Name: double in utero electroporation to target temporally and spatially separated cell populations
Uploaded: 2020-06-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations at JoVE.com

著者らは、クリスティーナ・アンドレス・カルボネルとバレンシア大学のアニマルケア施設のメンバーに対し、技術支援を求めて感謝している。また、イザベル・ファリニャスとサクラメント・R・フェロンの試薬と機器の共有に感謝したいと思います。I.M.Wは、インセラーシア・デ・エドゥカシオン・デ・バレンシア(GJIDI/2018/A/221)のガランティア・ジュベニル契約によって資金提供され、D.dA.Dはシエンシア大臣、イノバシオン・イ・ユニバーシダーデス(MICINN)(FPI-PRE2018-086150)によって資金提供されています。C.Gil-Sanzは、スペインのイノバシオン・イ・ウニバーシダーデス(MICINN)のスペイン大臣からラモン・イ・カハル・グラント(RYC-2015-19058)を保持しています。この作品はRYC-2015-19058およびSAF2017-82880-R(MICINN)に資金を提供しました。

ここに記載されている手順は、実験を担当する倫理委員会、バレンシア大学の動物福祉およびアグリカルチュラコンセラースによって承認されています。 デサロロ農村、緊急クリマチカ・イ・トランティシオン・エコロギカ・オブ・コンビニダード・バレンシアナのエコロギカは、スペインの法律の実Decreto 53/2013および欧州議会および理事会の指令2010/63/EUでレビューされた国際実験動物科?...

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	<li>Popovitchenko, T., Rasin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+post-transcriptional+mechanisms+of+the+development+of+neocortical+lamination.">Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102 (2017).</li><li>Mukhtar, T., Taylor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untangling+Cortical+Complexity+During+Development.">Untangling Cortical Complexity During Development.</a> Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+Visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li><li>Shimogori, T., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+application+with+in+utero+electroporation+in+mouse+embryonic+brain.">Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 50, 499-506 (2008).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+embryonic+mouse+central+nervous+system+cells+by+in+utero+electroporation.">Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 50, 507-511 (2008).</li><li>Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., M&#252;ller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reelin+Regulates+Cadherin+Function+via+Dab1/Rap1+to+Control+Neuronal+Migration+and+Lamination+in+the+Neocortex.">Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex.</a> Neuron. 69, 482-497 (2011).</li><li>Gil-Sanz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal-Retzius+cells+instruct+neuronal+migration+by+coincidence+signaling+between+secreted+and+contact-dependent+guidance+cues.">Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues.</a> Neuron. 79, 461-477 (2013).</li><li>Martinez-Garay, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin+2/4+signaling+via+PTP1B+and+catenins+is+crucial+for+nucleokinesis+during+radial+neuronal+migration+in+the+neocortex.">Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex.</a> Development. 143, 2121-2134 (2016).</li><li>Popovitchenko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+binding+protein+HuR+determines+the+differential+translation+of+autism-associated+FoxP+subfamily+members+in+the+developing+neocortex.">The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Bultje, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Par3+Regulates+Progenitor+Cell+Asymmetric+Division+via+Notch+Signaling+in+the+Developing+Neocortex.">Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex.</a> Neuron. 63, 189-202 (2009).</li><li>Rodr&#237;guez-Tornos, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cux1+Enables+Interhemispheric+Connections+of+Layer+II/III+Neurons+by+Regulating+Kv1-Dependent+Firing.">Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing.</a> Neuron. 89, 494-506 (2016).</li><li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation.">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).</li><li>Mire, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+activity+regulates+Robo1+transcription+to+mediate+a+switch+in+thalamocortical+axon+growth.">Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth.</a> Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).</li><li>Kawauchi, D., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+cascade+from+Math1+to+Mbh1+and+Mbh2+is+required+for+cerebellar+granule+cell+differentiation.">Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation.</a> Developmental Biology. 322, 345-354 (2008).</li><li>Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+electroporation+approaches+to+study+the+excitability+of+neuronal+subpopulations+and+single-cell+connectivity.">In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity.</a> Journal of Visualized Experiments. 120, e55139 (2017).</li><li>Bielle, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+origins+of+Cajal-Retzius+cells+at+the+borders+of+the+developing+pallium.">Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium.</a> Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).</li><li>Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+p73+and+Reelin+in+the+Developing+Human+Cortex.">Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex.</a> Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).</li><li>Takiguchi-Hayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Reelin-Positive+Marginal+Zone+Cells+from+the+Caudomedial+Wall+of+Telencephalic+Vesicles.">Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles.</a> Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).</li><li>Berry, M., Rogers, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migration+of+neuroblasts+in+the+developing+cerebral+cortex.">The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex.</a> Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).</li><li>Alc&#225;ntara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+and+cellular+patterns+of+reelin+mRNA+expression+in+the+forebrain+of+the+developing+and+adult+mouse.">Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse.</a> Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).</li><li>Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+loss+of+Cajal-Retzius+cells+does+not+disrupt+neocortical+layer+order.">Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order.</a> Development. 133, 537-545 (2006).</li><li>Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+radial+migration+in+early+development+of+the+cerebral+cortex.">Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex.</a> Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).</li><li>Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development,+specification,+and+diversity+of+callosal+projection+neurons.">Development, specification, and diversity of callosal projection neurons.</a> Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).</li><li>Thomson, A. M., Bannister, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaminar+Connections+in+the+Neocortex.">Interlaminar Connections in the Neocortex.</a> Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).</li><li>Zarrinpar, A., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+connections+to+specific+types+of+layer+6+neurons+in+the+rat+visual+cortex.">Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).</li><li>Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+Transcallosal+Projections+Are+Present+throughout+the+Mouse+Cortex.">Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36 (2017).</li><li>DeFelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+the+brain,+the+human+nature+of+cortical+circuits,+and+intellectual+creativity.">The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29 (2011).</li><li>Velmeshev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genomics+identifies+cell+type&#8211;specific+molecular+changes+in+autism.">Single-cell genomics identifies cell type&#8211;specific molecular changes in autism.</a> Science. 364, 685-689 (2019).</li></ol>

大脳皮質のような細胞密度の高い領域における生体内での細胞間相互作用の研究は複雑な作業です。神経突起を標識する抗体の使用を含む従来のアプローチは、異なる細胞集団に対する特異的マーカーがないため、適切ではない。特定の細胞型が蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスモデルの使用は、神経細胞のプロセスを可視化するのに有用であるが、これはそのようなモ?...

大脳皮質は非常に複雑で複雑に組織化された構造です。このような組織の程度を達成するために、皮質投影ニューロンは、その側頭発生、皮質プレート内の最終目的地への移行、および短距離および長距離接続の確立1、22を必要とする複雑な発達過程を経る。長い間、コルチコ形成を研究する古典的な方法は、関心のある遺伝子のノックアウトまたはノックインマウスモデルの使用に基づいていました。しかし、この戦略、特に条件付きノックアウトマウスの使用は時間と高価であり、遺伝的冗長性の存在や特定のCREドライバの欠如などに関する追加の問題を提示することがあります。これらの問題に対処するために生じたアプローチの1つは、今日では皮質の発達を研究するために広く使用されている、子宮エレクトロポレーション33、44です。子宮内エレクトロポレーションは、体細胞トランスジェネシスに使用される技術であり、神経幹細胞およびその子孫を生体内で標的化することを可能にする。この方法は、インビボでの遺伝子操作(すなわち、機能アッセイの利得または,損失)7、8、9、8生体9外および培養細胞8、10における電気泳動皮質を単離するための蛍光タンパク質105、6の発現によって細胞を標識するために使用することができる。56さらに、子宮内のエレクトロポレーションでは、標的領域の時間的および地域的制御が可能である。この技術は、多くの用途を有し、広く神経移動、幹細胞分裂、神経結合性、および他の被験者898、9、11、1211,12を研究するために使用されています。,
現在の原稿は、子宮エレクトロポレーションで二重と呼ぶ子宮エレクトロポレーション変異体の使用を記述し、異なる時間的および空間的起源を有する大脳皮質における細胞の相互作用を分析する。これらの研究は、いくつかのトランスジェニックラインの組み合わせ使用を必要とするため、マウスモデルを採用する際に完了するには非常に複雑です。本論文に記載されているプロトコルの応用例としては、隣接する細胞間の密接な相互作用の研究や、長距離投影による遠距離細胞間の相互作用の研究が挙げられる。この方法では、同じ胚上で時間的および空間的に分離された子宮エレクトロポレーション手術において2つの独立した独立を行い、関心のある異なる細胞集団を標的とする。このアプローチの利点は、野生型動物を使用して一方または両方のタイプのニューロンで遺伝子機能を操作する可能性です。さらに、これらの機能実験は、細胞質または膜タグ付き蛍光タンパク質の発現と組み合わせて、樹状突起および軸索を含む標的細胞の微細形態を可視化し、細胞相互作用の可能性のある差異をコントロール(すなわち、蛍光タンパク質で標識した細胞のみ)に比較して分析することができる。
ここで説明するプロトコルは、新皮質内の細胞相互作用の研究に焦点を当てていますが、この戦略は、小脳15のような他の構造のサブパラリウムまたは視床13、14、,14または他の構造の細胞間相互作用のような子宮エレクトロポレーションで標的とすることができる皮質外領域との相互作用を調べるためにも使用できます。異なる領域のターゲット設定は、電極の向きとDNAが注入される心室(側面、第3、または第4)に基づいています。ここで説明した戦略では、機能実験における結合性/インナビネーションの一般的な変化を評価するのに役立つ、かなりの数の細胞にラベルを付けることができます。それにもかかわらず、接続性の微細な変化を研究するために、子宮エレクトロポレーション中の改変版を使用して、まばらな標識を得て、単一細胞16を同定することができる。要約すると、子宮内の二重エレクトロポレーションは、時間的および空間的に分離された細胞集団を標的化し、制御条件下でまたは機能的実験と組み合わせて、それらの相互作用を詳細に研究することを可能にする汎用性の高い方法であり、時間的および経済的コストを大幅に削減する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baby-mixter hemostat (perfusion)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B100-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml)</td>
			<td>Rb Pharmaceuticals Limited</td>
			<td>921425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAG-BFP plasmid</td>
			<td>Kindly provided by U.M&#252;ller Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAG-EGFP plasmid</td>
			<td>Kindly provided by U.M&#252;ller Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAG-mCherry plasmid</td>
			<td>Kindly provided by U.M&#252;ller Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid</td>
			<td>Kindly provided by U.M&#252;ller Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV10i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swabs</td>
			<td>BFHCVDF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>B. Braun Surgical</td>
			<td>1050044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>stemi 305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5 Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM830 Square Wave Electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric Razor</td>
			<td>Oster</td>
			<td>76998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endotoxin-free TE buffer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>1018499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol wipes</td>
			<td>BFHCVDF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>682542.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>14069-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence LEDs</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>pE-300-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genopure Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3143422001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsted-Mosquito Hemostats (suture)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>91308-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>UFESA</td>
			<td>AL5514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE2000-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine wipes</td>
			<td>Lorsoul</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane vaporizer</td>
			<td>Flow-Meter</td>
			<td>A15B5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Karizoo</td>
			<td>586259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Anastemine)</td>
			<td>Fatro Ib&#233;rica SL</td>
			<td>583889-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech precision wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Lennox) Agar GEN</td>
			<td>Labkem</td>
			<td>AGLB-00P-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Lennox) broth GEN</td>
			<td>Labkem</td>
			<td>LBBR-00P-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melting point agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP165-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine (Sedator)</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>573749.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslips</td>
			<td>Menel-Gl&#228;ser</td>
			<td>15747592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>SLIB-F10-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutiwell plates (24)</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>32024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutiwell plates (48)</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>32048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (for saline solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10112640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 25 G (BD Microlance 3)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>300600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital incubator S150</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td>5133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P Selecta Incubator</td>
			<td>J. P. Selecta, s.a.</td>
			<td>0485472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>PanReac AppliedChem</td>
			<td>A3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic perfusion pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07522-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter</td>
			<td>Btx</td>
			<td>45-0489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex Skin Closure System - 7mm Clips, box of 100</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>203-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex Skin Closure System - Clip Applyer, 7mm</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>204-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11103-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>PanReac AppliedChem</td>
			<td>122712-1608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical absorbent pad (steryle)</td>
			<td>HK Surgical</td>
			<td>PD-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (Surgicryl PGA 6-0)</td>
			<td>SMI Suture Materials</td>
			<td>BYD11071512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1ml (BD plastipak)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 100 x 20 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ni</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double in utero electroporation to target temporally and spatially separated cell populations

子宮内エレクトロポレーションは、哺乳類のコルチコ形成の根底にある分子および細胞機構を研究するために広く使用されるin vivo DNA伝達技術である。この手順は、脳室を利用して目的のDNAの導入を可能にし、一対の電極を使用して、遺伝物質の入り口を心室、神経幹細胞を裏打ちする細胞に向ける。この方法により、研究者は望ましい細胞にラベルを付けたり、それらの細胞に関心のある遺伝子の発現を操作することができます。それは神経移動を標的とするアッセイ、系統の追跡および軸索経路の発見を含む複数の適用を、備えている。この方法の重要な特徴は、その時間的および地域的制御であり、胚致死性または特定のCREドライバーマウスの欠如に関連する潜在的な問題の回避を可能にする。この技術のもう一つの関連する側面は、新しいマウスラインの生成を伴う経済的および時間的な制限を大幅に減らすのに役立ち、異なる発達年齢で脳の遠い領域に由来する細胞型間の相互作用の研究において特に重要になる。ここでは、空間的および時間的に分離された細胞集団のターゲットを可能にする二重エレクトロポレーション戦略について説明する。このアプローチにより、選択した蛍光タンパク質を使用して異なる場所の細胞の異なるサブタイプを標識して視覚化したり、これらの異なる細胞によって発現する目的の遺伝子を適切な時期に操作したりできます。この戦略は、子宮内エレクトロポレーションの可能性を高め、密接な接触を確立するために移行する時間的および空間的に分離された細胞集団の挙動を研究する強力なツールを提供し、軸索予測を介した長距離相互作用を研究し、時間的および経済的コストを削減する。

隣接する細胞間の相互作用は、遠位の場所と異なる時期に発生した:Cajal-Retzius細胞(CR細胞)と早期移行皮質投影ニューロン(戦略A)
CR細胞と初期皮質突起ニューロンの相互作用は、二重エレクトロポレーション戦略8を用いてネクチンおよびカドヘリン接着分子を介してソマル転座を調節するために必要であると以前に説明した。CR細胞は、ペリ?...

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Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations

子宮エレクトロポレーションの二重は、空間的および時間的に分離された細胞集団を標的にすることを可能にする。この技術は、通常の条件で蛍光タンパク質を使用して、また、目的の遺伝子を摂動する機能実験の後に、それらの細胞集団間の相互作用を視覚化するのに有用である。

時間的および空間的に分離された細胞集団を標的とする子宮エレクトロポレーションの二重

In utero electroporation is an in vivo DNA transfer technique extensively used to study the molecular and cellular mechanisms underlying mammalian ...

子宮内電散の二重は、異なる場所や発達年齢で生成されるニューロン細胞間の相互作用のような哺乳類の皮質形成の重要な側面を研究するための強力な方法である。この手法の主な利点は、これらの異なる細胞集団間の不安定な相互作用を迅速、詳細、および安価な方法で調べる能力です。私たちの方法の顕著な意味の1つは、自閉症や統合失調症のような神経疾患で私たちの配線がどのように変化するかをより良く理解しやすくすることです。この研究は新皮質に限定されるものではなく、セパリウムや小脳などの外皮質領域で細胞間相互作用を分析するためにも使用できる。最も困難なステップの1つは、初期胚の側心室へのDNAの注入である。明るい光源の使用は、正常な注射のために不可欠です。各手術ごとに、まず1マイクロリットルの速緑色色素を含む10マイクロリットルの溶液、各プラスミドに対して関心のある1マイクロリットルプラスミドDNA溶液、およびEndotoxinフリーTEバッファー上の適切な体積を調製する。そして、適切に調製されたDNA溶液を用いてガラスマイクロキャピラリーピペットをプリロードする。子宮エレクトロポレーション手術の最初の場合は、適切なタイミングで麻酔付きの妊娠中のマウスの目に軟膏を塗布し、カミソリを使用して腹部を剃る。腹部の右側の切開を進める前に、露出した皮膚をシーケンシャルな70%エタノールとヨウ素ワイプで2回消毒します。子宮がアクセス可能になったら、リング鉗子を使用して臓器を慎重に抽出する。口制御アスピレーターチューブを使用して、戦略A.またはE13.5胚の右半球の側心室に、心室の中に速い緑色の染料が見えるまで、E11.5胚の左半球の側心室に約0.5マイクロリットルの溶液を注入する。すべての溶液が注入されたら、鉗子型白金電極を注入胚の頭部の周りに横方向に置き、正極を内側壁に向けて戦略Aの皮質のヘムを標的にするか、または戦略Bのために側皮質に配向し、心臓および胎盤を避けるように注意する。表に示すように、四方波エレクトロポラターを使用して、各胚の年齢に適切な電気パルスのシーケンスを適用します。すべての胚が注入され、電気ポポレートされたら、慎重に子宮を腹腔に戻すために鉗子を使用し、腹部に温かい生理液を満たす。針6~0縫合を用いて、腹壁を閉じ、皮膚切開を注意深く閉じる。その後、完全な回復まで監視と自宅のケージに動物を返します。最初の手術の2日後、マウスが正常な行動を示していることを確認し、痛みや苦痛の徴候を示さない。ちょうど実証したように、子宮内の第二の動物を準備する前に。戦略AのためにE13.5胚の左側脳室に所望のDNA溶液の0.5マイクロリットルを注入し、戦略B.のE15.5胚の左側脳室に注入する。エレクトロポレーションが終了したら、子宮を腹腔に戻し、実証したように手術と手術後のケアを完了します。戦略Aを実施する場合、第2のエレクトロポレーションの4日後、胚の子宮を17.5日目の妊娠雌マウスを氷上のPBSのシャーレに収穫する。そして、ピンセットを使用して、解剖顕微鏡の下でPBSの新しい皿に胚を移す。鉗子を使用して、慎重に頭と頭蓋骨の上に皮膚の除去を容易にするために、各胚の頭を把握します。露出した脳を持ち上げるために鉗子またはへらを使用する。その後、スプーンを使用して、各脳を48ウェルプレートの個々の井戸に移し、井戸あたり約600マイクロリットルの固定液を含みます。すべての脳が収集されたら、軌道シェーカーで一晩摂氏4度で脳を固定し、続いてPBSで10分間の3回の打ち上げを行います。最後の洗浄後、約10分間PBSで4%低融点アガロースに脳を埋め込む。アガロースが固まった後、シアノアクリル酸接着剤を使用して、各脳をビブラート組織ホルダ嗅球側に固定します。ホルダーをビブラートメ容器の中に入れ、容器にPBSを入れます。その後、ビブラートメとブラシを使用して、厚さ100マイクロメートルのコロナシリアルセクションを得ます。1つの井戸および胚当たり6つの井戸に、新鮮なPBSの井戸あたり600マイクロリットルを含む新しい48ウェルプレートで、収集される抗真菌防腐剤を補充する。すべての切片が獲得されたら、細かいブラシを使用して各セクションをガラス顕微鏡スライドに取り付け、直立した発蛍光顕微鏡のエレクトロポレーション効果を評価するためにガラスカバースリップで覆います。戦略Bを実施する場合、出生後15日目に、ピンチに対する応答の欠如を確認した後、マウスを上皮の位置に固定し、中線皮膚切開を行い、胸部および横隔膜を露出させ、横隔膜を切断して心臓にアクセスする。細かいはさみを使用して、右心房に切開を行い、柔軟なチューブに接続された25ゲージ針を蠕動灌流ポンプに接続して左心室に浸透させます。針が所定の位置にある場合、1分間に5.5ミリリットルで一定のフラックスで、4%パラホルムアルデヒドの少なくとも25ミリリットルを送達する。約5分後、灌流を止め、はさみを使って頭の上の皮膚を取り除きます。頭蓋骨を取り除き、へらを使って脳組織を取り除きます。新鮮な4%パラホルムアルデヒドの1.5ミリリットルを含む24ウェルプレートの1つの井戸に脳を置き、軌道シェーカーで摂氏4度で一晩インキュベーションします。その後、ちょうど実証したように、出生後の脳の40マイクロメートルのセクションを取得します。胚性脳および出生後の脳スライスイメージングの場合、関心のある脳切片を含むスライドを顕微鏡スライドホルダーに置きます。スライダーホルダーを共焦点顕微鏡に導入し、実験で使用する蛍光素に適したチャネルを選択します。サンプルスキャンを実行して、二重エレクトロポレーション出力の一般的なビューのために、2つの異なる波長で各脳部の地図画像を取得します。終了したら、多領域Zスタックタイムラプス観察モードで10xレンズを選択します。選択した各XY領域で、蛍光が見えるサンプルの平面に従って、Z軸に沿った適切なイメージングの周長とスキャンの深さを設定します。選択したすべての領域の低倍率画像を取得し、顕微鏡ビューアソフトウェアでOIFからTIFF形式に画像をエクスポートします。次に、60xレンズを選択し、ちょうど示したように高い倍率画像をキャプチャして、より詳細なレベルで細胞間相互作用を観察します。子宮電散ポレーション手術における二重間の時間的ギャップは、胚性胚性13.5日目に標識された皮質投影ニューロンとの接触を確立するために、発芽地の11.5日目に標的となる胚性細胞を形成し、体性感覚領域を含む側新皮質の限界領域に到達することを可能にする。強化されたGFPを発現する投影ニューロンの主要なプロセスは、皮質の限界領域にやたらと上昇し、カタレチア細胞を発現するMチェリーのプロセスと混ざり合う。胚性13.5日目における子宮エレクトロポレーションにおいて、BFP発現プラスミドを用いて、異なる皮質層にわたる投影ニューロンの標識化を容易にする。胚の反対側の第二のエレクトロポレーション 15.5 日目は、上位層のカロスプロジェクションニューロンの亜集団を標的としますが、初期段階で発生する下層投影ニューロンを標的としません。上層標的ニューロンは、軸索を対側半球まで伸ばし、特徴的な樹状化パターンを有する。高倍率は、対角半球内の標的投影ニューロンのカロス軸索のインナレーションをより詳細に可視化することを可能にする。このプロトコルを試みる際には、エレクトロポレーションタイミング、注入する半球、および標的とする細胞集団に応じた電極の位置を計画することが重要である。この手順に従って、エレクトロポレーションなどのすべての方法が興味深いものです。両方の細胞タイプについて、生体内で可能な回路変化を研究するために行うことができる。この技術を用いて、2つの異なる標的細胞間の微細な相互作用を研究することができる。蛍光シナプスタンパク質のエレクトロポレーションによる生体内の新しい科学情報を含む。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

超音波ガイド下のマウスの前脳へのマイクロインジェクション子宮内で E9.5で

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

子宮内エレクトロポレーションは、皮質ニューロンのサブセットで、遺伝子機能の研究のために初代神経培養した

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

使用した複数のCNS準州への効率的な遺伝子送達子宮内でエレクトロポレーション

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

マウス子宮内でエレクトロポレーション：制御時空間遺伝子導入

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

によって胚および成体神経幹細胞の拡大<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーションまたはウイルス定位注射

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

使用して、マウス大脳皮質および海馬における可視化と樹状突起と棘の遺伝子操作<em&gt;子宮内で</em&gt;エレクトロポレーション

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

局所トランスジェニックラットの発生により<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーションおよび<em&gt;インビボ</em&gt;生物発光スクリーニング

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

マウスの遺伝子操作は、視床下部を介して開発<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーション

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

Cortex-、Hippocampus-、Thalamus-、Hypothalamus-、横中隔Nucleus-と線条体固有<em&gt;子宮内</em&gt; C57BL / 6マウスでのエレクトロポレーション

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations