Name: double in utero electroporation to target temporally and spatially separated cell populations
Uploaded: 2020-06-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations at JoVE.com

Författarna tackar Cristina Andrés Carbonell och medlemmar av Animal Care anläggningen i Universidad de Valencia för tekniskt stöd. Vi vill också tacka Isabel Fariñas och Sacramento R. Ferrón för reagenser och dela sin utrustning med oss. I.M.W finansieras genom ett Garantía Juvenil-kontrakt från Conselleria de Educación de Valencia (GJIDI/2018/A/221), D.dA.D finansieras av Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). C.Gil-Sanz innehar ett Ramón y Cajal Grant (RYC-2015-19058) från den spanska ministernio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN). Detta arbete finansierades RYC-2015-19058 och SAF2017-82880-R (MICINN).

Det förfarande som beskrivs här har godkänts av den etiska kommitté med ansvar för försök, djurens välbefinnande vid Universidad de Valencia och Conselleria de Agricultura. Desarrollo Rural, Emergencya Climática y Transición Ecológica från Comunidad Valenciana, och följer riktlinjerna från Internationella rådet för laboratoriedjurvetenskap (ICLAS) som granskades i den spanska lagstiftningens verkliga decreto 53/2013 samt i Europaparlamentets och rådets direktiv 2010/63/EU.
OBS...

<ol>
	<li>Popovitchenko, T., Rasin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+post-transcriptional+mechanisms+of+the+development+of+neocortical+lamination.">Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102 (2017).</li><li>Mukhtar, T., Taylor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untangling+Cortical+Complexity+During+Development.">Untangling Cortical Complexity During Development.</a> Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+Visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li><li>Shimogori, T., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+application+with+in+utero+electroporation+in+mouse+embryonic+brain.">Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 50, 499-506 (2008).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+embryonic+mouse+central+nervous+system+cells+by+in+utero+electroporation.">Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 50, 507-511 (2008).</li><li>Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., M&#252;ller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reelin+Regulates+Cadherin+Function+via+Dab1/Rap1+to+Control+Neuronal+Migration+and+Lamination+in+the+Neocortex.">Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex.</a> Neuron. 69, 482-497 (2011).</li><li>Gil-Sanz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal-Retzius+cells+instruct+neuronal+migration+by+coincidence+signaling+between+secreted+and+contact-dependent+guidance+cues.">Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues.</a> Neuron. 79, 461-477 (2013).</li><li>Martinez-Garay, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin+2/4+signaling+via+PTP1B+and+catenins+is+crucial+for+nucleokinesis+during+radial+neuronal+migration+in+the+neocortex.">Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex.</a> Development. 143, 2121-2134 (2016).</li><li>Popovitchenko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+binding+protein+HuR+determines+the+differential+translation+of+autism-associated+FoxP+subfamily+members+in+the+developing+neocortex.">The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Bultje, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Par3+Regulates+Progenitor+Cell+Asymmetric+Division+via+Notch+Signaling+in+the+Developing+Neocortex.">Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex.</a> Neuron. 63, 189-202 (2009).</li><li>Rodr&#237;guez-Tornos, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cux1+Enables+Interhemispheric+Connections+of+Layer+II/III+Neurons+by+Regulating+Kv1-Dependent+Firing.">Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing.</a> Neuron. 89, 494-506 (2016).</li><li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation.">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).</li><li>Mire, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+activity+regulates+Robo1+transcription+to+mediate+a+switch+in+thalamocortical+axon+growth.">Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth.</a> Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).</li><li>Kawauchi, D., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+cascade+from+Math1+to+Mbh1+and+Mbh2+is+required+for+cerebellar+granule+cell+differentiation.">Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation.</a> Developmental Biology. 322, 345-354 (2008).</li><li>Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+electroporation+approaches+to+study+the+excitability+of+neuronal+subpopulations+and+single-cell+connectivity.">In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity.</a> Journal of Visualized Experiments. 120, e55139 (2017).</li><li>Bielle, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+origins+of+Cajal-Retzius+cells+at+the+borders+of+the+developing+pallium.">Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium.</a> Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).</li><li>Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+p73+and+Reelin+in+the+Developing+Human+Cortex.">Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex.</a> Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).</li><li>Takiguchi-Hayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Reelin-Positive+Marginal+Zone+Cells+from+the+Caudomedial+Wall+of+Telencephalic+Vesicles.">Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles.</a> Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).</li><li>Berry, M., Rogers, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migration+of+neuroblasts+in+the+developing+cerebral+cortex.">The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex.</a> Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).</li><li>Alc&#225;ntara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+and+cellular+patterns+of+reelin+mRNA+expression+in+the+forebrain+of+the+developing+and+adult+mouse.">Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse.</a> Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).</li><li>Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+loss+of+Cajal-Retzius+cells+does+not+disrupt+neocortical+layer+order.">Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order.</a> Development. 133, 537-545 (2006).</li><li>Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+radial+migration+in+early+development+of+the+cerebral+cortex.">Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex.</a> Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).</li><li>Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development,+specification,+and+diversity+of+callosal+projection+neurons.">Development, specification, and diversity of callosal projection neurons.</a> Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).</li><li>Thomson, A. M., Bannister, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaminar+Connections+in+the+Neocortex.">Interlaminar Connections in the Neocortex.</a> Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).</li><li>Zarrinpar, A., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+connections+to+specific+types+of+layer+6+neurons+in+the+rat+visual+cortex.">Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).</li><li>Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+Transcallosal+Projections+Are+Present+throughout+the+Mouse+Cortex.">Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36 (2017).</li><li>DeFelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+the+brain,+the+human+nature+of+cortical+circuits,+and+intellectual+creativity.">The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29 (2011).</li><li>Velmeshev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genomics+identifies+cell+type&#8211;specific+molecular+changes+in+autism.">Single-cell genomics identifies cell type&#8211;specific molecular changes in autism.</a> Science. 364, 685-689 (2019).</li></ol>

Studiet av cell-cell interaktioner in vivo i regioner med hög cellulär densitet som hjärnbarken är en komplex uppgift. Traditionella metoder, inklusive användning av antikroppar för att märka neuriter är inte lämpliga på grund av bristen på specifika markörer för olika cellpopulationer. Användningen av transgena murinmodeller, där en viss celltyp uttrycker ett fluorescerande protein, är användbart för att visualisera de neuronala processerna, men detta beror på tillgången på sådana modeller. Denna u...

Hjärnbarken är en mycket komplex och invecklat organiserad struktur. För att uppnå en sådan grad av organisation, när projektion nervceller gå igenom komplexa utvecklingsprocesser som kräver deras tidsmässiga generation, migration till slutdestinationen i kortikal plattan, och inrättandet av kort-och långväga anslutningar1,2. Under lång tid var det klassiska sättet att studera kortikogenes baserat på användning av knockout eller knock-in murine modeller av gener av intresse. Denna strategi, och särskilt användningen av villkorliga knockout-möss, är dock tidskrävande och dyr, och innebär ibland ytterligare problem när det gäller förekomsten av genetisk redundans eller bristen på specifika CRE-drivrutiner, bland andra frågor. En av de metoder som uppstod för att försöka ta itu med dessa problem och som numera används i stor utsträckning för att studera när utveckling är in utero elektroporation3,4. In utero elektroporation är en teknik som används för somatisk transgenes, möjliggör in vivo inriktning av neurala stamceller och deras avkomma. Denna metod kan användas för att märka celler med uttryck av fluorescerande proteiner5,6, för genmanipulation in vivo (dvs. vinst eller förlust av funktionsanalyser)7,,8,9, för att isolera elektroporerade kortiker in vitro- och odlingsceller8,10. Dessutom tillåter in utero elektroporation tidsmässig och regional kontroll av det riktade området. Denna teknik har många tillämpningar och har använts i stor utsträckning för att studera neuronal migration, stamceller division, neuronal anslutning, och andra ämnen8,9,11,12.
Det aktuella manuskriptet beskriver användningen av en in utero elektroporation variant, kallas dubbel in utero elektroporation, att analysera interaktioner av celler i hjärnbarken med olika tidsmässiga och rumsliga ursprung. Dessa studier är extremt komplexa att slutföra när man använder murine modeller eftersom de kräver kombinerad användning av flera transgena linjer. Några av de tillämpningar av protokollet som beskrivs i detta dokument inkluderar studiet av nära interaktioner mellan angränsande celler, samt interaktioner mellan avlägsna celler genom långväga prognoser. Metoden kräver att utföra två oberoende in utero elektroporation operationer, separerade tidsmässigt och rumsligt, på samma embryon för att rikta olika cell populationer av intresse. Fördelen med detta tillvägagångssätt är möjligheten att manipulera genfunktion i en eller båda typerna av nervceller med vilda typer av djur av vild typ. Dessutom kan dessa funktionella experiment kombineras med uttrycket av cytoplasmatiska eller membranmärkta fluorescerande proteiner för att visualisera den fina morfologin hos riktade celler, inklusive dendriter och axoner, och analysera möjliga skillnader i cellulära interaktioner i jämförelse med en kontroll (dvs. celler som endast är märkta med fluorescerande protein).
Protokollet beskrivs här är inriktad på studier av cellulära interaktioner inuti neocortex, men denna strategi kan också användas för att undersöka interaktioner med extrakortikala områden som kan riktas med hjälp av utero elektroporation, som subpallium eller thalamus13,14, eller cell-cell interaktioner i andra strukturer, som lillhjärnan15. Inriktning av olika områden baseras på elektrodernas orientering och på ventrikeln där DNA injiceras (lateralt, tredje eller fjärde). Med den strategi som beskrivs här kan vi märka ett stort antal celler, vilket är användbart för att utvärdera allmänna förändringar i anslutning /innervation i funktionella experiment. Ändå, för att studera fina förändringar i anslutning, kan man använda modifierade versioner av in utero elektroporation för att få sparser märkning och identifiera enskilda celler16. Sammanfattningsvis är dubbel in utero elektroporation en mångsidig metod som gör det möjligt att rikta tidsmässigt och rumsligt åtskilda cellpopulationer och studera deras interaktioner i detalj, antingen i kontrollförhållanden eller i kombination med funktionella experiment, avsevärt minska tidsmässiga och ekonomiska kostnader.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baby-mixter hemostat (perfusion)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B100-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml)</td>
			<td>Rb Pharmaceuticals Limited</td>
			<td>921425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAG-BFP plasmid</td>
			<td>Kindly provided by U.M&#252;ller Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAG-EGFP plasmid</td>
			<td>Kindly provided by U.M&#252;ller Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAG-mCherry plasmid</td>
			<td>Kindly provided by U.M&#252;ller Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid</td>
			<td>Kindly provided by U.M&#252;ller Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV10i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swabs</td>
			<td>BFHCVDF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>B. Braun Surgical</td>
			<td>1050044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>stemi 305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5 Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM830 Square Wave Electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric Razor</td>
			<td>Oster</td>
			<td>76998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endotoxin-free TE buffer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>1018499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol wipes</td>
			<td>BFHCVDF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>682542.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>14069-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence LEDs</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>pE-300-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genopure Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3143422001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsted-Mosquito Hemostats (suture)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>91308-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>UFESA</td>
			<td>AL5514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE2000-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine wipes</td>
			<td>Lorsoul</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane vaporizer</td>
			<td>Flow-Meter</td>
			<td>A15B5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Karizoo</td>
			<td>586259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Anastemine)</td>
			<td>Fatro Ib&#233;rica SL</td>
			<td>583889-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech precision wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Lennox) Agar GEN</td>
			<td>Labkem</td>
			<td>AGLB-00P-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Lennox) broth GEN</td>
			<td>Labkem</td>
			<td>LBBR-00P-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melting point agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP165-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine (Sedator)</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>573749.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslips</td>
			<td>Menel-Gl&#228;ser</td>
			<td>15747592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>SLIB-F10-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutiwell plates (24)</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>32024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutiwell plates (48)</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>32048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (for saline solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10112640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 25 G (BD Microlance 3)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>300600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital incubator S150</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td>5133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P Selecta Incubator</td>
			<td>J. P. Selecta, s.a.</td>
			<td>0485472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>PanReac AppliedChem</td>
			<td>A3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic perfusion pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07522-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter</td>
			<td>Btx</td>
			<td>45-0489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex Skin Closure System - 7mm Clips, box of 100</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>203-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex Skin Closure System - Clip Applyer, 7mm</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>204-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11103-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>PanReac AppliedChem</td>
			<td>122712-1608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical absorbent pad (steryle)</td>
			<td>HK Surgical</td>
			<td>PD-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (Surgicryl PGA 6-0)</td>
			<td>SMI Suture Materials</td>
			<td>BYD11071512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1ml (BD plastipak)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 100 x 20 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ni</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double in utero electroporation to target temporally and spatially separated cell populations

In utero elektroporation är en in vivo DNA-överföring teknik som används i stor utsträckning för att studera de molekylära och cellulära mekanismer som ligger till grund för däggdjur kortikogenes. Detta förfarande drar nytta av hjärnans ventriklar för att möjliggöra införandet av DNA av intresse och använder ett par elektroder för att styra ingången av det genetiska materialet i cellerna som kantar ventrikeln, de neurala stamcellerna. Denna metod gör det möjligt för forskare att märka de önskade cellerna och/eller manipulera uttrycket av gener av intresse för dessa celler. Den har flera program, inklusive analyser som riktar sig till neuronal migration, härstamning spårning, och axonal pathfinding. Ett viktigt inslag i denna metod är dess tidsmässiga och regionala kontroll, vilket möjliggör kringgående av potentiella problem relaterade med embryonal dödlighet eller bristen på specifika CRE-drivrutinsmöss. En annan relevant aspekt av denna teknik är att det bidrar till att avsevärt minska de ekonomiska och tidsmässiga begränsningar som involverar utvecklingen av nya muslinjer, som blir särskilt viktigt i studiet av interaktioner mellan celltyper som har sitt ursprung i avlägsna områden i hjärnan vid olika utvecklingsåldrar. Här beskriver vi en dubbel elektroporation strategi som möjliggör inriktning av cell populationer som är rumsligt och tidsmässigt separerade. Med detta tillvägagångssätt kan vi märka olika subtyper av celler på olika platser med utvalda fluorescerande proteiner för att visualisera dem, och/ eller vi kan manipulera gener av intresse som uttrycks av dessa olika celler vid lämpliga tidpunkter. Denna strategi ökar potentialen hos in utero elektroporation och ger ett kraftfullt verktyg för att studera beteendet hos tidsmässigt och rumsligt separerade cellpopulationer som migrerar för att upprätta nära kontakter, samt långväga interaktioner genom axonal projektioner, minska tidsmässiga och ekonomiska kostnader.

Interaktioner mellan angränsande celler har sitt ursprung i distala platser och vid olika tidpunkter: Cajal-Retzius celler (CR-celler) och tidiga migrerande närprojektion nervceller (strategi A)
Interaktionen mellan CR-celler och tidiga närprojektionsneuron beskrevs tidigare som nödvändig för att reglera somal flyttning via nekrotin- och cadherinadhesionmolekyler med hjälp av en dubbel elektroporationsstrategi8. CR-celler härstammar från neuroe...

Watch this Scientific Journal Video about Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations at JoVE.com

Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations

Dubbel in utero elektroporation tillåter inriktning cell populationer som är rumsligt och tidsmässigt separerade. Denna teknik är användbar för att visualisera interaktioner mellan dessa cellpopulationer med fluorescerande proteiner under normala förhållanden, men också efter funktionella experiment för att störa gener av intresse.

Double In Utero Electroporation att rikta temporally och rumsligt åtskilda cell populationer

In utero electroporation is an in vivo DNA transfer technique extensively used to study the molecular and cellular mechanisms underlying mammalian ...

Double in utero elektroporation är en kraftfull metod för att studera de viktiga aspekterna av däggdjur kortikogenes såsom samspelet mellan neuronceller, genereras på olika platser och utvecklingsmässiga åldrar. Den största fördelen med denna teknik är förmågan att undersöka oberörd interaktioner mellan dessa olika cellpopulationer på ett snabbt, detaljerat och billigt sätt. En slående konsekvens av vår metod är att det underlättar en bättre förståelse för hur liknande våra ledningar ändras i neuronala sjukdomar som autism och schizofreni.Denna studie är inte begränsad till neocortex men det kan också användas för att analysera cell till cell interaktioner, i exocortico områden såsom sepalium eller lillhjärnan. En av de mest utmanande stegen är injektion av DNA i de laterala ventriklarna av tidiga embryon. Användningen av en ljusstark ljuskälla är avgörande för framgångsrika injektioner.För varje operation först förbereda en 10 mikroliter lösning som innehåller en mikroliter av snabb grön färgämne, en ett mikrogram per mikroliter plasmid DNA-lösning av intresse för varje plasmid, och lämplig volym på Endotoxin fri TE buffert. Och förspänning en glas mikrokapillärpipett med lämplig beredd DNA-lösning. För den första in utero elektroporering kirurgi, tillämpa salva på ögonen på en lämpligt tidsansatt sövd gravid mus, och använd en rakkniv för att raka buken.Desinficera den exponerade huden två gånger med sekventiell 70%etanol och jodservetter innan du fortsätter med snittet på höger sida av buken. När livmodern är tillgänglig användning ring forceps att noggrant extrahera organet. Med hjälp av en mun kontrollerad aspirator röret, injicera cirka 0,5 mikroliter lösning i den laterala ventrikeln av den vänstra hjärnhalvan av E11.5 embryon för strategi A.Or i den laterala ventrikeln av den högra hjärnhalvan av E13.5 embryon för strategi B, tills den snabba gröna färgämnet är synlig inuti ventrikeln.När alla lösningen har injicerats, placera tlyckor typ platina elektroder i laterledsen runt av huvudet på de injicerade embryon, med den positiva polen orienterade till den mediala väggen för att rikta den kortikala hem för strategi A, eller orienterad till laterala cortex för strategi B, ta hand för att undvika hjärtat och moderkakan. Använd en fyrkantsvågselektroporater för att tillämpa lämplig sekvens av elektriska pulser för varje embryonal ålder, som anges i tabellen. När alla embryon har injicerats och elektroporerade, använd forceps för att försiktigt återvända livmodern till bukhålan, och fyll buken med varm saltlösning.Med hjälp av en nål 6-0 sutur, stäng bukväggen, och försiktigt stänga huden snitt. Sedan tillbaka djuret till sitt hem bur med övervakning tills full återhämtning. Två dagar efter den första operationen, bekräfta att musen uppvisar normalt beteende, och presenterar inga tecken på smärta eller ångest.Innan du förbereder djuret för den andra in utero elektroporation som just visat. Injicera 0,5 mikroliter av den önskade DNA-lösningen i den vänstra laterala hjärnkammaren av E13.5 embryon för strategi A, och i den vänstra laterala hjärnkammar av E15.5 embryon för strategi B.Efter varje injektion, placera elektroderna med den positiva polen orienterade till laterala cortex av injicerade hjärnhalvan för strategi A och strategi B.And electropor embryon som anges i tabellen. När elektroporationen är klar, återgå livmodern till bukhålan, och slutföra kirurgi och post-kirurgisk vård som visats.Vid genomförandet av strategi A, fyra dagar efter den andra elektroporationen, skörda livmodern av den embryonala dagen 17,5 gravid kvinnlig mus i en petriskål av PBS på is. Och använd pincett för att överföra embryona till en ny maträtt av PBS under en dissekera mikroskop. Med hjälp av tents, ta försiktigt tag i huvudet på varje embryo för att underlätta avlägsnandet av huden över huvudet och skallen.Använd teds eller en spatel för att lyfta ut de exponerade hjärnorna. Använd sedan sked för att överföra varje hjärna till enskilda brunnar av en 48 brunnsplatta som innehåller cirka 600 mikroliter av fixativ lösning per brunn. När alla hjärnor har samlats in, fixa hjärnorna vid fyra grader Celsius över natten på en orbital shaker, följt av tre tio minuters tvättar i PBS.Efter den sista tvätten, bädda in hjärnorna i 4%låg smältpunkt agarose i PBS i ca tio minuter. Efter agaros har stelnat, använd cyanoakrylat lim för att säkra varje hjärna till en vibratome vävnad innehavaren luktbulgande sida upp. Placera hållaren inuti vibratombehållaren, och fyll behållaren med PBS.Använd sedan vibratomen och en borste för att erhålla 100 mikrometer tjocka koronaseriesektioner. Överföra upp till sju sektioner per brunn och sex brunnar per embryo, i en ny 48 brunnsplatta som innehåller 600 mikroliter per brunn av färsk PBS, kompletterad med anti-svamp konserveringsmedel som de samlas in. När alla avsnitt har förvärvats, använd en fin borste för att montera varje sektion på ett glas mikroskop slide, och täcka dem med ett glas coverslip för bedömning av elektroporation effekt på en upprätt epifluorescens mikroskop.När du genomför strategi B, på postnatal dag 15, efter att ha bekräftat en brist på svar på topinch, säkra musen i ryggläge, och använda sax för att göra en mittlinje hud snitt för att exponera bröstkorgen och mellangärdet, och skär membranet för att få tillgång till hjärtat. Använda fin sax, gör ett snitt i höger atrium, och använda en 25 gage nål ansluten till ett flexibelt rör till en peristaltisk perfusion pump för att tränga in i vänster kammare. När nålen är på plats, leverera minst 25 milliliter av 4%paraformaldehyd genom transcardial perfusion, vid en konstant flux på 5,5 milliliter per minut.Efter cirka fem minuter, stoppa perfusion, och använda sax för att ta bort huden över huvudet. Ta bort skallen, och använd en spatel för att ta bort hjärnvävnaden. Placera hjärnan i en brunn av en 24 brunnsplatta som innehåller 1,5 milliliter färsk 4%paraformaldehyd, för en övernattning inkubation vid fyra grader Celsius på en orbital shaker.Sedan förvärva 40 mikrometer delar av de postnatala hjärnorna som just visat. För embryonala och postnatala hjärnan skiva imaging, placera diabilder som innehåller monterade hjärnan delar av intresse på ett mikroskop diabildshållare. Införa reglagehållaren i konfokalmikroskopet, och välj lämplig kanal för de fluoroforer som används i experimentet.Utför provskanning för att få kartbilder av varje hjärnsektion vid två olika våglängder för en allmän bild av den dubbla elektroporationsutstrålningen. När du är klar, välj 10x objektiv, i flera områden Z-stack time lapse observation läge. I var och en av de utvalda XY-regionerna ställer du in lämpliga avbildningsperimeter samt skanningens djup längs Z-axeln enligt planen i provet, i vilka fluorescensen syns.Få bilder med låg förstoring av alla de valda regionerna, och exportera bilderna från OIF till TIFF-format i programvaran för mikroskopvisning. Välj sedan 60x-objektivet, och fånga bilder med hög förstoring som just visats, för att observera cell-till-cell-interaktionerna på en mer detaljerad nivå. Den tidsmässiga klyftan mellan den dubbla in utero elektroporation operationer gör CAG toresial celler riktade på embryonala dag 11,5 i en av dess ursprungsplatser för att nå den marginella zonen i den laterala neocortex inklusive somatosensory området, i tid för att etablera kontakter med när projektion nervceller, märkt på embryonala dag 13,5.De ledande processerna för projektion nervceller uttrycker förbättrad GFP ymnigt uprise i marginella zonen i cortex, och blandas med processerna för M-cherry uttrycker cataretzial celler. In utero elektroporation på embryonala dag 13,5, med hjälp av en BFP uttrycker plasmid underlättar märkning av projektion nervceller över olika kortikala lager. En andra elektroporation i kontralateral sidan av embryonala dag 15.5 mål det övre lagret callosal projektion nervceller subpopulation, men inte det nedre lagret projektion nervceller som utvecklas i tidigare skeden.Övre skikt riktade nervceller förlänga sina axoner till kontralateral halvklotet, med det karakteristiska arborization mönster. Hög förstoring tillåter en mer detaljerad visualisering av callosal axon innervation av de riktade projektion nervceller inom kontralateral halvklotet. När du försöker detta protokoll, är det viktigt att planera elektroporation timing, halvklotet att injicera, och positionen för elektroderna enligt de cellpopulationer som ska riktas.Efter detta förfarande alla metoder, såsom elektroporation är den intressanta. För båda celltyperna kan utföras för att studera möjliga kretsförändningar in vivo. Med hjälp av denna teknik är det möjligt att studera fina interaktioner mellan två olika riktade celler.Inklusive ny vetenskap information in vivo, genom elektroporation av fluorescerande synaptiska proteiner.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Ultraljud-Guidad mikroinjektion i musen framhjärnan I Utero På E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

I livmodern elektroporation följt av primär Neuronala Kultur för att studera geners funktion i Delmängd av kortikal Neuroner

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Effektiv Gene Delivery i flera CNS territorierna Använda I Utero Elektroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mus I livmodern Elektroporation: Kontrollerad Spatiotemporal Gene Transfektion

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Utbyggnad av embryonala och vuxna neurala stamceller genom<em&gt; I Utero</em&gt; Elektroporering eller viral stereotaxisk injektion

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisering och Genetic Manipulation av dendriter och ryggar i mus hjärnbarken och hippocampus med användning av<em&gt; I utero</em&gt; Elektroporering

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generering av Lokalt Transgena råttor genom<em&gt; I livmodern</em&gt; Elektroporering och<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescence Screening

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genmanipulation av Mouse Utveckla Hypothalamus genom<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporering

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, lateral Septal Nucleus- och Striatum specifika<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporering i C57BL / 6 mus

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

En ny strategi kombinera Array-CGH, hela-exome sekvensering och In Utero elektroporation hos gnagare att identifiera orsakande gener för hjärnan missbildningar