Name: double in utero electroporation to target temporally and spatially separated cell populations
Uploaded: 2020-06-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations at JoVE.com

Forfatterne takker Cristina Andrés Carbonell og medlemmer av Animal Care-anlegget i Universidad de Valencia for teknisk hjelp. Vi vil også takke Isabel Fariñas og Sacramento R. Ferrón for reagenser og dele utstyret sitt med oss. I.M.W er finansiert av en Garantía Juvenil kontrakt fra Conselleria de Educación de Valencia (GJIDI/2018/A/221), D.dA.D er finansiert av Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). C.Gil-Sanz har en Ramón y Cajal Grant (RYC-2015-19058) fra den spanske ministerenio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN). Dette arbeidet ble finansiert RYC-2015-19058 og SAF2017-82880-R (MICINN).

Prosedyren heri beskrevet har blitt godkjent av den etiske komiteen med ansvar for eksperimentering, dyrevelferd av Universidad de Valencia og Conselleria de Agricultura, Desarrollo Rural, Emergencia Climática y Transición Ecológica fra Comunidad Valenciana, og overholder retningslinjene til International Council for Laboratory Animal Science (ICLAS) gjennomgått i Real Decreto 53/2013 av den spanske lovgivningen, så vel som i direktivet 2010/63/EU i Europaparlamentet og rådet.
MERK: Denn...

<ol>
	<li>Popovitchenko, T., Rasin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+post-transcriptional+mechanisms+of+the+development+of+neocortical+lamination.">Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102 (2017).</li><li>Mukhtar, T., Taylor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untangling+Cortical+Complexity+During+Development.">Untangling Cortical Complexity During Development.</a> Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+Visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li><li>Shimogori, T., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+application+with+in+utero+electroporation+in+mouse+embryonic+brain.">Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 50, 499-506 (2008).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+embryonic+mouse+central+nervous+system+cells+by+in+utero+electroporation.">Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 50, 507-511 (2008).</li><li>Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., M&#252;ller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reelin+Regulates+Cadherin+Function+via+Dab1/Rap1+to+Control+Neuronal+Migration+and+Lamination+in+the+Neocortex.">Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex.</a> Neuron. 69, 482-497 (2011).</li><li>Gil-Sanz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal-Retzius+cells+instruct+neuronal+migration+by+coincidence+signaling+between+secreted+and+contact-dependent+guidance+cues.">Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues.</a> Neuron. 79, 461-477 (2013).</li><li>Martinez-Garay, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin+2/4+signaling+via+PTP1B+and+catenins+is+crucial+for+nucleokinesis+during+radial+neuronal+migration+in+the+neocortex.">Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex.</a> Development. 143, 2121-2134 (2016).</li><li>Popovitchenko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+binding+protein+HuR+determines+the+differential+translation+of+autism-associated+FoxP+subfamily+members+in+the+developing+neocortex.">The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Bultje, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Par3+Regulates+Progenitor+Cell+Asymmetric+Division+via+Notch+Signaling+in+the+Developing+Neocortex.">Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex.</a> Neuron. 63, 189-202 (2009).</li><li>Rodr&#237;guez-Tornos, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cux1+Enables+Interhemispheric+Connections+of+Layer+II/III+Neurons+by+Regulating+Kv1-Dependent+Firing.">Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing.</a> Neuron. 89, 494-506 (2016).</li><li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation.">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).</li><li>Mire, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+activity+regulates+Robo1+transcription+to+mediate+a+switch+in+thalamocortical+axon+growth.">Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth.</a> Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).</li><li>Kawauchi, D., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+cascade+from+Math1+to+Mbh1+and+Mbh2+is+required+for+cerebellar+granule+cell+differentiation.">Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation.</a> Developmental Biology. 322, 345-354 (2008).</li><li>Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+electroporation+approaches+to+study+the+excitability+of+neuronal+subpopulations+and+single-cell+connectivity.">In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity.</a> Journal of Visualized Experiments. 120, e55139 (2017).</li><li>Bielle, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+origins+of+Cajal-Retzius+cells+at+the+borders+of+the+developing+pallium.">Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium.</a> Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).</li><li>Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+p73+and+Reelin+in+the+Developing+Human+Cortex.">Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex.</a> Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).</li><li>Takiguchi-Hayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Reelin-Positive+Marginal+Zone+Cells+from+the+Caudomedial+Wall+of+Telencephalic+Vesicles.">Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles.</a> Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).</li><li>Berry, M., Rogers, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migration+of+neuroblasts+in+the+developing+cerebral+cortex.">The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex.</a> Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).</li><li>Alc&#225;ntara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+and+cellular+patterns+of+reelin+mRNA+expression+in+the+forebrain+of+the+developing+and+adult+mouse.">Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse.</a> Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).</li><li>Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+loss+of+Cajal-Retzius+cells+does+not+disrupt+neocortical+layer+order.">Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order.</a> Development. 133, 537-545 (2006).</li><li>Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+radial+migration+in+early+development+of+the+cerebral+cortex.">Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex.</a> Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).</li><li>Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development,+specification,+and+diversity+of+callosal+projection+neurons.">Development, specification, and diversity of callosal projection neurons.</a> Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).</li><li>Thomson, A. M., Bannister, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaminar+Connections+in+the+Neocortex.">Interlaminar Connections in the Neocortex.</a> Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).</li><li>Zarrinpar, A., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+connections+to+specific+types+of+layer+6+neurons+in+the+rat+visual+cortex.">Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).</li><li>Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+Transcallosal+Projections+Are+Present+throughout+the+Mouse+Cortex.">Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36 (2017).</li><li>DeFelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+the+brain,+the+human+nature+of+cortical+circuits,+and+intellectual+creativity.">The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29 (2011).</li><li>Velmeshev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genomics+identifies+cell+type&#8211;specific+molecular+changes+in+autism.">Single-cell genomics identifies cell type&#8211;specific molecular changes in autism.</a> Science. 364, 685-689 (2019).</li></ol>

Studien av celle-celle interaksjoner in vivo i regioner med høy cellulær tetthet som hjernebarken er en kompleks oppgave. Tradisjonelle tilnærminger inkludert bruk av antistoffer for å merke neurites er ikke egnet på grunn av mangel på spesifikke markører for ulike cellepopulasjoner. Bruken av transgene murinmodeller, hvor en bestemt celletype uttrykker et fluorescerende protein, er nyttig for å visualisere nevronale prosesser, men dette avhenger av tilgjengeligheten av slike modeller. Denne oppgaven er enda mer ...

Hjernebarken er en svært kompleks og intrikat organisert struktur. For å oppnå en slik grad av organisering, går kortikale projeksjonsnevroner gjennom komplekse utviklingsprosesser som krever deres timelige generasjon, migrasjon til deres endelige destinasjon i kortikal plate, og etablering av kort- og langdistanseforbindelser1,2. I lang tid var den klassiske måten å studere kortikogenese basert på bruk av knockout eller knock-in murine modeller av gener av interesse. Imidlertid er denne strategien, og spesielt bruken av betingede knockoutmus, tidkrevende og dyrt, og noen ganger presenterer ytterligere problemer med eksistensen av genetisk redundans eller mangel på spesifikke CRE-drivere, blant andre problemer. En av tilnærmingene som oppsto for å prøve å løse disse problemene, og det er i dag mye brukt til å studere kortikal utvikling er i utero elektroporasjon3,4. In utero elektroporasjon er en teknikk som brukes til somatisk transgenese, slik at in vivo målretting av nevrale stamceller og deres avkom. Denne metoden kan brukes til å merke celler ved uttrykk for fluorescerende proteiner5,6, for genmanipulering in vivo (dvs. gevinst eller tap av funksjonsanalyser)7,8,9, for å isolere elektroporerte kortikater in vitro og kulterende celler8,10. Videre, i utero elektroporasjon tillater timelig og regional kontroll av det målrettede området. Denne teknikken har mange applikasjoner og har vært mye brukt til å studere nevronal migrasjon, stamcelledeling, nevronal tilkobling og andre8,,9,,11,,12.
Det nåværende manuskriptet beskriver bruken av en in utero elektroporasjonsvariant, kalt dobbel i utero elektroporasjon, for å analysere samspillet mellom celler i hjernebarken med forskjellig temporal og romlig opprinnelse. Disse studiene er svært komplekse å fullføre når de ansetter murine modeller fordi de krever kombinert bruk av flere transgene linjer. Noen av anvendelsene av protokollen som er beskrevet i dette papiret inkluderer studiet av nære interaksjoner mellom nærliggende celler, samt interaksjoner mellom fjerne celler gjennom langtrekkende projeksjoner. Metoden krever å utføre to uavhengige i utero elektroporasjon operasjoner, separert timelig og romlig, på de samme embryoene for å målrette ulike cellepopulasjoner av interesse. Fordelen med denne tilnærmingen er muligheten for å manipulere genfunksjonen i en eller begge typer nevroner ved hjelp av villtype dyr. I tillegg kan disse funksjonelle eksperimentene kombineres med uttrykket av cytoplasmatiske eller membran-merkede fluorescerende proteiner for å visualisere den fine morfologien til målrettede celler, inkludert dendritter og aksoner, og analysere mulige forskjeller i cellulære interaksjoner sammenlignet med en kontroll (dvs. celler bare merket med fluorescerende protein).
Protokollen avgrenset her er fokusert på studiet av cellulære interaksjoner inne i neocortex, men denne strategien kan også brukes til å undersøke interaksjoner med ekstrakortikale områder som kan målrettes ved hjelp av i utero elektroporasjon, som subpallium eller thalamus13,14, eller celle-celle interaksjoner i andre strukturer, som cerebellum15. Målretting av ulike områder er basert på elektrodenes orientering og på ventrikkelen der DNA injiseres (lateral, tredje eller fjerde). Med strategien som er beskrevet her, kan vi merke et betydelig antall celler, noe som er nyttig for å evaluere generelle endringer i tilkobling / innervering i funksjonelle eksperimenter. Likevel, for å studere fine endringer i tilkobling, kan man bruke modifiserte versjoner av in utero elektroporasjon for å få sparser merking og identifisere enkeltceller16. Oppsummert er dobbel i utero elektroporasjon en allsidig metode som gjør det mulig å målrette timelig og romlig separerte cellepopulasjoner og studere deres interaksjoner i detalj, enten i kontrollforhold eller kombinert med funksjonelle eksperimenter, noe som reduserer temporale og økonomiske kostnader betydelig.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baby-mixter hemostat (perfusion)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B100-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml)</td>
			<td>Rb Pharmaceuticals Limited</td>
			<td>921425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAG-BFP plasmid</td>
			<td>Kindly provided by U.M&#252;ller Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAG-EGFP plasmid</td>
			<td>Kindly provided by U.M&#252;ller Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAG-mCherry plasmid</td>
			<td>Kindly provided by U.M&#252;ller Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid</td>
			<td>Kindly provided by U.M&#252;ller Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV10i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swabs</td>
			<td>BFHCVDF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>B. Braun Surgical</td>
			<td>1050044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>stemi 305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5 Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM830 Square Wave Electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric Razor</td>
			<td>Oster</td>
			<td>76998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endotoxin-free TE buffer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>1018499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol wipes</td>
			<td>BFHCVDF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>682542.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>14069-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence LEDs</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>pE-300-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genopure Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3143422001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsted-Mosquito Hemostats (suture)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>91308-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>UFESA</td>
			<td>AL5514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE2000-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine wipes</td>
			<td>Lorsoul</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane vaporizer</td>
			<td>Flow-Meter</td>
			<td>A15B5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Karizoo</td>
			<td>586259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Anastemine)</td>
			<td>Fatro Ib&#233;rica SL</td>
			<td>583889-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech precision wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Lennox) Agar GEN</td>
			<td>Labkem</td>
			<td>AGLB-00P-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Lennox) broth GEN</td>
			<td>Labkem</td>
			<td>LBBR-00P-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melting point agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP165-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine (Sedator)</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>573749.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslips</td>
			<td>Menel-Gl&#228;ser</td>
			<td>15747592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>SLIB-F10-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutiwell plates (24)</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>32024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutiwell plates (48)</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>32048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (for saline solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10112640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 25 G (BD Microlance 3)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>300600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital incubator S150</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td>5133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P Selecta Incubator</td>
			<td>J. P. Selecta, s.a.</td>
			<td>0485472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>PanReac AppliedChem</td>
			<td>A3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic perfusion pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07522-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter</td>
			<td>Btx</td>
			<td>45-0489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex Skin Closure System - 7mm Clips, box of 100</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>203-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex Skin Closure System - Clip Applyer, 7mm</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>204-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11103-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>PanReac AppliedChem</td>
			<td>122712-1608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical absorbent pad (steryle)</td>
			<td>HK Surgical</td>
			<td>PD-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (Surgicryl PGA 6-0)</td>
			<td>SMI Suture Materials</td>
			<td>BYD11071512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1ml (BD plastipak)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 100 x 20 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ni</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double in utero electroporation to target temporally and spatially separated cell populations

In utero elektroporasjon er en in vivo DNA-overføringsteknikk som brukes mye til å studere molekylære og cellulære mekanismer underliggende pattedyrkortikogenese. Denne prosedyren utnytter hjernen ventriklene for å tillate innføring av DNA av interesse og bruker et par elektroder for å lede inngangen til det genetiske materialet inn i cellene som fôrer ventrikkelen, nevrale stamceller. Denne metoden gjør det mulig for forskere å merke de ønskede cellene og / eller manipulere uttrykket av gener av interesse for disse cellene. Den har flere applikasjoner, inkludert analyser rettet mot nevronal migrasjon, avstamning sporing, og axonal pathfinding. Et viktig trekk ved denne metoden er dens timelige og regionale kontroll, slik at omgåelse av potensielle problemer knyttet til embryonisk dødelighet eller mangel på spesifikke CRE drivermus. Et annet relevant aspekt ved denne teknikken er at det bidrar til å redusere de økonomiske og timelige begrensningene som involverer generering av nye muselinjer, som blir spesielt viktig i studiet av interaksjoner mellom celletyper som stammer fra fjerne områder av hjernen i ulike utviklingsaltider. Her beskriver vi en dobbel elektroporasjonsstrategi som muliggjør målretting av cellepopulasjoner som er romlig og timelig separert. Med denne tilnærmingen kan vi merke forskjellige undertyper av celler på forskjellige steder med utvalgte fluorescerende proteiner for å visualisere dem, og / eller vi kan manipulere gener av interesse uttrykt av disse forskjellige cellene til de aktuelle tidspunktene. Denne strategien forbedrer potensialet i in utero elektroporasjon og gir et kraftig verktøy for å studere oppførselen til timelig og romlig separerte cellepopulasjoner som migrerer for å etablere nære kontakter, samt langsiktige interaksjoner gjennom axonale anslag, noe som reduserer temporale og økonomiske kostnader.

Interaksjoner mellom nærliggende celler oppsto på distale steder og til forskjellige tider: Cajal-Retzius celler (CR-celler) og tidlig migrere kortikale projeksjon nevroner (strategi A)
Samspillet mellom CR-celler og tidlige kortikale projeksjonsnevroner ble tidligere beskrevet som nødvendig for å regulere somal translokasjon via nectin og kadherin adhesjonsmolekyler ved hjelp av en dobbel elektroporasjonsstrategi8. CR-celler stammer fra neuroepithe...

Watch this Scientific Journal Video about Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations at JoVE.com

Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations

Dobbel i utero elektroporasjon gjør det mulig å målrette cellepopulasjoner som er romlig og timelig separert. Denne teknikken er nyttig for å visualisere interaksjoner mellom disse cellepopulasjonene ved hjelp av fluorescerende proteiner under normale forhold, men også etter funksjonelle eksperimenter for å perturb gener av interesse.

Dobbel i Utero elektroporasjon til mål timelig og romlig separerte cellepopulasjoner

In utero electroporation is an in vivo DNA transfer technique extensively used to study the molecular and cellular mechanisms underlying mammalian ...

Dobbel i utero elektroporasjon er en kraftig metode for å studere de viktige aspektene ved pattedyrkortikogenese som samspillet mellom nevronceller, generert på forskjellige steder og utviklingstider. Den største fordelen med denne teknikken er evnen til å undersøke ugjennomtrengelige interaksjoner mellom disse forskjellige cellepopulasjonene på en rask, detaljert og billig måte. En slående implikasjon av vår metode er at det letter en bedre forståelse av hvordan lignende våre ledninger endres i nevronale lidelser som autisme og schizofreni.Denne studien er ikke begrenset til neocortex, men det kan også brukes til å analysere celle til celleinteraksjoner, i eksocortico områder som sepalium eller lillehjernen. Et av de mest utfordrende trinnene er injeksjon av DNA i laterale ventrikler av tidlige embryoer. Bruken av en lyskilde er avgjørende for vellykkede injeksjoner.For hver operasjon først forberede en 10 mikroliter løsning som inneholder en mikroliter av rask grønn fargestoff, en ett mikrogram per mikroliter plasmid DNA-løsning av interesse for hver plasmid, og riktig volum på Endotoxin gratis TE buffer. Og forhåndslast en mikrokapillær pipette i glass med riktig tilberedt DNA-løsning. For den første in utero elektroporasjon kirurgi, påfør salve på øynene til en passende tidsstyrt bedøvet gravid mus, og bruk en barberhøvel til å barbere magen.Desinfiser den eksponerte huden to ganger med sekvensiell 70% etanol og jodservietter før du fortsetter med snittet på høyre side av magen. Når livmoren er tilgjengelig, bruk ring tang for å forsiktig trekke ut orgelet. Bruk et munnkontrollert aspiratorrør, injiser ca. 0,5 mikroliter oppløsning i side ventrikkelen på venstre halvkule av E11,5 embryoer for strategi A.Or inn i sideåpningen på høyre halvkule av E13.5 embryoer for strategi B, til det raske grønne fargestoffet er synlig inne i ventrikkelen.Når all løsningen er injisert, plasser tang type platinaelektroder sidealt rundt hodet på de injiserte embryoene, med den positive polen orientert mot medialveggen for å målrette den kortikale kanten for strategi A, eller orientert mot lateral cortex for strategi B, og ta vare på å unngå hjerte og morkake. Bruk en firkantet bølge elektroporater for å bruke riktig sekvens av elektriske pulser for hver embryonale alder, som angitt i tabellen. Når alle embryoene er injisert og elektroporert, bruk tang til å returnere livmoren forsiktig til bukhulen, og fyll magen med varm saltvann.Bruk en nål 6-0 sutur, lukk bukveggen, og lukk forsiktig hud snittet. Deretter returnerer du dyret til sitt hjem bur med overvåking til full gjenoppretting. To dager etter den første operasjonen, bekrefter at musen viser normal oppførsel, og presenterer ingen tegn på smerte eller nød.Før du forbereder dyret for den andre in utero elektroporasjon som nettopp demonstrert. Injiser 0,5 mikroliter av ønsket DNA-løsning i venstre lateral hjerneventrikkel av E13,5 embryoer for strategi A, og inn i venstre lateral hjerne ventrikkel av E15.5 embryoer for strategi B.Etter hver injeksjon, plasser elektrodene med den positive polen orientert mot lateral cortex av den injiserte halvkule for strategi A og strategi B.Og elektroporat embryoer som angitt i tabellen. Når elektroporasjonen er ferdig, returner livmoren til bukhulen, og fullfør operasjonen og postkirurgisk behandling som demonstrert.Ved implementering av strategi A, fire dager etter den andre elektroporasjonen, høst livmoren av den embryonale dagen 17,5 gravid kvinnelig mus inn i en petriskål med PBS på is. Og bruk pinsett til å overføre embryoene til en ny tallerken med PBS under et dissekerende mikroskop. Bruk tang, ta forsiktig tak i hodet på hvert embryo for å lette fjerning av huden over hodet og skallen.Bruk tang eller en slikkepott for å løfte ut de eksponerte hjernene. Bruk deretter skje til å overføre hver hjerne til individuelle brønner av en 48 brønnplate som inneholder rundt 600 mikroliter fikseringsmiddelløsning per brønn. Når alle hjernene er samlet, fikse hjernen ved fire grader Celsius over natten på en orbital shaker, etterfulgt av tre ti minutters vasker i PBS.Etter den siste vasken, bygg inn hjernen i 4% lavt smeltepunkt oppsto i PBS i ca ti minutter. Etter at agarose har størknet, bruk cyanoacrylate lim for å sikre hver hjerne til en vibratom vev holder olfactory pære side opp. Plasser holderen inne i vibratombeholderen, og fyll beholderen med PBS.Bruk deretter vibratom og en børste for å oppnå 100 mikrometer tykke koronale serielle seksjoner. Overføring av opptil syv seksjoner per brønn og seks brønner per embryo, i en ny 48 brønnplate som inneholder 600 mikroliter per brønn med fersk PBS, supplert med anti-soppkonserveringsmidler som de samles inn. Når alle seksjonene er anskaffet, bruk en fin børste til å montere hver seksjon på et glassmikroskopsklie, og dekk dem med et glassdeksler for vurdering av elektroporasjonseffekten på et oppreist epifluorescencemikroskop.Ved implementering av strategi B, på postnatal dag 15, etter å ha bekreftet mangel på respons på topinch, fest musen i liggende stilling, og bruk saks for å gjøre et midtlinjet hud snitt for å avsløre brystkassen og membranen, og kutt membranen for å få tilgang til hjertet. Ved hjelp av fin saks, gjør et snitt i høyre atrium, og bruk en 25 gage nål koblet til et fleksibelt rør til en peristaltisk perfusjonspumpe for å trenge inn i venstre ventrikkel. Når nålen er på plass, lever minst 25 milliliter med 4% paraformaldehyd ved transcardial perfusjon, ved en konstant fluks ved 5,5 milliliter per minutt.Etter ca fem minutter, stopp perfusjonen, og bruk saks for å fjerne huden over hodet. Fjern skallen, og bruk en slikkepott for å fjerne hjernevevet. Plasser hjernen i en brønn av en 24 brønnplate som inneholder 1,5 milliliter fersk 4% paraformaldehyd, for en overnattingsinkubasjon ved fire grader Celsius på en orbital shaker.Deretter skaffe 40 mikrometer deler av postnatal hjerner som nettopp demonstrert. For embryonal og postnatal hjerneskiveavbildning, plasser lysbildene som inneholder de monterte hjernedelene av interesse på en mikroskopgliderholder. Introdder glidebryterholderen i det konokale mikroskopet, og velg riktig kanal for fluoroforene som brukes i eksperimentet.Utfør prøveskanning for å få kartbilder av hver hjerneseksjon ved to forskjellige bølgelengder for en generell visning av den doble elektroporasjonsutgangen. Når du er ferdig, velger du 10x-objektivet i flerområdes Z-stabeltidsforløp observasjonsmodus. I hvert av de utvalgte XY-områdene angir du de riktige bildeomkretsene samt dybden av skanningen langs Z-aksen i henhold til prøveplanene, der fluorescensen er synlig.Få lave forstørrelsesbilder av alle de valgte regionene, og eksporter bildene fra OIF til TIFF-format i mikroskopviserprogramvaren. Velg deretter 60x-objektivet, og ta bilder med høy forstørrelse som nettopp demonstrert, for å observere celle-til-celle-interaksjonene på et mer detaljert nivå. Det timelige gapet mellom det doble i uteroelektroporasjonsoperasjonene gjør det mulig for CAG-toresialceller rettet mot embryonale dag 11,5 på et av opprinnelsesstedene for å nå den marginale sonen til lateral neocortex, inkludert somatosensorisk område, i tide for å etablere kontakter med kortikale projeksjonsnevroner, merket på embryonal dag 13.5.De ledende prosessene med projeksjonsnevroner som uttrykker forbedret GFP, oppsår seg voldsomt i cortexens marginale sone, og interminerer med prosessene til M-kirsebær som uttrykker kataretzialceller. In utero elektroporasjon på embryonal dag 13.5, ved hjelp av en BFP uttrykker plasmid letter merking av projeksjon nevroner på tvers av ulike kortikale lag. En annen elektroporasjon i den kontralaterale siden av embryonal dag 15,5 retter seg mot det øvre laget kallosal projeksjon nevroner underbefolkning, men ikke lavere lag projeksjon nevroner som utvikler seg i tidligere stadier.Øvre lag målrettede nevroner utvide sine aksoner til den kontralaterale halvkule, med den karakteristiske arborisering mønster. Høy forstørrelse gir en mer detaljert visualisering av kallosal axon innervering av målrettede projeksjon nevroner innenfor den kontralaterale halvkule. Når du prøver denne protokollen, er det viktig å planlegge elektroporasjon timing, halvkule å injisere, og plasseringen av elektrodene i henhold til cellepopulasjonene som skal målrettes.Etter denne prosedyren er alle metodene, for eksempel elektroporasjon den interessante. For begge celletyper kan utføres for å studere mulige kretsendringer in vivo. Ved hjelp av denne teknikken er det mulig å studere fine interaksjoner mellom to forskjellige målrettede celler.Inkludert ny vitenskapsinformasjon in vivo, ved elektroporasjon av fluorescerende synaptiske proteiner.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Utvidelse av embryonale og voksne nevrale stamceller ved<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation eller Viral stereotaksiske Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisering og genetisk manipulering av dendritter og pigger i Mus hjernebarken og hippocampus hjelp<em&gt; I fosterlivet</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generering av Topically Transgene Rats etter<em&gt; I utero</em&gt; Electroporation og<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminesens Screening

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetisk manipulering av musen Utvikling Hypothalamus gjennom<em&gt; I utero</em&gt; Electroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- og striatum spesifikke<em&gt; I Utero</em&gt; Electroporation i C57BL / 6 mus

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

En ny strategi kombinerer matrise-CGH, hel-exome sekvensering og In Utero Electroporation i Red for å identifisere forårsaker gener for hjerne misdannelser