Name: quantifying human norovirus virus-like particles binding to commensal bacteria using flow cytometry
Uploaded: 2020-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry at JoVE.com

نود أن نشكر سوتونوكا بهار وشانيل موسبي-هاوندروب على مراجعتهما النقدية للمخطوطة المكتوبة، وكذلك ألفونسو كاريلو للمساعدة في توليد منحنيات قياسية بكتيرية. ويتم تمويل هذا العمل جزئياً من منحة مقدمة من المعهد الوطني للصحة (R21AI140012) ومنحة أولية من جامعة فلوريدا، معهد الأغذية والعلوم الزراعية.

ملاحظة: شروط النمو البكتيرية المبينة في البروتوكول هي شروط الثقافة القياسية لكلواكات Enterobacter وLactobacillus gasseri. لأداء الفيروس: البكتيريا التعلق بالقياس مع الأنواع البكتيرية الأخرى، وينبغي أن تكون البكتيريا المختارة المستزرعة في ظل ظروف قياسية مناسبة للبكتيريا.
1. إعدا?...

<ol>
	<li>Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+global+burden+of+noroviruses+and+opportunities+for+prevention.">New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention.</a> Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).</li><li>Jones, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+bacteria+promote+human+and+mouse+norovirus+infection+of+B+cells.">Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells.</a> Science. 346 (6210), 755-759 (2014).</li><li>Baldridge, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commensal+microbes+and+interferon-lambda+determine+persistence+of+enteric+murine+norovirus+infection.">Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection.</a> Science. 347 (6219), 266-269 (2015).</li><li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterobacter+cloacae+inhibits+human+norovirus+infectivity+in+gnotobiotic+pigs.">Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs.</a> Scientific reports. 6, 25017 (2016).</li><li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Protective+Efficacy+of+Probiotics+and+Rice+Bran+against+Human+Norovirus+Infection+and+Diarrhea+in+Gnotobiotic+Pigs.">High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1699 (2016).</li><li>Rodr&#237;guez-D&#237;az, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+secretor+status+genotype+and+microbiota+composition+in+susceptibility+to+rotavirus+and+norovirus+infections+in+humans.">Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans.</a> Scientific Reports. 7, 45559 (2017).</li><li>Erickson, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+Facilitate+Enteric+Virus+Co-infection+of+Mammalian+Cells+and+Promote+Genetic+Recombination.">Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination.</a> Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).</li><li>Kuss, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+microbiota+promote+enteric+virus+replication+and+systemic+pathogenesis.">Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis.</a> Science. 334 (6053), 249-252 (2011).</li><li>Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lipopolysaccharide+binding+enhances+virion+stability+and+promotes+environmental+fitness+of+an+enteric+virus.">Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus.</a> Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).</li><li>Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+and+bacterial+envelope+components+enhance+mammalian+reovirus+thermostability.">Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability.</a> PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768 (2017).</li><li>Miura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histo-blood+group+antigen-like+substances+of+human+enteric+bacteria+as+specific+adsorbents+for+human+noroviruses.">Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses.</a> Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).</li><li>Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+norovirus+binding+to+select+bacteria+representative+of+the+human+gut+microbiota.">Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota.</a> PLOS One. 12 (3), (2017).</li><li>Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Related+enteric+viruses+have+different+requirements+for+host+microbiota+in+mice.">Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice.</a> Journal of Virology. , (2019).</li><li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids.">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li><li>Van Dycke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+human+norovirus+replication+model+in+zebrafish+larvae.">A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae.</a> PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009 (2019).</li><li>Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+to+histo-blood+group+antigen-expressing+bacteria+protects+human+norovirus+from+acute+heat+stress.">Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 659 (2015).</li><li>Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+norovirus+binding+to+gut-associated+bacterial+ligands.">Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands.</a> BMC Research Notes. 12 (1), 607 (2019).</li><li>Debbink, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within-host+evolution+results+in+antigenically+distinct+GII.4+noroviruses.">Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses.</a> Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).</li><li>Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Norwalk+virus-like+particles+to+ABH+histo-blood+group+antigens+is+blocked+by+antisera+from+infected+human+volunteers+or+experimentally+vaccinated+mice.">Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice.</a> Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).</li><li>Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+capture+with+histo-blood+group+antigens+reveals+novel+virus-ligand+interactions.">Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions.</a> Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).</li><li>Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GII.4+Human+Norovirus:+Surveying+the+Antigenic+Landscape.">GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape.</a> Viruses. 11 (2), (2019).</li><li>Prasad, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystallographic+structure+of+the+Norwalk+virus+capsid.">X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid.</a> Science. 286 (5438), 287-290 (1999).</li><li>Baric, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+self-assembly+of+norwalk+virus+capsid+protein+from+venezuelan+equine+encephalitis+virus+replicons.">Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons.</a> Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).</li><li>Rubio-del-Campo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noroviral+p-particles+as+an+in+vitro+model+to+assess+the+interactions+of+noroviruses+with+probiotics.">Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics.</a> PLOS One. 9 (2), 89586 (2014).</li><li>Tan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+modifications+of+norovirus+P+domain+resulted+in+a+new+type+of+subviral+particles,+the+small+P+particles.">Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles.</a> Virology. 410 (2), 345-352 (2011).</li></ol>

القدرة على تحديد كمية ربط الفيروسات المعوية للبكتيريا هي خطوة أولى حاسمة لتوضيح الآليات التي تغير بها هذه البكتيريا العدوى الفيروسية. وقد تم تحسين الطرق المذكورة هنا لقياس التفاعلات فيروس النورو VLP البشري مع كل من E. cloacae (البكتيريا السلبية غرام) وL. gasseri (بكتيريا ...

الفيروسات النوروالبشرية (HuNoVs) هي السبب الرئيسي لمرض الجهاز الهضمي في جميع أنحاء العالم، ومسؤولة عن 685 مليون عدوى وأكثر من 200،000 حالة وفاة كل عام1. كما هو الحال مع الفيروسات المعوية الأخرى ، وقد ثبت وجود البكتيريا commensal لتعزيز العدوى من هذا العامل الممرض وكذلك فيروسها البديل ، نوروفيروس المورين2،3. وهناك أيضا تقارير متضاربة أن البكتيريا قد تمنع العدوى من قبل نوروفيروس الإنسان4,5,5,6. بالنسبة للعديد من الفيروسات ، يبدو أن التفاعل المباشر بين الفيروس والبكتيريا يكمن وراء الآليات التي تؤثر على العدوى الفيروسية2،7،8،9،10، وقد ثبت من خلال المجهر الإلكتروني أن نوروفيروسات الإنسان ترتبط مباشرة بأسطح البكتيريا11،12. لذلك ، أصبح توصيف هذه التفاعلات أمرًا حاسمًا لتحديد الآليات التي تؤثر بها البكتيريا على العدوى الفيروسية. وقد بدأ هذا الوصف كلاسيكيا مع تحديد الربط الفيروسي لمجموعة من الأنواع البكتيرية التي هي مكونات الميكروبيوم المضيف7،12،13. هذه الملحقات لا تكشف فقط عن كمية الفيروس المرتبطة بالبكتيريا، ولكن أيضا تساعد في تحديد تأثير هذا التفاعل على اللياقة البدنية الفيروسية والبقاء على قيد الحياة.
ولتحديد التعلق الفيروسي كمياً، تشمل الأساليب المستخدمة تقليدياً المقالات القائمة على الـ PCR التي تحدد الجينوم الفيروسي12 أو توليد الفيروس المسمى إشعاعياً واستخدام عد التلألؤ لتحديد الجسيمات الفيروسية7،,8،,9،,13. ويتطلب استخدام هذه الأساليب عموماً الحصول على مخزونات الفيروسات العالية التيتر وتقنيات الزراعة المختبرية التي يمكن من خلالها توليدها. في حين أن العديد من النظم الثقافية لفيروس النورو البشري موجودة الآن2,14,15, لا شيء يدعم النسخ المتماثل القوي المطلوب لتوليد هذه المخزونات عالية التركيز الذي يقيد أو يلغي استخدام PCR والعد التلألؤ لتحديد التفاعلات البشرية النوروفيروس / البكتيرية.
للتحايل على هذه المشكلة، يمكن استخدام الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLPs) كبديل للفيروس الحي للتحقيق في التفاعلات بين فيروس النورو البشري والبكتيريا16،17. VLPs هي جسيمات غير معدية تشبه إلى حد كبير الفيروس الذي تستمد منه. في حالة نوروفيروس الإنسان، يتم إنشاء هذه الجسيمات من التعبير عن بروتين VP1 (وأحيانا VP2)، والتي تتجمع ذاتيا لخلق الكبقية الفيروسية سليمة تفتقر إلى المواد الوراثية (أي الجيش الملكي النيبالي للفيروسات النورو). وقد تم وصف هذه VLPs بشكل جيد، هي هيكليا ومضادة مماثلة للفيروسات البرية من النوع الذي يتم اشتقاقها18،19،20،21،22،23. لذلك ، تعمل VLPs كبديل مثالي للتحقيق في التفاعلات السطحية بين فيروس النورو البشري والبكتيريا الكوميدية. وبالنظر إلى أن هذه المواد تفتقر إلى المواد الوراثية، لا يمكن استخدام المقالات القائمة على الأنبير المبايض لتحديد كمية الربط الفيروسي. تم وصف طريقة قياس الخلايا المتدفقة المستندة إلى الأجسام المضادة سابقًا وقادرة على اكتشاف مستويات منخفضة من VLP ملزمة للبكتيريا بطريقة شبه كمية16. تم تحسين هذه الطريقة للسماح للتقدير الكمي الدقيق لفيروس النورو VLP البشري ملزمة لكل من البكتيريا commensal السلبية والغرام إيجابية16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7002</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaeroPack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R681001</td>
			<td>Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FacsDiva software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1605</td>
			<td>Used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554657</td>
			<td>Used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12473281</td>
			<td>Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRS Powder</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>288130</td>
			<td>Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MA5-18241</td>
			<td>Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norovirus GII.4 VLP</td>
			<td>Creative Biostructure</td>
			<td>CBS-V700</td>
			<td>human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP665</td>
			<td>Dilute to 1X prior to use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S10467</td>
			<td>Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td>Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying human norovirus virus-like particles binding to commensal bacteria using flow cytometry

البكتيريا commensal راسخة بشكل جيد للتأثير على عدوى الفيروسات eukaryotic. الربط المباشر بين العامل الممرض والميكروبيوم المضيف هو المسؤول عن تغيير العدوى للعديد من هذه الفيروسات. وبالتالي ، فإن توصيف طبيعة ربط البكتيريا الفيروسية هو خطوة أساسية ضرورية لتوضيح الآلية (الآليات) التي تغير بها البكتيريا العدوى الفيروسية. لفيروس النورو البشري، تعزز البكتيريا commensal عدوى الخلايا B. يرتبط الفيروس مباشرة بهذه البكتيريا ، مما يشير إلى أن هذا التفاعل المباشر يشارك في آلية تعزيز العدوى. يمكن استخدام مجموعة متنوعة من التقنيات لقياس التفاعلات بين البكتيريا والفيروسات بما في ذلك عد التألؤ للفيروسات ذات العلامات الإشعاعية ورد فعل سلسلة البوليمرات (PCR). كلا الأسلوبين تتطلب استخدام الفيروس الحي، والتي قد تحتاج إلى توليد في المختبر. وفي الوقت الراهن، لا يوجد أي من النظم الراسخة في مجال الثقافة المختبرية المتاحة لفيروس النورو البشري قوية بما يكفي للسماح بتوليد مخزونات فيروسية شديدة التركيز. وبدلاً من الفيروس الحي، استُخدمت جسيمات شبيهة بالفيروسات لتوصيف التفاعلات بين الفيروس النوروي والبكتيريا. هنا يتم وصف طريقة قياس الخلايا التدفق مع يستخدم الأجسام المضادة فيروس محددة لتحديد VLP ملزمة للبكتيريا السلبية غرام وإيجابية غرام. إدراج كل من البكتيريا فقط وضوابط isotype سمح لتحسين الفحص للحد من الخلفية الأجسام المضادة ملزمة والقياس الكمي الدقيق للتعلق VLP إلى البكتيريا التي تم اختبارها. ارتفاع VLP: نسب البكتيريا تؤدي إلى VLPs ملزمة لنسب كبيرة من السكان البكتيرية. ومع ذلك، عندما يتم تقليل كميات VLP، في المئة من البكتيريا ملزمة يقلل أيضا. في نهاية المطاف، يمكن استخدام هذه الطريقة في التجارب المستقبلية توضيح الشروط المحددة والمكونات الهيكلية التي تنظم نوروفيروس: التفاعلات البكتيرية.

وترد استراتيجيات الجاتينغ المستخدمة لتحديد كمية فيروس النوروفيروس VLP البشري ملزمة للبكتيريا commensal في الشكل 1. توفر نقطة الكثافة التمثيلية نظرة عامة على كيفية بوابات العينات لإزالة الحطام الخلوي وكتل الخلايا بحيث تم تحديد مرفق VLP على مجموعات مفردة<strong class=...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry at JoVE.com

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

الهدف من هذا البروتوكول هو تحديد كمية ملزمة من الممرض eukaryotic فيروس النورو البشري للبكتيريا. بعد إجراء قياس أولي لارتباط بكتيريا الفيروسات ، يتم استخدام قياس الخلايا للتدفق للكشف عن البكتيريا المرتبطة بالفيروسات داخل السكان.

تحديد كمية بشرية فيروس نوروفيروس مثل الجسيمات ملزمة لبكتيريا كومينسال باستخدام تدفق قياس الخلايا

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

التفاعلات بين الفيروسات والبكتيرية يمكن أن تكون مهمة للعدوى الفيروسية الناجحة وتحفيز استجابة مناعية للمضيف. ولكن في الوقت الراهن، لا يمكن إنتاج مخزون عالي التركيز ومنقى من فيروس نورو البشري في المختبر. ويمكن استخدام هذه التقنية مع أي فيروس يرتبط بالبكتيريا، والتي تتوفر لها إما جزيئات تشبه الفيروس أو فيروس حي.فهو يمكننا من قياس التفاعلات بين هذه الفيروسات والبكتيريا. تلقيح خمسة ملليلتر من المتوسطة السائلة مع مستعمرة معزولة واحدة من كلواكا Enterobacter من لوحة أجار مباشرة من مخزون الجلسرين المجمدة. زراعة البكتيريا بين عشية وضحاها.وفي اليوم التالي، نقل 1.3 ملليلتر من الزّار من الاستزراع إلى أنبوبين منفصلين للطرد المركزي سعة 1.5 ملليلتر. جهاز طرد مركزي الأنابيب في 10، 000 x ز لمدة خمس دقائق. إزالة االنبات، ثم غسل العينات مرتين باستخدام ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني معقم 1X لكل غسل.أجهزة الطرد المركزي العينات مرة أخرى في 10، 000 x ز لمدة خمس دقائق. إزالة افرنح و resuspend بيليه في 1.3 ملليلتر من برنامج تلفزيوني 1X العقيمة. بدءا من 0.5 ملليلتر من الثقافة غسلها، وتمييع بشكل متسلسل البكتيريا في 1X PBS من 10 إلى ناقص واحد إلى 10 إلى أربعة ناقص.باستخدام مقياس الطيف، وقياس الكثافة البصرية من الثقافة غير المخفف غسلها وكل من التخفيفات الأربعة في 600 نانومتر. أداء 10 أضعاف التخفيفات التسلسلية في 1X PBS لكل من التخفيفات السابقة. انتشار 100 ميكرولترات من التخفيفات الثلاثة الأخيرة لكل سلسلة على لوحات أجار لتحديد عدد وحدات تشكيل مستعمرة لكل ملليلتر لكل عينة.السماح للألواح لتجف في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. عكس لوحات واحتضان لهم في الحاضنة. بعد إعداد الكواشف والأجسام المضادة والبكتيريا كما هو موضح في المخطوطة، قم بتجميع جميع المواد في خزانة السلامة البيولوجية BSL-2.يتم سرد الجسيمات الشبيهة بالفيروسات لفيروس النورو البشري كمسببات للأمراض BSL-2 وينبغي إجراء جميع الأعمال التي تؤدي باستخدام VLP في خزانة السلامة البيولوجية المعتمدة. إضافة 10 ميكروغرام من VLPs نوروفيروس الإنسان إلى كل أنبوب من البكتيريا وخلطها جيدا عن طريق الأنابيب. احتضان الأنابيب لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية مع دوران مستمر.بعد الحضانة، الطرد المركزي الأنابيب في 10، 000 × ز لمدة خمس دقائق. التعرق والتخلص من افرا و resuspend بيليه البكتيرية في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. بعد تكرار خطوات الغسيل مرة واحدة، الطرد المركزي الأنابيب مرة أخرى في 10، 000 X ز لمدة خمس دقائق.تجاهل supernatant و resuspend بيليه VLP البكتيريا في 150 ميكرولترات من 5٪ حظر العازلة. خطأ شائع يحدث هو أن يتم تبديل الأنابيب وإضافة العلاج الخاطئ. لمنع ذلك، وترتيب جميع الأنابيب في الخطوط التي تتوافق مع العلاج الصحيح وإضافة علاج واحد في كل مرة إلى الأنابيب.لكل عينة بكتيرية، إعداد 50 ميكرولترات من الجسم المضاد GII نوروفيروس الإنسان المخفف. باستخدام 5٪ العازلة، وتمييع الجسم المضاد واحد إلى 125 لعينات E.cloacae. إعداد 50 ميكرولترات من الجسم المضاد ايزوتيبي المخفف لكل عينة بكتيرية باستخدام نفس نسب التخفيف.قم بتقسيم كل عينة من عينات المقايسة الخاصة بالمرفق إلى 350 ميكرولتر أكوت عن طريق نقلها إلى أنابيب طرد مركزي نظيفة سعة 1.5 ملليلتر. لإنشاء عناصر تحكم غير ملوثة، أضف 50 ميكرولترات من العازلة العازلة للحظر إلى أول aliquot من كل عينة بكتيرية. للعينات الملطخة، إضافة 50 ميكرولترات من التخفيف من الجسم المضاد GII إلى المجموعة الثانية من aliquots.إنشاء عناصر تحكم isotype عن طريق إضافة 50 ميكرولترات من الجسم المضاد isotype المخفف إلى المجموعة الثالثة من aliquots. احتضان جميع العينات على الجليد وفي الظلام لمدة 30 دقيقة. ثم الطرد المركزي جميع العينات في 10، 000 X ز لمدة خمس دقائق.تجاهل supernatants وإعادة تعليق كل عينة في 150 ميكرولترات من FCSB. مرة أخرى، الطرد المركزي جميع العينات في 10، 000 X ز لمدة خمس دقائق. مرة أخرى، والتخلص من االهامات وإعادة تعليق العينات في 100 ميكرولترات من FCSB.بعد الطرد المركزي للعينات مرة واحدة في نهاية المطاف والتخلص من المواد الخارقة، resuspend العينات في 150 ميكرولترات من FCSB. نقل كل عينة إلى أنبوب يحتوي على 400 ميكرولترات من FCSB لحجم إجمالي 550 ميكرولترات. تخزين العينات في 4 درجة مئوية حتى يتم تحليلها عن طريق تدفق القياسات.تم قياس مرفق VLP باستخدام عملية استئصال التدفق. أولاً، استُخدمت قطع الكثافة لإخراج الحطام الخلوي، ثم تلتها عملية الإغراق اللاحقة في الأراضي النقطية لإزالة الازدواجية البكتيرية والكتل الخلوية. تظهر مخططات التكرار التمثيلي نقص إشارة PE في العينات البكتيرية فقط وتحول في كثافة إشارة PE في عينات VLP:bacterium مقارنة بعناصر التحكم غير المُطَهَقة والأيزوتيبي.بعد ساعة واحدة من الحضانة مع 10 ميكروغرام من VLP، اكتشاف تدفق cytometry الجسيمات ملزمة لكل من E.colacae و L.gasseri. لتحديد الحد من القياس الكمي الملزم لهذه الحسبة ، تم إنشاء سلسلة من تخفيف VLPs قبل إضافة إلى البكتيريا. أدى انخفاض في كمية VLP في تخفيضات المقابلة للبكتيريا في المئة ملزمة VLP.معرفة نسبة الفيروس:bacterium والحفاظ على نسبة متسقة بين التجارب مهم في تفسير النتائج. يمكن توليد طفرات بكتيرية وفيروسية لتحديد الهياكل السطحية الميكروبية التي تتوسط هذا التفاعل. هذه التقنية تسمح للباحثين بالإجابة على الأسئلة المتعلقة بالظروف والظروف التي تؤثر على التفاعلات البكتيرية في الفيروسة، بما في ذلك كيفية تغيير التغييرات في النمط الجيني للفيروسات، وظروف النمو البكتيرية، والتغيرات في الهياكل السطحية البكتيرية تغيير الربط الفيروسي.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

الإنسان في المختبر قمع وأداة الكشف عن الاعتراف للدولة في وقت مبكر من الخلل المناعي

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

طريقة بسيطة وفعالة لكشف النووية في تفعيل عامل العدلات الإنسان من قياس التدفق الخلوي

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

نماذج دورة حياة فيروس الايبولا تحت شروط السلامة الأحيائية المستوى 2 مع جزيئات تشبه الفيروسات يحتوي على Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

بروتوكول بسيطة وسريعة لغير إنزيمي فصل الطازجة الأنسجة البشرية لتحليل التسلل اللمفاويات

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry

خلايا الإنسان الجذعية الرئة: التوزيع المكاني والمظهري تحديد في داخل القصبة التحليلات عن طريق المناعية والتدفق الخلوي

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

قياس T خلية Alloreactivity عن طريق التصوير التدفق الخلوي

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

تحليل نوعي وكمي المشبك محصنة في النظام البشري باستخدام التصوير التدفق الخلوي

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

وصف مجموعات فرعية الوحيدات البشرية بالدم كله يتدفق التحليل الخلوي

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

إعداد نخاع العظام كله لتحليل الكتلة الخلايا من الخلايا العدلية النسب

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...