Name: double in utero electroporation to target temporally and spatially separated cell populations
Uploaded: 2020-06-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations at JoVE.com

Os autores agradecem a Cristina Andrés Carbonell e aos membros da unidade de Cuidados com Animais da Universidad de Valência pela assistência técnica. Também queremos agradecer a Isabel Fariñas e Sacramento R. Ferrón pelos reagentes e pelo compartilhamento de seus equipamentos conosco. A I.M.W é financiada por um contrato da Garantía Juvenil da Conselleria de Educación de Valencia (GJIDI/2018/A/221), a D.d.D é financiada pelo Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). C.Gil-Sanz detém um Ramón y Cajal Grant (RYC-2015-19058) do Ministério espanhol de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN). Este Trabalho foi financiado RYC-2015-19058 e SAF2017-82880-R (MICINN).

O procedimento aqui descrito foi aprovado pelo comitê de ética responsável pela experimentação, pelo bem-estar animal da Universidad de Valência e da Conselleria de Agricultura, Desarrollo Rural, Emergencia Climática y Transición Ecológica da Comunidad Valenciana, e adere às diretrizes do Conselho Internacional de Ciência Animal Laboratorial (ICLAS) revisado no Real Decreto 53/2013 da legislação espanhola, bem como na Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu e do Conselho.
NOTA: ...

<ol>
	<li>Popovitchenko, T., Rasin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+post-transcriptional+mechanisms+of+the+development+of+neocortical+lamination.">Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102 (2017).</li><li>Mukhtar, T., Taylor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untangling+Cortical+Complexity+During+Development.">Untangling Cortical Complexity During Development.</a> Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+Visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li><li>Shimogori, T., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+application+with+in+utero+electroporation+in+mouse+embryonic+brain.">Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 50, 499-506 (2008).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+embryonic+mouse+central+nervous+system+cells+by+in+utero+electroporation.">Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 50, 507-511 (2008).</li><li>Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., M&#252;ller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reelin+Regulates+Cadherin+Function+via+Dab1/Rap1+to+Control+Neuronal+Migration+and+Lamination+in+the+Neocortex.">Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex.</a> Neuron. 69, 482-497 (2011).</li><li>Gil-Sanz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal-Retzius+cells+instruct+neuronal+migration+by+coincidence+signaling+between+secreted+and+contact-dependent+guidance+cues.">Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues.</a> Neuron. 79, 461-477 (2013).</li><li>Martinez-Garay, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin+2/4+signaling+via+PTP1B+and+catenins+is+crucial+for+nucleokinesis+during+radial+neuronal+migration+in+the+neocortex.">Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex.</a> Development. 143, 2121-2134 (2016).</li><li>Popovitchenko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+binding+protein+HuR+determines+the+differential+translation+of+autism-associated+FoxP+subfamily+members+in+the+developing+neocortex.">The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Bultje, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Par3+Regulates+Progenitor+Cell+Asymmetric+Division+via+Notch+Signaling+in+the+Developing+Neocortex.">Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex.</a> Neuron. 63, 189-202 (2009).</li><li>Rodr&#237;guez-Tornos, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cux1+Enables+Interhemispheric+Connections+of+Layer+II/III+Neurons+by+Regulating+Kv1-Dependent+Firing.">Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing.</a> Neuron. 89, 494-506 (2016).</li><li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation.">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).</li><li>Mire, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+activity+regulates+Robo1+transcription+to+mediate+a+switch+in+thalamocortical+axon+growth.">Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth.</a> Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).</li><li>Kawauchi, D., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+cascade+from+Math1+to+Mbh1+and+Mbh2+is+required+for+cerebellar+granule+cell+differentiation.">Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation.</a> Developmental Biology. 322, 345-354 (2008).</li><li>Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+electroporation+approaches+to+study+the+excitability+of+neuronal+subpopulations+and+single-cell+connectivity.">In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity.</a> Journal of Visualized Experiments. 120, e55139 (2017).</li><li>Bielle, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+origins+of+Cajal-Retzius+cells+at+the+borders+of+the+developing+pallium.">Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium.</a> Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).</li><li>Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+p73+and+Reelin+in+the+Developing+Human+Cortex.">Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex.</a> Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).</li><li>Takiguchi-Hayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Reelin-Positive+Marginal+Zone+Cells+from+the+Caudomedial+Wall+of+Telencephalic+Vesicles.">Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles.</a> Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).</li><li>Berry, M., Rogers, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migration+of+neuroblasts+in+the+developing+cerebral+cortex.">The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex.</a> Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).</li><li>Alc&#225;ntara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+and+cellular+patterns+of+reelin+mRNA+expression+in+the+forebrain+of+the+developing+and+adult+mouse.">Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse.</a> Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).</li><li>Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+loss+of+Cajal-Retzius+cells+does+not+disrupt+neocortical+layer+order.">Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order.</a> Development. 133, 537-545 (2006).</li><li>Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+radial+migration+in+early+development+of+the+cerebral+cortex.">Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex.</a> Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).</li><li>Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development,+specification,+and+diversity+of+callosal+projection+neurons.">Development, specification, and diversity of callosal projection neurons.</a> Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).</li><li>Thomson, A. M., Bannister, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaminar+Connections+in+the+Neocortex.">Interlaminar Connections in the Neocortex.</a> Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).</li><li>Zarrinpar, A., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+connections+to+specific+types+of+layer+6+neurons+in+the+rat+visual+cortex.">Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).</li><li>Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+Transcallosal+Projections+Are+Present+throughout+the+Mouse+Cortex.">Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36 (2017).</li><li>DeFelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+the+brain,+the+human+nature+of+cortical+circuits,+and+intellectual+creativity.">The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29 (2011).</li><li>Velmeshev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genomics+identifies+cell+type&#8211;specific+molecular+changes+in+autism.">Single-cell genomics identifies cell type&#8211;specific molecular changes in autism.</a> Science. 364, 685-689 (2019).</li></ol>

O estudo das interações célula-células in vivo em regiões com alta densidade celular como o córtex cerebral é uma tarefa complexa. Abordagens tradicionais, incluindo o uso de anticorpos para rotular neurites, não são adequadas devido à falta de marcadores específicos para diferentes populações celulares. O uso de modelos transgênicos de murina, onde um determinado tipo de célula expressa uma proteína fluorescente, é útil para visualizar os processos neuronais, mas isso depende da disponibilidade de tais...

O córtex cerebral é uma estrutura muito complexa e intrincadamente organizada. Para alcançar tal grau de organização, os neurônios de projeção cortical passam por processos complexos de desenvolvimento que requerem sua geração temporal, migração para seu destino final na placa cortical e o estabelecimento de conexões de curto e longo alcance1,,2. Por muito tempo, a maneira clássica de estudar corticogênese foi baseada no uso de modelos murinos de nocaute ou knock-in de genes de interesse. No entanto, essa estratégia, e particularmente o uso de camundongos eliminatórios condicionais, é demorada e cara, e às vezes apresenta problemas adicionais quanto à existência de redundância genética ou à falta de drivers específicos de CRE, entre outras questões. Uma das abordagens que surgiram para tentar resolver esses problemas e que hoje é amplamente utilizada para estudar o desenvolvimento cortical está na eletroporaçãoutero 3,4. No útero a eletroporação é uma técnica usada para transgênese somática, permitindo o direcionamento in vivo de células-tronco neurais e sua prole. Este método pode ser usado para rotular células pela expressão de proteínas fluorescentes5,6, para manipulação genética in vivo (ou seja, ganho ou perda de ensaios de função)7,8,9, para isolar cortices eletroporados in vitro e cultura de células8,,10. Além disso, no útero a eletroporação permite o controle temporal e regional da área alvo. Esta técnica possui inúmeras aplicações e tem sido amplamente utilizada para estudar migração neuronal, divisão de células-tronco, conectividade neuronal e outros sujeitos8,,9,,11,12.
O manuscrito atual descreve o uso de uma variante de eletroporação uteral, denominada dupla em eletroporação uteral, para analisar as interações das células no córtex cerebral com diferentes origens temporais e espaciais. Esses estudos são extremamente complexos de serem concluídos ao empregar modelos murinos porque requerem o uso combinado de várias linhas transgênicas. Algumas das aplicações do protocolo descrito neste artigo incluem o estudo de interações próximas entre células vizinhas, bem como interações entre células distantes através de projeções de longo alcance. O método requer a realização de duas cirurgias de eletroporação uteral, separadas temporal e espacialmente, nos mesmos embriões para atingir diferentes populações celulares de interesse. A vantagem dessa abordagem é a possibilidade de manipular a função genética em um ou ambos os tipos de neurônios usando animais do tipo selvagem. Além disso, esses experimentos funcionais podem ser combinados com a expressão de proteínas fluorescentes citoplasmáticas ou marcadas por membrana para visualizar a morfologia fina das células-alvo, incluindo dendritos e axônios, e analisar possíveis diferenças nas interações celulares em comparação com um controle (ou seja, células apenas rotuladas com a proteína fluorescente).
O protocolo delineado aqui é focado no estudo das interações celulares dentro do neocórtex, mas essa estratégia também poderia ser usada para examinar interações com áreas extracorticais que podem ser direcionadas usando na eletroporação utero, como o subpallium ou o tálamo13,14, ou interações célula-células em outras estruturas, como o cerebelo15. O direcionamento de diferentes áreas baseia-se na orientação dos eletrodos e no ventrículo onde o DNA é injetado (lateral, terceiro ou quarto). Com a estratégia descrita aqui, podemos rotular um número substancial de células, o que é útil para avaliar mudanças gerais na conectividade/inervação em experimentos funcionais. No entanto, para estudar mudanças finas na conectividade, pode-se usar versões modificadas de eletroporação uteróptero para obter rotulagem mais esparsa e identificar células únicas16. Em resumo, o dobro da eletroporação uteral é um método versátil que permite direcionar populações celulares temporais e espacialmente separadas e estudar suas interações em detalhes, seja em condições de controle ou combinadas com experimentos funcionais, reduzindo consideravelmente os custos temporais e econômicos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baby-mixter hemostat (perfusion)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B100-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml)</td>
			<td>Rb Pharmaceuticals Limited</td>
			<td>921425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAG-BFP plasmid</td>
			<td>Kindly provided by U.M&#252;ller Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAG-EGFP plasmid</td>
			<td>Kindly provided by U.M&#252;ller Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAG-mCherry plasmid</td>
			<td>Kindly provided by U.M&#252;ller Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid</td>
			<td>Kindly provided by U.M&#252;ller Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV10i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swabs</td>
			<td>BFHCVDF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>B. Braun Surgical</td>
			<td>1050044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>stemi 305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5 Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM830 Square Wave Electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric Razor</td>
			<td>Oster</td>
			<td>76998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endotoxin-free TE buffer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>1018499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol wipes</td>
			<td>BFHCVDF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>682542.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>14069-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence LEDs</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>pE-300-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genopure Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3143422001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsted-Mosquito Hemostats (suture)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>91308-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>UFESA</td>
			<td>AL5514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE2000-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine wipes</td>
			<td>Lorsoul</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane vaporizer</td>
			<td>Flow-Meter</td>
			<td>A15B5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Karizoo</td>
			<td>586259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Anastemine)</td>
			<td>Fatro Ib&#233;rica SL</td>
			<td>583889-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech precision wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Lennox) Agar GEN</td>
			<td>Labkem</td>
			<td>AGLB-00P-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Lennox) broth GEN</td>
			<td>Labkem</td>
			<td>LBBR-00P-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melting point agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP165-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine (Sedator)</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>573749.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslips</td>
			<td>Menel-Gl&#228;ser</td>
			<td>15747592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>SLIB-F10-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutiwell plates (24)</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>32024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutiwell plates (48)</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>32048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (for saline solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10112640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 25 G (BD Microlance 3)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>300600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital incubator S150</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td>5133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P Selecta Incubator</td>
			<td>J. P. Selecta, s.a.</td>
			<td>0485472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>PanReac AppliedChem</td>
			<td>A3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic perfusion pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07522-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter</td>
			<td>Btx</td>
			<td>45-0489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex Skin Closure System - 7mm Clips, box of 100</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>203-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex Skin Closure System - Clip Applyer, 7mm</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>204-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11103-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>PanReac AppliedChem</td>
			<td>122712-1608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical absorbent pad (steryle)</td>
			<td>HK Surgical</td>
			<td>PD-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (Surgicryl PGA 6-0)</td>
			<td>SMI Suture Materials</td>
			<td>BYD11071512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1ml (BD plastipak)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 100 x 20 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ni</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double in utero electroporation to target temporally and spatially separated cell populations

No útero a eletroporação é uma técnica de transferência de DNA in vivo amplamente usada para estudar os mecanismos moleculares e celulares subjacentes à corticogênese dos mamíferos. Este procedimento aproveita os ventrículos cerebrais para permitir a introdução do DNA de interesse e usa um par de eletrodos para direcionar a entrada do material genético para as células que revestem o ventrículo, as células-tronco neurais. Este método permite que os pesquisadores rotulem as células desejadas e/ou manipulem a expressão de genes de interesse nessas células. Possui várias aplicações, incluindo ensaios direcionados à migração neuronal, rastreamento de linhagem e localização axonal. Uma característica importante deste método é o seu controle temporal e regional, permitindo a evasão de potenciais problemas relacionados com a letalidade embrionária ou a falta de ratos condutores de CRE específicos. Outro aspecto relevante dessa técnica é que ela ajuda a reduzir consideravelmente as limitações econômicas e temporais que envolvem a geração de novas linhas de camundongos, que se tornam particularmente importantes no estudo de interações entre tipos celulares que se originam em áreas distantes do cérebro em diferentes idades de desenvolvimento. Aqui descrevemos uma estratégia de eletroporação dupla que permite o direcionamento de populações celulares que são separadas espacial e temporalmente. Com essa abordagem podemos rotular diferentes subtipos de células em diferentes locais com proteínas fluorescentes selecionadas para visualizá-las, e/ou podemos manipular genes de interesse expressos por essas diferentes células nos momentos apropriados. Essa estratégia aumenta o potencial da eletroporação uteral e fornece uma poderosa ferramenta para estudar o comportamento de populações celulares temporais e espacialmente separadas que migram para estabelecer contatos próximos, bem como interações de longo alcance através de projeções axonais, reduzindo custos temporais e econômicos.

As interações entre as células vizinhas originaram-se em locais distais e em diferentes épocas: células de Cajal-Retzius (células CR) e neurônios de projeção cortical migratórios precoces (estratégia A)
A interação das células de CR e dos neurônios de projeção cortical precoce foi descrita anteriormente como necessária para regular a translocação somal via moléculas de adesão de néctina e cadherina usando uma estratégia de eletroporação dupla<sup clas...

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Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations

O dobro na eletroporação uteral permite atingir populações celulares que são separadas espacial e temporalmente. Esta técnica é útil para visualizar interações entre essas populações celulares usando proteínas fluorescentes em condições normais, mas também após experimentos funcionais para perturbado genes de interesse.

Dupla em Eletroporação utero para atingir populações celulares temporais e espacialmente separadas

In utero electroporation is an in vivo DNA transfer technique extensively used to study the molecular and cellular mechanisms underlying mammalian ...

O dobro na eletroporação utero é um método poderoso para estudar os aspectos importantes da corticogênese dos mamíferos, como a interação entre células neurônios, gerada em diferentes locais e idades de desenvolvimento. A principal vantagem dessa técnica é a capacidade de examinar interações não perturbadas entre essas diferentes populações celulares de forma rápida, detalhada e barata. Uma implicação impressionante do nosso método é que ele facilita uma melhor compreensão de quão semelhante nossa fiação é alterada em distúrbios neuronais como autismo e esquizofrenia.Este estudo não se restringe ao neocórtex, mas também pode ser empregado para analisar interações celular a célula, em áreas exocorticais como o sepalium ou cerebelo. Um dos passos mais desafiadores é a injeção de DNA nos ventrículos laterais dos embriões primitivos. O uso de uma fonte de luz brilhante é essencial para injeções bem sucedidas.Para cada cirurgia, primeiro prepare uma solução de 10 microliter contendo um microliter de corante verde rápido, um micrograma por microliter plasmid DNA solução de interesse para cada plasmídeo, e o volume apropriado no tampão de TE livre de endotoxina. E pré-carregar uma pipeta microcapilar de vidro com a solução de DNA preparada apropriada. Para a primeira cirurgia de eletroporação do útero, aplique pomada nos olhos de um rato grávida anestesiado adequadamente cronometrado, e use uma navalha para raspar o abdômen.Desinfete a pele exposta duas vezes com sequenciais 70% de etanol e lenços umedecidos de iodo antes de prosseguir com a incisão no lado direito do abdômen. Uma vez que o útero esteja acessível use fórceps de anel para extrair cuidadosamente o órgão. Usando um tubo aspirador controlado pela boca, injete aproximadamente 0,5 microliters de solução no ventrículo lateral do hemisfério esquerdo de embriões E11.5 para a estratégia A.Ou no ventrículo lateral do hemisfério direito de embriões E13.5 para a estratégia B, até que o corante verde rápido seja visível dentro do ventrículo.Quando toda a solução tiver sido injetada, coloque eletrodos de platina tipo fórceps lateralmente ao redor da cabeça dos embriões injetados, com o polo positivo orientado para a parede medial para atingir a bainha cortical para a estratégia A, ou orientado para o córtex lateral para a estratégia B, tendo o cuidado de evitar o coração e a placenta. Use um eletroporater de ondas quadradas para aplicar a sequência apropriada de pulsos elétricos para cada idade embrionária, conforme indicado na tabela. Quando todos os embriões tiverem sido injetados e eletroporados, use fórceps para retornar cuidadosamente o útero à cavidade abdominal, e encher o abdômen com soro fisiológico quente.Usando uma sutura de agulha 6-0, feche a parede abdominal e feche cuidadosamente a incisão da pele. Em seguida, devolva o animal para sua gaiola de origem com monitoramento até a recuperação completa. Dois dias após a cirurgia inicial, confirme que o rato está apresentando comportamento normal, e não apresenta sinais de dor ou angústia.Antes de preparar o animal para o segundo na eletroporação utetre como apenas demonstrado. Injete 0,5 microlitres da solução de DNA desejada no ventrículo cerebral lateral esquerdo de embriões E13,5 para a estratégia A, e no ventrículo cerebral lateral esquerdo de E15,5 embriões para a estratégia B.Após cada injeção, coloque os eletrodos com o polo positivo orientado para o córtex lateral do hemisfério injetado para estratégia A e estratégia B.E embriões eletroporatos como indicado na tabela. Quando a eletroporação estiver terminada, devolva o útero à cavidade abdominal e complete a cirurgia e os cuidados pós-cirúrgicos, conforme demonstrado.Ao implementar a estratégia A, quatro dias após a segunda eletroporação, colhimento do útero do embrionário dia 17,5 camundongo fêmea grávida em uma placa de petri de PBS no gelo. E use pinças para transferir os embriões para um novo prato de PBS sob um microscópio dissecando. Usando fórceps, segure cuidadosamente a cabeça de cada embrião para facilitar a remoção da pele sobre a cabeça e o crânio.Use fórceps ou espátula para levantar os cérebros expostos. Em seguida, use a colher para transferir cada cérebro para poços individuais de uma placa de 48 poços contendo cerca de 600 microliters de solução fixa por poço. Quando todos os cérebros tiverem sido coletados, conserte os cérebros a quatro graus Celsius durante a noite em um agitador orbital, seguido por três lavagem de dez minutos na PBS.Após a última lavagem, incorpore os cérebros em um ponto de fusão 4% baixo surgiu na PBS por cerca de dez minutos. Depois que a agarose se solidificar, use cola cianoacrilato para fixar cada cérebro a um suporte de tecido vibratome olfativo lado para cima. Coloque o suporte dentro do recipiente de vibratome e encha o recipiente com PBS.Em seguida, use o vibratome e um pincel para obter seções de série coronal de 100 micrômetros de espessura. Transferindo até sete seções por poço e seis poços por embrião, em uma nova placa de 48 poços contendo 600 microliters por poço de PBS fresco, complementados com conservantes antifúngicos à medida que são coletados. Quando todas as seções tiverem sido adquiridas, use um pincel fino para montar cada seção em um slide de microscópio de vidro, e cubra-as com uma mancha de vidro para avaliação da eficácia da eletroporação em um microscópio de epifluorescência vertical.Ao implementar a estratégia B, no dia 15 pós-natal, após confirmar a falta de resposta ao topinch, fixar o rato na posição supina e usar uma tesoura para fazer uma incisão de pele média para expor a caixa torácica e o diafragma, e cortar o diafragma para ter acesso ao coração. Usando uma tesoura fina, faça uma incisão no átrio direito e use uma agulha de 25 gage conectada a um tubo flexível a uma bomba de perfusão peristáltica para penetrar no ventrículo esquerdo. Quando a agulha estiver no lugar, entregue pelo menos 25 mililitros de 4% de paraformaldeído por perfusão transcárdia, a um fluxo constante a 5,5 mililitros por minuto.Após aproximadamente cinco minutos, pare a perfusão e use uma tesoura para remover a pele sobre a cabeça. Remova o crânio e use uma espátula para remover o tecido cerebral. Coloque o cérebro em um poço de uma placa de 24 poços contendo 1,5 mililitros de paraformaldeído fresco de 4%, para uma incubação durante a noite a quatro graus Celsius em um agitador orbital.Em seguida, adquira 40 seções de micrômetros do cérebro pós-natal como apenas demonstrado. Para imagens de fatias cerebrais embrionárias e pós-natais, coloque os slides contendo as seções cerebrais montadas de interesse em um suporte de slides de microscópio. Introduza o suporte do controle deslizante no microscópio confocal e selecione o canal apropriado para os fluorofores usados no experimento.Realize a varredura de amostras para obter imagens de mapa de cada seção cerebral em dois comprimentos de onda diferentes para uma visão geral da saída de eletroporação dupla. Uma vez concluída, selecione a lente 10x, no modo de observação de lapso de tempo de pilha Z de várias áreas. Em cada uma das regiões XY selecionadas, defina os perímetros de imagem apropriados, bem como a profundidade da varredura ao longo do eixo Z de acordo com os planos da amostra, em que a fluorescência é visível.Obtenha imagens de baixa ampliação de todas as regiões escolhidas e exporte as imagens do formato OIF para TIFF no software de visualizador de microscópio. Em seguida, selecione a lente 60x e capture imagens de alta ampliação como apenas demonstrado, para observar as interações célula-célula em um nível mais detalhado. A diferença temporal entre o duplo em cirurgias de eletroporação uteral permite que as células toresias cag direcionadas no dia embrionário 11.5 em um de seus locais de origem cheguem à zona marginal do neocórtex lateral, incluindo a área somatosensorial, a tempo de estabelecer contatos com neurônios de projeção cortical, rotulados no dia embrionário 13.5.Os principais processos de neurônios de projeção expressando aumento do GFP na zona marginal do córtex, e misturam-se com os processos de M-cherry expressando células cataretziais. No útero eletroporação no dia embrionário 13.5, o uso de um plasmídeo expresso bfp facilita a rotulagem de neurônios de projeção em diferentes camadas corticais. Uma segunda eletroporação no lado contralateral do dia embrionário 15.5 tem como alvo a subpopulação dos neurônios de projeção calosal da camada superior, mas não os neurônios de projeção de camada inferior que se desenvolvem em estágios anteriores.Os neurônios alvos da camada superior estendem seus axônios ao hemisfério contralateral, com o padrão de arborização característico. A alta ampliação permite uma visualização mais detalhada da invação do eixo calisal dos neurônios de projeção direcionados dentro do hemisfério contralateral. Ao tentar este protocolo, é importante planejar o tempo de eletroporação, o hemisfério para injetar, e a posição dos eletrodos de acordo com as populações celulares a serem alvo.Após este procedimento todos os métodos, como a eletroporação, são os interessantes. Para ambos os tipos de células pode ser realizada para estudar possíveis alterações de circuito in vivo. Utilizando essa técnica, é possível estudar interações finas entre duas células-alvo diferentes.Incluindo novas informações científicas in vivo, pela eletroporação de proteínas sinápticas fluorescentes.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Ultra-som guiada microinjeção em parte frontal do cérebro do rato In Utero Em E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

Neurociência

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

No útero Eletroporação seguido por Cultura Neuronal primário para estudar a função do gene no subconjunto dos neurônios corticais

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Entrega Gene eficiente em múltiplos territórios CNS Usando In Utero Eletroporação

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansão da embrionárias e adultas células-tronco neurais por<em&gt; In Utero</em&gt; Eletroporação ou injeção estereotáxica Viral

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualização e manipulação genética de dendritos e espinhas no córtex cerebral e hipocampo do rato usando<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Geração de topicamente transgênicas Rats por<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação e<em&gt; In vivo</em&gt; Triagem Bioluminescência

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Manipulação genética do rato em desenvolvimento Hipotálamo através<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

Específicos do Striatum Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- e<em&gt; In Utero</em&gt; A electroporação em ratinhos C57BL / 6 mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Uma nova estratégia combinando Array-CGH, todo-exome sequenciamento e eletroporação no Utero em roedores para identificar Genes causadores de malformações do cérebro

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...