Name: double in utero electroporation to target temporally and spatially separated cell populations
Uploaded: 2020-06-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations at JoVE.com

저자들은 크리스티나 안드레스 카보넬과 유니버시다드 드 발렌시아의 동물 관리 시설 회원들에게 기술 지원을 해 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 시약과 우리와 함께 장비를 공유 이사벨 파리냐스와 새크라멘토 R. 페론에 감사드립니다. I.M.W는 콘셀러티아 드 에두카시온 드 발렌시아 (GJIDI/2018/A/221)의 가란시아 주베닐 계약에 의해 지원되며, D.dA.D는 장관 드 시엔시아, 이유니베르시다데스(MICINN) (FPI-PRE2018-08)의 자금을 지원받습니다. C.Gil-Sanz는 스페인 장관 인 이엔시아, 이노바시온 y 유니버시다데스 (MICINN)에서 라몬 y 카잘 그랜트 (RYC-2015-19058)를 보유하고 있습니다. 이 작품은 RYC-2015-19058 및 SAF2017-82880-R (MICINN)에 자금을 지원했습니다.

본 명세서에서 설명된 절차는 실험, 유니버시다드 드 발렌시아의 동물 복지, 컨셀러디아 드 아그리컬투라를 담당하는 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 데사롤로 농촌, 이머젠시아 클리마티카 y 트랜스시시온 에콜로기카 코무니다드 발렌시아나, 스페인 법안의 실제 Decreto 53/2013에서 검토 된 실험실 동물 과학국제위원회 (ICLAS)의 지침을 준수하고 유럽 의회의 지침 2010/63 / EU.
?...

<ol>
	<li>Popovitchenko, T., Rasin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+post-transcriptional+mechanisms+of+the+development+of+neocortical+lamination.">Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102 (2017).</li><li>Mukhtar, T., Taylor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untangling+Cortical+Complexity+During+Development.">Untangling Cortical Complexity During Development.</a> Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+Visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li><li>Shimogori, T., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+application+with+in+utero+electroporation+in+mouse+embryonic+brain.">Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 50, 499-506 (2008).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+embryonic+mouse+central+nervous+system+cells+by+in+utero+electroporation.">Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 50, 507-511 (2008).</li><li>Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., M&#252;ller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reelin+Regulates+Cadherin+Function+via+Dab1/Rap1+to+Control+Neuronal+Migration+and+Lamination+in+the+Neocortex.">Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex.</a> Neuron. 69, 482-497 (2011).</li><li>Gil-Sanz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal-Retzius+cells+instruct+neuronal+migration+by+coincidence+signaling+between+secreted+and+contact-dependent+guidance+cues.">Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues.</a> Neuron. 79, 461-477 (2013).</li><li>Martinez-Garay, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin+2/4+signaling+via+PTP1B+and+catenins+is+crucial+for+nucleokinesis+during+radial+neuronal+migration+in+the+neocortex.">Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex.</a> Development. 143, 2121-2134 (2016).</li><li>Popovitchenko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+binding+protein+HuR+determines+the+differential+translation+of+autism-associated+FoxP+subfamily+members+in+the+developing+neocortex.">The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Bultje, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Par3+Regulates+Progenitor+Cell+Asymmetric+Division+via+Notch+Signaling+in+the+Developing+Neocortex.">Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex.</a> Neuron. 63, 189-202 (2009).</li><li>Rodr&#237;guez-Tornos, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cux1+Enables+Interhemispheric+Connections+of+Layer+II/III+Neurons+by+Regulating+Kv1-Dependent+Firing.">Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing.</a> Neuron. 89, 494-506 (2016).</li><li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation.">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).</li><li>Mire, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+activity+regulates+Robo1+transcription+to+mediate+a+switch+in+thalamocortical+axon+growth.">Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth.</a> Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).</li><li>Kawauchi, D., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+cascade+from+Math1+to+Mbh1+and+Mbh2+is+required+for+cerebellar+granule+cell+differentiation.">Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation.</a> Developmental Biology. 322, 345-354 (2008).</li><li>Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+electroporation+approaches+to+study+the+excitability+of+neuronal+subpopulations+and+single-cell+connectivity.">In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity.</a> Journal of Visualized Experiments. 120, e55139 (2017).</li><li>Bielle, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+origins+of+Cajal-Retzius+cells+at+the+borders+of+the+developing+pallium.">Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium.</a> Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).</li><li>Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+p73+and+Reelin+in+the+Developing+Human+Cortex.">Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex.</a> Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).</li><li>Takiguchi-Hayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Reelin-Positive+Marginal+Zone+Cells+from+the+Caudomedial+Wall+of+Telencephalic+Vesicles.">Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles.</a> Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).</li><li>Berry, M., Rogers, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migration+of+neuroblasts+in+the+developing+cerebral+cortex.">The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex.</a> Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).</li><li>Alc&#225;ntara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+and+cellular+patterns+of+reelin+mRNA+expression+in+the+forebrain+of+the+developing+and+adult+mouse.">Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse.</a> Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).</li><li>Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+loss+of+Cajal-Retzius+cells+does+not+disrupt+neocortical+layer+order.">Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order.</a> Development. 133, 537-545 (2006).</li><li>Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+radial+migration+in+early+development+of+the+cerebral+cortex.">Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex.</a> Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).</li><li>Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development,+specification,+and+diversity+of+callosal+projection+neurons.">Development, specification, and diversity of callosal projection neurons.</a> Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).</li><li>Thomson, A. M., Bannister, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaminar+Connections+in+the+Neocortex.">Interlaminar Connections in the Neocortex.</a> Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).</li><li>Zarrinpar, A., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+connections+to+specific+types+of+layer+6+neurons+in+the+rat+visual+cortex.">Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).</li><li>Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+Transcallosal+Projections+Are+Present+throughout+the+Mouse+Cortex.">Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36 (2017).</li><li>DeFelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+the+brain,+the+human+nature+of+cortical+circuits,+and+intellectual+creativity.">The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29 (2011).</li><li>Velmeshev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genomics+identifies+cell+type&#8211;specific+molecular+changes+in+autism.">Single-cell genomics identifies cell type&#8211;specific molecular changes in autism.</a> Science. 364, 685-689 (2019).</li></ol>

대뇌 피질 같이 높은 세포 밀도를 가진 지구에 있는 세포 세포 상호 작용의 연구 결과는 복잡한 작업입니다. 중성염을 표지하기 위해 항체의 사용을 포함하는 전통적인 접근은 다른 세포 집단을 위한 특정 마커의 부족 때문에 적합하지 않습니다. 특정 세포 유형이 형광성 단백질을 표현하는 형질 전환 기 의 뮤린 모델의 사용은 뉴런 프로세스를 시각화하는 데 유용하지만, 이것은 그러한 모델의 ?...

대뇌 피질은 매우 복잡하고 복잡하게 구성된 구조입니다. 이러한 정도의 조직을 달성하기 위해, 피질 프로젝션 뉴런은 측두생성을 필요로 하는 복잡한 발달 과정을 거치며, 피질 판의 최종 목적지로의 마이그레이션, 단거리 및 장거리 연결1,,2의확립을 통해 진행된다. 오랜 시간 동안, 코르티코 발생을 연구하는 고전적인 방법은 관심의 유전자의 녹아웃 또는 노크 에 뮤린 모델의 사용에 기초했다. 그러나, 이 전략, 특히 조건부 녹아웃 마우스의 사용은 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들며, 때로는 유전 적 중복의 존재 또는 특정 CRE 드라이버의 부족에 관한 추가 문제를 제시합니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 발생 하는 접근 중 하나는 그 피 질 개발을 연구 하기 위해 요즘 광범위 하 게 사용 된다3,,4. 자궁 에서 전기 화는 신경 줄기 세포와 그들의 자손의 생체 표적을 허용, 체세포 전염에 사용되는 기술이다. 본 방법은 형광 단백질55, 6,6생체 내 유전자 조작을 위해 세포를 라벨링하는 데 사용할 수 있다 (즉, 기능 분석의 이득 또는 손실)7,,8,,9,시험관 내의 전기 폴화 코르티스를 분리하고 세포8,,10을배양하는 데 사용할 수 있다. 더욱이, 자궁 전기기화는 표적 영역의 시간적 및 지역 적 제어를 허용한다. 이 기술은 수많은 응용 프로그램을 가지고 널리 뉴런 마이그레이션을 연구하는 데 사용되어왔다, 줄기 세포 분열, 신경 연결, 및 기타 과목8,,9,,11,,12.
현재 원고는 자궁 전기 기형에서 이중이라고 불리는 자궁 전기 기형의 사용을 설명하며, 대뇌 피질에서 세포의 상호 작용을 서로 다른 측두및 공간 기원으로 분석합니다. 이러한 연구는 여러 형질 전환선의 결합 된 사용을 필요로하기 때문에 뮤린 모델을 사용할 때 완료하는 것은 매우 복잡합니다. 이 논문에 설명된 프로토콜의 응용 프로그램 중 일부는 이웃 세포 간의 긴밀한 상호 작용의 연구뿐만 아니라 장거리 투영을 통해 먼 세포 사이의 상호 작용을 포함한다. 이 방법은 관심의 다른 세포 집단을 표적으로 하기 위하여 동일한 배아에, 측면및 공간적으로 분리된 자궁 전기기 수술에서 2개의 독립적인 능력을 발휘하는 것을 요구합니다. 이 접근법의 장점은 야생 형 동물을 사용하여 뉴런의 하나 또는 둘 다 모형에서 유전자 기능을 조작의 가능성입니다. 또한, 이러한 기능적 실험은 심토플라스믹 또는 멤브레인 태그형 형광 단백질의 발현과 결합하여 물병막 및 축축을 포함한 표적 세포의 미세한 형태를 시각화하고, 대조군(즉, 형광 단백질로만 표지된 세포)과 비교하여 세포 상호 작용의 가능한 차이를 분석할 수 있다.
여기서 묘사된 프로토콜은 신피질 내부의 세포 상호 작용연구에 초점을 맞추고 있지만, 이 전략은 또한 소반15와같은 다른 구조물에서 피판또는 시상13,,14,또는 세포 세포 상호 작용과 같은 자궁 전기포레이션에서 표적화될 수 있는 외피 영역과의 상호 작용을 검사하는 데 사용될 수 있다. 다른 영역의 표적화는 전극의 방향과 DNA가 주입되는 심실 (측면, 세 번째 또는 네 번째)에 기초한다. 여기에 설명된 전략으로, 우리는 기능 실험에서 연결 / 내면의 일반적인 변화를 평가하는 데 유용한 셀의 상당수를 레이블수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 연결의 미세한 변화를 연구하기 위해, 하나는 스파저 라벨링을 얻고 단일세포(16)를식별하기 위해 자궁 전기화에서 수정된 버전을 사용할 수 있다. 요약하자면, 자궁 전기기의 이중은 일시적이고 공간적으로 분리된 세포 집단을 표적으로 하고 통제 조건에서 또는 기능 실험과 결합하여 현세및 경제적 비용을 상당히 줄이는 다목적 방법입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baby-mixter hemostat (perfusion)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B100-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml)</td>
			<td>Rb Pharmaceuticals Limited</td>
			<td>921425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAG-BFP plasmid</td>
			<td>Kindly provided by U.M&#252;ller Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAG-EGFP plasmid</td>
			<td>Kindly provided by U.M&#252;ller Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAG-mCherry plasmid</td>
			<td>Kindly provided by U.M&#252;ller Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid</td>
			<td>Kindly provided by U.M&#252;ller Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV10i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swabs</td>
			<td>BFHCVDF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>B. Braun Surgical</td>
			<td>1050044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>stemi 305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5 Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM830 Square Wave Electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric Razor</td>
			<td>Oster</td>
			<td>76998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endotoxin-free TE buffer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>1018499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol wipes</td>
			<td>BFHCVDF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>682542.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>14069-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence LEDs</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>pE-300-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genopure Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3143422001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsted-Mosquito Hemostats (suture)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>91308-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>UFESA</td>
			<td>AL5514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE2000-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine wipes</td>
			<td>Lorsoul</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane vaporizer</td>
			<td>Flow-Meter</td>
			<td>A15B5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Karizoo</td>
			<td>586259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Anastemine)</td>
			<td>Fatro Ib&#233;rica SL</td>
			<td>583889-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech precision wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Lennox) Agar GEN</td>
			<td>Labkem</td>
			<td>AGLB-00P-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Lennox) broth GEN</td>
			<td>Labkem</td>
			<td>LBBR-00P-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melting point agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP165-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine (Sedator)</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>573749.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslips</td>
			<td>Menel-Gl&#228;ser</td>
			<td>15747592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>SLIB-F10-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutiwell plates (24)</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>32024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutiwell plates (48)</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>32048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (for saline solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10112640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 25 G (BD Microlance 3)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>300600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital incubator S150</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td>5133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P Selecta Incubator</td>
			<td>J. P. Selecta, s.a.</td>
			<td>0485472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>PanReac AppliedChem</td>
			<td>A3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic perfusion pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07522-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter</td>
			<td>Btx</td>
			<td>45-0489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex Skin Closure System - 7mm Clips, box of 100</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>203-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex Skin Closure System - Clip Applyer, 7mm</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>204-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11103-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>PanReac AppliedChem</td>
			<td>122712-1608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical absorbent pad (steryle)</td>
			<td>HK Surgical</td>
			<td>PD-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (Surgicryl PGA 6-0)</td>
			<td>SMI Suture Materials</td>
			<td>BYD11071512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1ml (BD plastipak)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 100 x 20 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ni</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double in utero electroporation to target temporally and spatially separated cell populations

자궁에서 전기화는 포유류 코르티코발생의 근본적인 분자 및 세포 메커니즘을 연구하기 위해 광범위하게 사용되는 생체 내 DNA 전달 기술이다. 이 절차는 관심있는 DNA의 도입을 허용하기 위해 뇌 심실을 활용하고 심실, 신경 줄기 세포를 안대기 세포로 유전 물질의 입구를 지시하기 위해 전극의 쌍을 사용합니다. 이 방법은 연구원이 원하는 세포를 표지하고/또는 그 세포에 있는 관심있는 유전자의 발현을 조작하는 것을 허용합니다. 그것은 여러 응용 프로그램이, 신경 마이그레이션을 대상으로 하는 애서를 포함 하 여, 혈통 추적, 그리고 축 하 경로 찾는. 이 방법의 중요한 특징은 배아 치사 또는 특정 CRE 드라이버 마우스의 부족과 관련된 잠재적 인 문제의 우회를 허용, 그것의 시간 적 및 지역 제어입니다. 이 기술의 또 다른 관련 측면은 다른 발달 나이에 두뇌의 먼 지역에서 유래하는 세포 모형 사이 상호 작용의 연구 결과에서 특히 중요하게 되는 새로운 마우스 선의 생성을 관련시키는 경제 및 측두적인 한계를 상당히 감소시키는 것을 돕습니다. 여기서우리는 공간적으로 그리고 현세적으로 분리되는 세포 집단의 타겟팅을 가능하게 하는 이중 전기화 전략을 설명합니다. 이 접근법으로 우리는 선택된 형광 단백질을 가진 다른 위치에 있는 세포의 다른 특수형을 그(것)들을 시각화하기 위하여, 및/또는 우리는 적당한 시간에 이 다른 세포에 의해 표현된 관심의 유전자를 조작할 수 있습니다. 이 전략은 자궁 전기화의 잠재력을 향상시키고 가까운 접촉을 확립하기 위해 이동하는 시간적이고 공간적으로 분리 된 세포 집단의 행동과 축축한 예측을 통한 장거리 상호 작용의 행동을 연구하여 시간적 및 경제적 비용을 줄이는 강력한 도구를 제공합니다.

인접한 세포 간의 상호 작용은 탈구 장소와 다른 시간에 유래: 카잘-레치우스 세포 (CR 세포) 및 초기 마이그레이션 피질 프로젝션 뉴런 (전략 A)
CR 세포와 초기 피질 프로젝션 뉴런의 상호 작용은 이전에 이중 전기 기화 전략8을사용하여 nectin 및 cadherin 접착 분자를 통해 소피 전이를 조절하는 데 필요한 것으로 설명되었다. CR 세포는 칼륨의 가장?...

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Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations

자궁 전기기화의 이중은 공간적으로 그리고 일시적으로 분리되는 세포 집단을 표적으로 할 수 있습니다. 이 기술은 정상 조건에서 형광 단백질을 사용하여 그 세포 인구 사이 상호 작용을 구상하는 데 유용하지만 기능적 실험 후 관심의 유전자를 어지니로 조정합니다.

자궁에서 두 배의 자궁 전기화는 시간적으로 그리고 공간적으로 분리된 세포 인구를 표적으로 합니다

In utero electroporation is an in vivo DNA transfer technique extensively used to study the molecular and cellular mechanisms underlying mammalian ...

자궁 에서 이중 전기 화는 다른 위치와 발달 세에서 생성 된 뉴런 세포 사이의 상호 작용과 같은 포유류 코르티코 발생의 중요한 측면을 연구하기위한 강력한 방법입니다. 이 기술의 주요 장점은 빠르고 상세하며 저렴한 방식으로 이러한 다른 세포 집단 간의 흔들리지 않는 상호 작용을 검사하는 기능입니다. 우리의 방법의 한 눈에 띄는 의미는 우리의 배선이 자폐증과 정신 분열증 같이 신경 무질서에서 얼마나 유사한지의 더 나은 이해를 용이하게 한다는 것입니다.이 연구는 신피질에 국한되지 않지만 세포 상호 작용, 세팔륨 또는 소뇌와 같은 외코르티코 부위에 세포를 분석하기 위해 사용될 수도 있다. 가장 어려운 단계 중 하나는 초기 배아의 측면 심실에 DNA를 주입하는 것입니다. 밝은 광원의 사용은 성공적인 주사에 필수적이다.각 수술에 대해 먼저 빠른 녹색 염료 1마이크로리터를 포함하는 10 마이크로리터 용액, 각 플라스미드에 대한 관심의 마이크로리터 플라스미드 DNA 솔루션 당 1마이크로그램, 엔도톡신 프리 TE 버퍼에 적절한 부피를 준비한다. 그리고 적절한 준비 된 DNA 용액으로 유리 미세 모세관 파이펫을 미리로드합니다. 자궁 전공 수술의 첫 번째 경우, 적절하게 적정한 마취 임신 마우스의 눈에 연고를 적용하고 면도기를 사용하여 복부를 면도합니다.복부의 오른쪽에 절개를 진행하기 전에 순차적 70 %에탄올과 요오드 와이프로 노출 된 피부를 두 번 소독하십시오. 자궁이 접근되면 조심스럽게 장기를 추출링 집게를 사용합니다. 구강 제어 흡구관을 사용하여, 전략 A.Or 전략 B의 오른쪽 반구의 측면 심실에 E11.5 배아의 왼쪽 반구의 측면 심실에 약 0.5 마이크로리터의 용액을 주입하여 빠른 녹색 염료가 심실 내부에 보일 때까지.모든 용액이 주입되었을 때, 포셉 타입의 백금 전극을 주입배아의 머리 주위에 측면으로 배치하고, 전략 A를 위한 피질 옷자락을 표적으로 하는 포지티폴을 또는 전략 B를 위한 측면 피질을 지향하여 심장과 태반을 피하기 위해 주의를 기울인다. 제곱파 전기포라이터를 사용하여 각 배아 연령에 적합한 전기 펄스 시퀀스를 적용합니다. 모든 배아가 주입되고 전기화되었을 때, 집게를 사용하여 자궁을 복강에 조심스럽게 돌려시키고 복부를 따뜻한 식염수로 채웁니다.바늘 6-0 봉합사를 사용하여 복벽을 닫고 피부 절개를 조심스럽게 닫습니다. 그런 다음 동물을 완전한 회복까지 모니터링하여 홈 케이지로 돌아갑니다. 초기 수술 이틀 후, 마우스가 정상적인 행동을 나타내는지 확인하고 통증이나 고통의 흔적을 제시하지 않습니다.자궁 전기기에서 두 번째 동물을 준비하기 전에 방금 입증된 바와 같이. 전략 A를 위한 E13.5 배아의 왼쪽 측면 뇌 심실에 원하는 DNA 용액의 0.5 마이크로리터를 주입하고, 전략 B.를 위한 E15.5 배아의 좌측 측측 뇌 심실로 각 주사 후, 전략 A 및 전략 B.및 전략 B.및 전극을 통해 배아를 주입하는 양극을 가진 전극을 배치한다. 전기포이션이 끝나면 자궁을 복강으로 돌려보내 수술 및 수술 후 치료를 완료합니다.전략 A를 구현할 때, 제2 전기기후 4일, 태아의 날 17.5 임신한 암컷 마우스의 자궁을 얼음 위에 PBS의 페트리 접시로 수확한다. 그리고 핀셋을 사용하여 해부 현미경으로 태아를 PBS의 새로운 접시로 옮기. 집게를 사용하여 각 배아의 머리를 조심스럽게 잡고 머리와 두개골 에 피부의 제거를 용이하게합니다.노출 된 뇌를 들어 올리기 위해 집게 또는 주걱을 사용합니다. 그런 다음 숟가락을 사용하여 각 뇌를 48 개의 우물로 옮기면 약 600 마이크로 리터의 고정 용액이 들어 있습니다. 모든 뇌가 수집되었을 때, 궤도 셰이커에서 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 뇌를 고치고 PBS에서 3 10 분 동안 세워합니다.마지막 세척 후, 약 10 분 동안 PBS에서 4 % 낮은 융점 아가로즈에 뇌를 포함. 아가로즈가 고화된 후, 시아노아크라일레이트 접착제를 사용하여 각 뇌를 진동 조직 홀더 후각 전구쪽으로 고정하십시오. 홀더를 진동 용기 안에 넣고 컨테이너를 PBS로 채웁니다.그런 다음 진동과 브러시를 사용하여 100 마이크로미터 두께의 관상 연재 섹션을 얻습니다. 우물 당 7 개의 섹션과 배아 당 6 개의 우물을 옮기는 새로운 48 개의 우물 판에는 신선한 PBS의 웰 당 600 마이크로 리터가 함유 되어 있으며, 항 진균 방부제로 보충됩니다. 모든 단면을 획득하면 각 섹션을 유리 현미경 슬라이드에 장착하고 유리 표지슬립으로 덮어 직립 에피오레시언스 현미경의 전기기공 효능을 평가합니다.전략 B를 구현할 때, 15일 산후일에, 토핀치에 대한 반응의 부족을 확인한 후, 마우스를 supine 위치에 고정하고, 가위를 사용하여 중진 피부 절개를 하여 흉곽과 횡격막을 노출시키고, 다이어프램을 잘라 심장에 접근할 수 있도록 한다. 미세 한 가위를 사용 하 여 오른쪽 아트리움에 절개를 하고, 왼쪽 심실을 관통 하는 연동 관류 펌프에 유연한 튜브에 연결 된 25 게이지 바늘을 사용 하 여. 바늘이 제자리에있을 때, 분당 5.5 밀리리터에서 일정한 플럭스에서, 환원 관류에 의해 4 % 파라 포름알데히드의 적어도 25 밀리리터를 제공합니다.약 5분 후에 관류를 멈추고 가위를 사용하여 머리 위로 피부를 제거합니다. 두개골을 제거하고 주걱을 사용하여 뇌 조직을 제거하십시오. 뇌를 24밀리리터의 신선한 4%파라포름알데히드를 함유한 24개의 웰 플레이트에 넣고, 궤도 셰이커에서 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 잠식합니다.그런 다음 방금 입증 된 대로 산후 뇌의 40 마이크로 미터 섹션을 획득하십시오. 배아 및 산후 뇌 슬라이스 이미징의 경우, 관심의 장착 된 뇌 섹션을 포함하는 슬라이드를 현미경 슬라이드 홀더에 놓습니다. 공초점 현미경에서 슬라이더 홀더를 소개하고 실험에 사용되는 형광에 적합한 채널을 선택합니다.샘플 스캐닝을 수행하여 두 개의 서로 다른 파장에서 각 뇌 섹션의 맵 이미지를 얻어 이중 전기기 출력의 일반적인 뷰를 확인합니다. 완료되면 다중 영역 Z 스택 시간 경과 관찰 모드에서 10배 렌즈를 선택합니다. 각 선택된 XY 영역에서, 적절한 이미징 둘레뿐만 아니라 형광이 보이는 시료의 평면에 따라 Z 축을 따라 스캐닝의 깊이를 설정합니다.선택한 모든 영역의 낮은 배율 이미지를 얻고 현미경 뷰어 소프트웨어에서 OIF에서 TIFF 형식으로 이미지를 내보냅니다. 그런 다음 60x 렌즈를 선택하고 방금 입증된 대로 높은 배율 이미지를 캡처하여 세포 대 세포 상호 작용을 보다 상세한 수준으로 관찰합니다. 자궁 전분 수술에서 이중 간격은 CAG 가태리 날 11.5에 표적으로 한 CAG 토레수세포를 수색성 부위를 포함한 측면 신피질의 한계 영역에 도달할 수 있게 해 주며, 13.5일째배아에 표지된 피질 프로젝션 뉴런과의 접촉을 확립할 수 있다.향상된 GFP를 표현하는 프로젝션 뉴런의 주요 프로세스는 피질의 한계 영역에서 풍부하게 상승하고, 음용 세포를 표현하는 M-체리의 과정과 혼합. 배아 일 13.5에서 자궁 전기 포기에서, 플라스미드를 발현하는 BFP를 사용하여 다른 피질 층을 통해 프로젝션 뉴런의 라벨링을 용이하게한다. 배아일 15.5의 상층 칼약 투영 뉴런을 대상으로 하는 배아일 15.5의 상측에 있는 제2 전기기화는 초기 단계에서 발전하는 하층 프로젝션 뉴런을 대상으로 하지 않는다.상부 층 표적 뉴런은 특징적인 식목 패턴으로 축삭을 반대반구로 확장합니다. 높은 배율은 상반구 내에서 표적 투영 뉴런의 캘러솔 축삭 내시경 의 보다 상세한 시각화를 가능하게 한다. 이 프로토콜을 시도할 때, 표적화될 세포 집단에 따라 전극의 전극의 위치, 주사할 반구, 및 전극의 위치를 계획하는 것이 중요하다.이 절차에 따라 전기 화와 같은 모든 방법이 흥미로운 방법입니다. 두 세포 유형에 대해 생체 내에서 가능한 회로 변경을 연구하기 위해 수행될 수 있다. 이 기술을 사용하여 두 개의 다른 표적 세포 사이의 미세한 상호 작용을 연구 할 수 있습니다.형광 시 냅 스 단백질의 전기 화에 의해 생체 내새로운 과학 정보를 포함.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

마우스 Forebrain에 초음파 유도 Microinjection Utero에서 E9.5에서

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

연구

신경과학

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

사용하여 여러 개의 CNS 준주로 효율적인 유전자 전달 Utero에서 Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

의 배아와 성인 신경 줄기 세포의 확장<em&gt; 자궁에</em&gt; Electroporation 또는 바이러스 성 Stereotaxic 주입

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

몸에 붙이기 형질 전환 쥐의 발생에 의해<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로 및<em&gt; 생체 내</em&gt; 생물 발광 상영

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

마우스의 유전자 조작을 통해 시상 하부 개발<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

코어 텍스, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, 횡 중격 Nucleus-과 줄무늬 별<em&gt; 자궁 내</em&gt; C57BL / 6 마​​우스에서 Electroporation에

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

배열 CGH, 전체 exome 시퀀싱과 설치류에 Utero에서 Electroporation 뇌 기형에 대 한 원인 유전자를 식별 하는 새로운 전략

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...