat (perfusion)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B100-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml)</td>
			<td>Rb Pharmaceuticals Limited</td>
			<td>921425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAG-BFP plasmid</td>
			<td>Kindly provided by U.M&#252;ller Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAG-EGFP plasmid</td>
			<td>Kindly provided by U.M&#252;ller Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAG-mCherry plasmid</td>
			<td>Kindly provided by U.M&#252;ller Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid</td>
			<td>Kindly provided by U.M&#252;ller Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV10i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swabs</td>
			<td>BFHCVDF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>B. Braun Surgical</td>
			<td>1050044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>stemi 305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5 Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM830 Square Wave Electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric Razor</td>
			<td>Oster</td>
			<td>76998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endotoxin-free TE buffer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>1018499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol wipes</td>
			<td>BFHCVDF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>682542.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>14069-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence LEDs</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>pE-300-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genopure Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3143422001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsted-Mosquito Hemostats (suture)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>91308-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>UFESA</td>
			<td>AL5514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE2000-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine wipes</td>
			<td>Lorsoul</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane vaporizer</td>
			<td>Flow-Meter</td>
			<td>A15B5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Karizoo</td>
			<td>586259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Anastemine)</td>
			<td>Fatro Ib&#233;rica SL</td>
			<td>583889-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech precision wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Lennox) Agar GEN</td>
			<td>Labkem</td>
			<td>AGLB-00P-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Lennox) broth GEN</td>
			<td>Labkem</td>
			<td>LBBR-00P-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melting point agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP165-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine (Sedator)</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>573749.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslips</td>
			<td>Menel-Gl&#228;ser</td>
			<td>15747592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>SLIB-F10-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutiwell plates (24)</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>32024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutiwell plates (48)</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>32048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (for saline solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10112640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 25 G (BD Microlance 3)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>300600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital incubator S150</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td>5133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P Selecta Incubator</td>
			<td>J. P. Selecta, s.a.</td>
			<td>0485472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>PanReac AppliedChem</td>
			<td>A3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic perfusion pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07522-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter</td>
			<td>Btx</td>
			<td>45-0489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex Skin Closure System - 7mm Clips, box of 100</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>203-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex Skin Closure System - Clip Applyer, 7mm</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>204-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11103-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>PanReac AppliedChem</td>
			<td>122712-1608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical absorbent pad (steryle)</td>
			<td>HK Surgical</td>
			<td>PD-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (Surgicryl PGA 6-0)</td>
			<td>SMI Suture Materials</td>
			<td>BYD11071512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1ml (BD plastipak)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 100 x 20 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ni</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double in utero electroporation to target temporally and spatially separated cell populations

In utero elektroporatie is een in vivo DNA-overdracht techniek op grote schaal gebruikt om de moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan zoogdier corticogenese te bestuderen. Deze procedure maakt gebruik van de hersenventrikels om de introductie van DNA van belang mogelijk te maken en maakt gebruik van een paar elektroden om de ingang van het genetisch materiaal in de cellen langs de ventrikel, de neurale stamcellen, te leiden. Deze methode stelt onderzoekers in staat om de gewenste cellen te labelen en/of de expressie van genen van belang in die cellen te manipuleren. Het heeft meerdere toepassingen, waaronder tests gericht op neuronale migratie, lineage tracing, en axonale pathfinding. Een belangrijk kenmerk van deze methode is de temporele en regionale controle, waardoor het omzeilen van mogelijke problemen in verband met embryonale dodelijkheid of het ontbreken van specifieke CRE-bestuurdersmuizen mogelijk is. Een ander relevant aspect van deze techniek is dat het helpt om de economische en temporele beperkingen die het genereren van nieuwe muislijnen te betrekken aanzienlijk verminderen, die bijzonder belangrijk worden in de studie van interacties tussen celtypen die afkomstig zijn uit verre gebieden van de hersenen op verschillende ontwikkelingsleeftijden. Hier beschrijven we een dubbele elektroporatiestrategie die het mogelijk maakt om celpopulaties te targeten die ruimtelijk en tijdelijk gescheiden zijn. Met deze aanpak kunnen we verschillende subtypes van cellen op verschillende locaties labelen met geselecteerde fluorescerende eiwitten om ze te visualiseren, en/of we kunnen genen van belang manipuleren die door deze verschillende cellen op de juiste tijdstippen worden uitgedrukt. Deze strategie verbetert het potentieel van in utero elektroporatie en biedt een krachtig hulpmiddel om het gedrag van tijdelijk en ruimtelijk gescheiden celpopulaties te bestuderen die migreren om nauwe contacten te leggen, evenals lange-afstandsinteracties door middel van axonale projecties, waardoor de temporele en economische kosten worden verminderd.

Interacties tussen naburige cellen zijn ontstaan op distale plaatsen en op verschillende tijdstippen: Cajal-Retzius cellen (CR-cellen) en vroege migrerende corticale projectie neuronen (strategie A)
De interactie van CR-cellen en vroege corticale projectieneuronen werd eerder beschreven als noodzakelijk om somale translocatie via nectin en cadherine adhesiemoleculen te reguleren met behulp van een dubbele elektroporatiestrategie8. CR-cellen zijn afkomst...

Watch this Scientific Journal Video about Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations at JoVE.com

Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations

Dubbel in utero elektroporatie maakt het richten van celpopulaties die ruimtelijk en tijdelijk gescheiden. Deze techniek is nuttig om interacties tussen die celpopulaties te visualiseren met behulp van fluorescerende eiwitten in normale omstandigheden, maar ook na functionele experimenten om genen van belang te verstoren.

Dubbel in utero-elektroporatie om tijdelijk en ruimtelijk gescheiden celpopulaties te targeten

In utero electroporation is an in vivo DNA transfer technique extensively used to study the molecular and cellular mechanisms underlying mammalian ...

Dubbel in utero elektroporatie is een krachtige methode voor het bestuderen van de belangrijke aspecten van zoogdier corticogenese, zoals de interactie tussen neuron cellen, gegenereerd op verschillende locaties en ontwikkelingsleeftijden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om onvertorende interacties tussen deze verschillende celpopulaties te onderzoeken op een snelle, gedetailleerde en goedkope manier. Een opvallende implicatie van onze methode is dat het vergemakkelijkt een beter begrip van hoe vergelijkbaar onze bedrading is veranderd in neuronale stoornissen zoals autisme en schizofrenie.Deze studie is niet beperkt tot de neocortex, maar het kan ook worden gebruikt om cel-tot cel interacties te analyseren, in exocortico gebieden zoals het sepalium of cerebellum. Een van de meest uitdagende stappen is het injecteren van DNA in de laterale ventrikels van vroege embryo's. Het gebruik van een heldere lichtbron is essentieel voor succesvolle injecties.Voor elke operatie eerst een 10 microliter oplossing met een microliter van snelle groene kleurstof, een een microgram per microliter plasmide DNA-oplossing van belang voor elke plasmid, en het juiste volume op Endotoxine vrije TE buffer. En laad een glazen microcapillaire pipet voor met de juiste voorbereide DNA-oplossing. Voor de eerste in utero elektroporatie chirurgie, van toepassing zalf op de ogen van een adequaat getimed verdoofde zwangere muis, en gebruik een scheermes om de buik te scheren.Desinfecteer de blootgestelde huid twee keer met sequentiële 70%-ethanol- en jodiumdoekjes voordat u verdergaat met de incisie aan de rechterkant van de buik. Zodra de baarmoeder toegankelijk is gebruik ring tangen om zorgvuldig te extraheren het orgaan. Met behulp van een mondgecontroleerde aspiratorbuis, injecteer ongeveer 0,5 microliter oplossing in de laterale ventrikel van de linker hersenhelft van E11.5 embryo's voor strategie A.Of in de laterale ventrikel van de rechter hersenhelft van E13.5 embryo's voor strategie B, totdat de snelle groene kleurstof zichtbaar is in de ventrikel.Wanneer alle van de oplossing is geïnjecteerd, plaats tangen type platina elektroden lateraal rond van het hoofd van de geïnjecteerde embryo's, met de positieve pool gericht op de mediale muur om de corticale zoom richten voor strategie A, of gericht op de laterale cortex voor strategie B, het verzorgen van het hart en placenta te vermijden. Gebruik een vierkante golf elektroporater om de juiste volgorde van elektrische pulsen toe te passen voor elke embryonale leeftijd, zoals aangegeven in de tabel. Wanneer alle embryo's zijn geïnjecteerd en geëlektrooeerd, gebruik tangen om de baarmoeder zorgvuldig terug te keren naar de buikholte, en vul de buik met warme zoutoplossing.Met behulp van een naald 6-0 hechting, sluit de buikwand, en sluit zorgvuldig de huid incisie. Breng het dier vervolgens terug naar zijn kooi met controle tot volledig herstel. Twee dagen na de eerste operatie, bevestigen dat de muis is normaal gedrag vertonen, en presenteert geen tekenen van pijn of nood.Voor de voorbereiding van het dier voor de tweede in utero elektroporatie zoals net aangetoond. Injecteer 0,5 microliter van de gewenste DNA-oplossing in de linker laterale hersenventaarde van E13,5 embryo's voor strategie A, en in de linker laterale hersenventrikel van E15.5 embryo's voor strategie B.Plaats na elke injectie de elektroden met de positieve pool gericht op de laterale cortex van het geïnjecteerde halfrond voor strategie A en strategie B.En elektrorraat embryo's zoals aangegeven in de tabel. Wanneer de elektroporatie klaar is, breng de baarmoeder terug naar de buikholte en voltooi de operatie en postchirurgische zorg zoals aangetoond.Bij de uitvoering van strategie A, vier dagen na de tweede elektroporatie, oogst de baarmoeder van de embryonale dag 17,5 zwangere vrouwelijke muis in een petrischaaltje pbs op ijs. En gebruik een pincet om de embryo's over te brengen in een nieuw gerecht van PBS onder een ontledenmicroscoop. Met behulp van tangen, zorgvuldig grijpen het hoofd van elk embryo om de verwijdering van de huid over het hoofd en de schedel te vergemakkelijken.Gebruik tangen of een spatel om de blootgestelde hersenen op te tillen. Gebruik dan lepel om elke hersenen over te dragen in individuele putten van een 48 put plaat met ongeveer 600 microliter fixatieve oplossing per goed. Wanneer alle hersenen zijn verzameld, bevestig de hersenen op vier graden Celsius 's nachts op een orbitale shaker, gevolgd door drie tien minuten wasbeurten in PBS.Na de laatste wasbeurt, insluiten de hersenen in 4% laag smeltpunt agarose in PBS voor ongeveer tien minuten. Nadat de agarose is gestold, gebruik cyanoacrylaat lijm om elke hersenen te beveiligen om een vibratome weefsel houder olfactorische bol kant omhoog. Plaats de houder in de vibratome container en vul de container met PBS.Gebruik vervolgens de vibratome en een borstel om 100 micrometer dikke coronale seriële secties te verkrijgen. Het overbrengen van maximaal zeven secties per put en zes putten per embryo, in een nieuwe 48 putplaat met 600 microliter per put verse PBS, aangevuld met antischimmelconserveringsmiddelen zoals ze worden verzameld. Wanneer alle secties zijn verworven, gebruik dan een fijne borstel om elke sectie op een glazen microscoopplaat te monteren en ze af te dekken met een glazen coverslip voor de beoordeling van de elektroporatiewerking op een rechtopstaande epifluorescentiemicroscoop.Bij de uitvoering van strategie B, op postnatale dag 15, na het bevestigen van een gebrek aan reactie op topinch, zet de muis in de supine positie, en gebruik schaar om een midline huid incisie te maken om de ribbenkast en het middenrif bloot te leggen, en snijd het middenrif om toegang te krijgen tot het hart. Maak met behulp van een fijne schaar een incisie in het rechteratrium en gebruik een 25 gage naald die is aangesloten op een flexibele buis met een peristaltische perfusiepomp om de linkerventrikel binnen te dringen. Wanneer de naald op zijn plaats is, leveren ten minste 25 milliliter van 4%paraformaldehyde door transcardial perfusie, bij een constante flux op 5,5 milliliter per minuut.Na ongeveer vijf minuten, stop de perfusie, en gebruik een schaar om de huid te verwijderen over het hoofd. Verwijder de schedel, en gebruik een spatel om het hersenweefsel te verwijderen. Plaats de hersenen in een put van een 24 put plaat met 1,5 milliliter verse 4%paraformaldehyde, voor een nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius op een orbitale shaker.Dan verwerven 40 micrometer secties van de postnatale hersenen zoals net aangetoond. Voor embryonale en postnatale hersenen slice imaging, plaats de dia's met de gemonteerde hersensecties van belang op een microscoop dia houder. Introduceer de schuifregelaar in de confocale microscoop en selecteer het juiste kanaal voor de fluorfores die in het experiment worden gebruikt.Voer voorbeeldscans uit om kaartafbeeldingen van elke hersensectie op twee verschillende golflengten te verkrijgen voor een algemeen beeld van de dubbele elektroporatieoutput. Eenmaal klaar, selecteer de 10x lens, in de multi-area Z-stack time lapse observation mode. Stel in elk van de geselecteerde XY-gebieden de juiste beeldvormingsperiden en de diepte van het scannen langs de Z-as in op basis van de vlakken van het monster, waarin de fluorescentie zichtbaar is.Verkrijg afbeeldingen met een lage vergroting van alle gekozen regio's en exporteer de afbeeldingen van OIF naar TIFF-formaat in de software voor microscoopviewer. Selecteer vervolgens de 60x-lens en leg beelden met een hoge vergroting vast, zoals zojuist is aangetoond, om de cel-naar-cel-interacties op een gedetailleerder niveau te observeren. De temporele kloof tussen de dubbele in utero elektroporatie operaties maakt CAG toresial cellen gericht op embryonale dag 11,5 in een van de plaatsen van oorsprong naar de marginale zone van de laterale neocortex met inbegrip van de somatosensorische gebied te bereiken, op tijd om contacten te leggen met corticale projectie neuronen, gelabeld op embryonale dag 13,5.De toonaangevende processen van projectie neuronen uitdrukken verbeterde GFP overvloedig uprise in de marginale zone van de cortex, en vermengen zich met de processen van M-cherry uitdrukken cataretzial cellen. In utero elektroporatie op embryonale dag 13.5, met behulp van een BFP uitdrukken plasmide vergemakkelijkt de etikettering van projectie neuronen over verschillende corticale lagen. Een tweede elektroporatie in de contralaterale kant van embryonale dag 15,5 richt zich op de bovenste laag callosale projectie neuronen subpopulatie, maar niet de onderste laag projectie neuronen die zich ontwikkelen in een eerder stadium.Bovenste laag gerichte neuronen breiden hun axonen uit naar de contralaterale hemisfeer, met het karakteristieke arborisatiepatroon. Hoge vergroting maakt een meer gedetailleerde visualisatie van callosale axon innervatie van de beoogde projectie neuronen binnen de contralaterale hemisfeer. Bij het proberen van dit protocol is het belangrijk om elektroporatietiming te plannen, het halfrond te injecteren en de positie van de elektroden volgens de celpopulaties die moeten worden gericht.Na deze procedure alle methoden, zoals elektroporatie is de interessante. Voor beide celtypen kunnen worden uitgevoerd om mogelijke circuitwijzigingen in vivo te bestuderen. Met behulp van deze techniek is het mogelijk om fijne interacties tussen twee verschillende doelcellen te bestuderen.Inclusief nieuwe wetenschappelijke informatie in vivo, door de elektroporatie van fluorescerende synaptische eiwitten.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Ultrasound-Guided micro-injectie in de muis voorhersenen In Utero At E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Elektroporatie gevolgd door primaire neuronale Cultuur voor het bestuderen van Gene Functie in subset van de corticale neuronen

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Efficiënte gen delivery in meerdere CNS Gebieden Het gebruik van In Utero Elektroporatie

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Muis In Utero Elektroporatie: Gecontroleerde spatiotemporele Gene Transfectie

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Uitbreiding van embryonale en adulte neurale stamcellen door<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation of Viral stereotactische injectie

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisatie en genetische manipulatie van dendrieten en stekels in de muis Cerebral cortex en de hippocampus met behulp van<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generatie Topisch transgene Rats door<em&gt; In de baarmoeder</em&gt; Elektroporatie en<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescence Screening

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetische Manipulatie van de muis Ontwikkelen Hypothalamus via<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Laterale Septal Nucleus- en Striatum-specifieke<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporatie in de C57BL / 6 muis

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Een nieuwe strategie combinatie matrix-CGH, geheel-exome Sequencing en In Utero Electroporation bij knaagdieren ter identificatie van de oorzakelijke genen voor hersenen misvormingen