Name: quantifying human norovirus virus-like particles binding to commensal bacteria using flow cytometry
Uploaded: 2020-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry at JoVE.com

Vi vil gerne takke Sutonuka Bhar og Chanel Mosby-Haundrup for deres kritiske gennemgang af det skriftlige manuskript, samt Alfonso Carrillo for hjælp til at generere bakterielle standard kurver. Dette arbejde finansieres delvist af et tilskud fra National Institute of Health (R21AI140012) og af et frøtilskud fra University of Florida, Institute of Food and Agricultural Sciences.

BEMÆRK: De bakterievækstbetingelser, der er skitseret i protokollen, er standarddyrkningsbetingelser for Enterobacter cloacae og Lactobacillus gasseri. For at udføre virus:bakterier vedhæftet fil assay med andre bakteriearter, bør de valgte bakterier dyrkes under standard betingelser, der passer til bakterien.
1. Forberedelse bakterievækst Medium
<ol><li>
Enterobacter cloacae vækst medier<ol>
<li>Der fremstilles flydende medium ved at opløse 10 g tryptone, ...

<ol>
	<li>Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+global+burden+of+noroviruses+and+opportunities+for+prevention.">New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention.</a> Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).</li><li>Jones, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+bacteria+promote+human+and+mouse+norovirus+infection+of+B+cells.">Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells.</a> Science. 346 (6210), 755-759 (2014).</li><li>Baldridge, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commensal+microbes+and+interferon-lambda+determine+persistence+of+enteric+murine+norovirus+infection.">Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection.</a> Science. 347 (6219), 266-269 (2015).</li><li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterobacter+cloacae+inhibits+human+norovirus+infectivity+in+gnotobiotic+pigs.">Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs.</a> Scientific reports. 6, 25017 (2016).</li><li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Protective+Efficacy+of+Probiotics+and+Rice+Bran+against+Human+Norovirus+Infection+and+Diarrhea+in+Gnotobiotic+Pigs.">High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1699 (2016).</li><li>Rodr&#237;guez-D&#237;az, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+secretor+status+genotype+and+microbiota+composition+in+susceptibility+to+rotavirus+and+norovirus+infections+in+humans.">Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans.</a> Scientific Reports. 7, 45559 (2017).</li><li>Erickson, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+Facilitate+Enteric+Virus+Co-infection+of+Mammalian+Cells+and+Promote+Genetic+Recombination.">Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination.</a> Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).</li><li>Kuss, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+microbiota+promote+enteric+virus+replication+and+systemic+pathogenesis.">Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis.</a> Science. 334 (6053), 249-252 (2011).</li><li>Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lipopolysaccharide+binding+enhances+virion+stability+and+promotes+environmental+fitness+of+an+enteric+virus.">Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus.</a> Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).</li><li>Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+and+bacterial+envelope+components+enhance+mammalian+reovirus+thermostability.">Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability.</a> PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768 (2017).</li><li>Miura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histo-blood+group+antigen-like+substances+of+human+enteric+bacteria+as+specific+adsorbents+for+human+noroviruses.">Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses.</a> Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).</li><li>Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+norovirus+binding+to+select+bacteria+representative+of+the+human+gut+microbiota.">Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota.</a> PLOS One. 12 (3), (2017).</li><li>Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Related+enteric+viruses+have+different+requirements+for+host+microbiota+in+mice.">Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice.</a> Journal of Virology. , (2019).</li><li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids.">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li><li>Van Dycke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+human+norovirus+replication+model+in+zebrafish+larvae.">A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae.</a> PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009 (2019).</li><li>Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+to+histo-blood+group+antigen-expressing+bacteria+protects+human+norovirus+from+acute+heat+stress.">Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 659 (2015).</li><li>Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+norovirus+binding+to+gut-associated+bacterial+ligands.">Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands.</a> BMC Research Notes. 12 (1), 607 (2019).</li><li>Debbink, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within-host+evolution+results+in+antigenically+distinct+GII.4+noroviruses.">Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses.</a> Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).</li><li>Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Norwalk+virus-like+particles+to+ABH+histo-blood+group+antigens+is+blocked+by+antisera+from+infected+human+volunteers+or+experimentally+vaccinated+mice.">Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice.</a> Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).</li><li>Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+capture+with+histo-blood+group+antigens+reveals+novel+virus-ligand+interactions.">Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions.</a> Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).</li><li>Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GII.4+Human+Norovirus:+Surveying+the+Antigenic+Landscape.">GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape.</a> Viruses. 11 (2), (2019).</li><li>Prasad, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystallographic+structure+of+the+Norwalk+virus+capsid.">X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid.</a> Science. 286 (5438), 287-290 (1999).</li><li>Baric, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+self-assembly+of+norwalk+virus+capsid+protein+from+venezuelan+equine+encephalitis+virus+replicons.">Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons.</a> Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).</li><li>Rubio-del-Campo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noroviral+p-particles+as+an+in+vitro+model+to+assess+the+interactions+of+noroviruses+with+probiotics.">Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics.</a> PLOS One. 9 (2), 89586 (2014).</li><li>Tan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+modifications+of+norovirus+P+domain+resulted+in+a+new+type+of+subviral+particles,+the+small+P+particles.">Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles.</a> Virology. 410 (2), 345-352 (2011).</li></ol>

Evnen til at kvantificere binding af enteriske vira til bakterier er et kritisk første skridt for at belyse de mekanismer, som disse bakterier ændrer virusinfektion. De metoder, der er beskrevet heri, er blevet optimeret til at måle humane norovirus VLP interaktioner med både E. cloacae (gram-negative bakterie) og L. gasseri (et gram-positiv bakterie), men kan tilpasses til brug med pattedyr virus og bakterie af interesse. Mens VLPs er et ideelt alternativ til levend...

Human noroviruses (HuNoVs) er den hyppigste årsag til gastrointestinal sygdom på verdensplan, ansvarlig for 685 millioner infektioner og over 200.000 dødsfald hvert år1. Som med andre enteriske vira, tilstedeværelsen af kommensal bakterier har vist sig at øge infektion af dette patogen samt dens surrogat virus, murine norovirus2,3. Der er også modstridende rapporter om, at bakterier kan hæmme infektion med humannorovirus4,5,6. For flere vira synes den direkte interaktion mellem virus og bakterier at ligge til grund for de mekanismer, der påvirker virusinfektion2,7,8,9,10, og det er blevet vist gennem elektronmikroskopi, at humane norovira binder sig direkte til overfladen af bakterier ne11,12. Derfor, karakterisere disse interaktioner er blevet afgørende for at bestemme de mekanismer, som bakterier indvirkning virusinfektion. Denne karakteristik er klassisk begyndt med kvantificering af viral binding til en række bakteriearter , der er komponenter i værtsmikrobiomet7,12,13. Disse vedhæftede analyser ikke kun afsløre mængden af virus bundet til bakterier, men også støtte til bestemmelse af virkningen af denne interaktion på viral fitness og overlevelse.
For at kvantificere viral fastgørelse omfatter traditionelt anvendte metoder PCR-baserede analyser , som kvantificerer virale genomer12 eller genereringen af radioaktivt mærket virus og brugen af scintillationstælling til kvantificering af viruspartikler7,8,9,13. Anvendelsen af disse metoder kræver generelt adgang til lagre af virus med høj titer og in vitro-dyrkningsmetoder, som de kan anvendes til. Mens flere kultursystemer for humant norovirus nu findes2,14,15, ingen understøtter den robuste replikation kræves for at generere disse stærkt koncentrerede bestande, som begrænser eller eliminerer brugen af PCR og scintillation tælle at kvantificere menneskelige norovirus / bakterielle interaktioner.
For at omgå dette problem, virus-lignende partikler (VLPs) kan bruges som et surrogat til levende virus til at undersøge interaktioner mellem humannorovirus og bakterier16,17. VlPs er ikke-infektiøse partikler, der ligner den virus, som de er afledt af. I tilfælde af humannorovirus dannes disse partikler fra ekspressionen af VP1-proteinet (og engang VP2-proteinet), som selv samler for at skabe intakte virale kapeller, der mangler genetisk materiale (dvs. RNA for norovira). Disse VLP'er har været velkarakteriserede, er strukturelt og antigent magen til de vira af vildtypen , som de stammer fra18,19,20,21,22,23. Derfor, VLPs tjene som en ideel surrogat for at undersøge overfladen interaktioner mellem human norovirus og commensal bakterier. Da VLPs mangler genetisk materiale, kan PCR-baserede analyser ikke anvendes til kvantificering af viral binding. En antistofbaseret cytometrimetode blev tidligere beskrevet og i stand til at påvise lave niveauer af VLP-binding til bakterier på en semikvantitativ måde16. Denne metode blev optimeret til at muliggøre nøjagtig kvantificering af humant norovirus VLP binding til både gram-negative og gram-positive kommensal bakterier16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7002</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaeroPack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R681001</td>
			<td>Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FacsDiva software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1605</td>
			<td>Used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554657</td>
			<td>Used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12473281</td>
			<td>Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRS Powder</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>288130</td>
			<td>Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MA5-18241</td>
			<td>Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norovirus GII.4 VLP</td>
			<td>Creative Biostructure</td>
			<td>CBS-V700</td>
			<td>human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP665</td>
			<td>Dilute to 1X prior to use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S10467</td>
			<td>Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td>Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying human norovirus virus-like particles binding to commensal bacteria using flow cytometry

Commensal bakterier er veletableret til at påvirke infektion af eukaryote vira. Direkte binding mellem patogenet og værtsmikrobiomet er ansvarlig for at ændre infektion for mange af disse vira. Således, karakterisere karakteren af virus-bakterier bindende er et grundlæggende skridt er nødvendig for at belyse den mekanisme (r), som bakterier ændrer virusinfektion. For humannorovirus, tilsvarende bakterier øge B celle infektion. Virussen direkte binder sig til disse bakterier, hvilket indikerer, at denne direkte interaktion er involveret i mekanismen for infektion ekstraudstyr. En række teknikker kan anvendes til at kvantificere interaktioner mellem bakterier og vira, herunder scintillation stælling af radioaktivt mærkede vira og polymerase kædereaktion (PCR). Begge metoder kræver brug af levende virus, som kan være nødvendigt at generere i laboratoriet. I øjeblikket er ingen af de etablerede in vitro-kultursystemer til rådighed for humant norovirus robuste nok til at give mulighed for generering af stærkt koncentrerede viruslagre. I stedet for levende virus, virus-lignende partikler (VLPs) er blevet brugt til at karakterisere samspillet mellem norovirus og bakterier. Heri en flow cytometri metode er beskrevet med anvendelser virus specifikke antistoffer til at kvantificere VLP binding til gram-negative og gram-positive bakterier. Inddragelse af både bakterier kun og isotype kontrol tilladt for optimering af analysen for at reducere baggrunden antistof bindende og nøjagtig kvantificering af VLP vedhæftet fil til de testede bakterier. Høje VLP:bakterieforhold resulterer i, at VLPs binder sig til store procentdele af bakteriepopulationen. Men når VLP mængder er faldet, procent af bakterier bundet også falder. I sidste ende, denne metode kan anvendes i fremtidige eksperimenter belyse de specifikke betingelser og strukturelle komponenter, der regulerer norovirus: bakterielle interaktioner.

De gatingstrategier , der anvendes til at kvantificere humant norovirus VLP-binding til kommensalbakterier, er vist i figur 1. Repræsentativ densitetprik giver et overblik over, hvordan prøverne blev gated for at eliminere cellulære rester og celleklumper, så VLP-fastgørelseblev bestemt på enkelttpopulationer (figur 1A). Repræsentative histogrammer demonstrerer lave niveauer af anti-norovirus antistofsigna...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry at JoVE.com

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

Målet med denne protokol er at kvantificere bindingen af det eukaryote patogenhumane norovirus til bakterier. Efter at have udført en indledende virus-bakterie vedhæftet fil assay, flow cytometri bruges til at opdage viralt-bundet bakterier i befolkningen.

Kvantificering human norovirus virus-lignende partikler bindende for commensal bakterier ved hjælp af Flow cytometri

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

Virus-bakterielle interaktioner kan være vigtigt for en vellykket virusinfektion og stimulering af en vært immunrespons. Men i øjeblikket, stærkt koncentreret og renset bestand af humane norovirus kan ikke produceres i laboratoriet. Denne teknik kan bruges med enhver virus, der binder sig til bakterier, for hvilke enten virus-lignende partikler eller levende virus er tilgængelige.Det giver os mulighed for at kvantificere interaktioner mellem disse vira og bakterier. Inokuler fem milliliter flydende medium med en enkelt isoleret koloni Enterobacter cloacae fra en agar plade direkte fra frosne glycerol lager. Dyrk bakterierne natten over.Den følgende dag overføres 1,3 milliliter aliquots af kulturen i to separate 1,5 milliliter centrifugerør. Centrifuge rørene ved 10,000 x g i fem minutter. Fjern supernatanterne, og vask derefter prøverne to gange med en milliliter steril 1X PBS for hver vask.Centrifuge prøverne igen ved 10,000 x g i fem minutter. Fjern supernatanten og opsplit pellet i 1,3 milliliter steril 1X PBS. Begyndende med 0,5 milliliter vasket kultur, serielt fortyndes bakterierne i 1X PBS fra 10 til minus en til 10 til minus fire.Ved hjælp af et spektrofotometer måles den optiske tæthed af den vaskede ufortyndede kultur og hver af de fire fortyndinger ved 600 nanometer. Udfør 10 gange serielle fortyndinger i 1X PBS for hver af de tidligere fortyndinger. Der spredes 100 mikroliter af de sidste tre fortyndinger for hver serie på agarplader for at bestemme antallet af kolonidannende enheder pr. milliliter for hver prøve.Lad pladerne tørre ved stuetemperatur i fem minutter. Inverter pladerne og inkuber dem i inkubatoren. Efter klargøring af reagenser, antistoffer og bakterier som beskrevet i manuskriptet, samle alle materialer i en BSL-2 biosikkerhed kabinet.Viruslignende partikler til human norovirus er opført som BSL-2 patogener, og alt arbejde udføre ved hjælp af VLP bør udføres i et certificeret biosikkerhedsskab. Tilføj 10 mikrogram human norovirus VLPs til hvert rør af bakterier og bland grundigt ved pipettering. Inkuber rørene i en time ved 37 grader Celsius med konstant rotation.Efter inkubation centrifuger rørene ved 10,000 x g i fem minutter. Inspirer og kassér supernatanten og opslæmp bakteriepellet i en milliliter PBS. Efter at vasketrinnene er gentaget én gang, centrifugeres rørene igen ved 10.000 X g i fem minutter.Kassér supernatanten og opslæm vlp-bakteriepellet i 150 mikroliter med en buffer på 5 %. En almindelig fejl, der opstår, er, at rør byttes og den forkerte behandling er tilføjet. For at forhindre dette, arrangere alle rør i linjer, der svarer til den korrekte behandling og tilføje en behandling på én gang til rørene.For hver bakterieprøve tilberedes 50 mikroliter af fortyndet human norovirus GII-antistof. Ved hjælp af 5% blokerende buffer, fortyndes antistoffet en til 125 for E.cloacae prøver. Der klargør 50 mikroliter for fortyndet isotypeantistof for hver bakterieprøve ved hjælp af samme fortyndingsforhold.Hver fastgørelsesanalyseprøve opdeles i 350 mikroliter aliquots ved at overføre dem til rene 1,5 milliliter centrifugerør. Hvis du vil oprette uhæmmede kontrolelementer, skal du tilføje 50 mikroliter blokerende buffer til den første aliquot fra hver bakterieprøve. For de farvede prøver tilsættes 50 mikroliter af GII-antistoffortyndingen til det andet sæt aliquots.Isotypekontrollerne oprettes ved at tilsætte 50 mikroliter af det fortyndede isotypeantistof til det tredje sæt aliquots. Inkuber alle prøverne på is og i mørke i 30 minutter. Derefter centrifugeres alle prøverne ved 10.000 X g i fem minutter.Kassér supernatanterne, og opspjælret hver prøve i 150 mikroliter af FCSB. Igen, centrifuge alle prøverne på 10, 000 X g i fem minutter. Igen, kassere supernatants og resuspend prøverne i 100 mikroliter af FCSB.Efter centrifugering af prøverne en sidste gang og kassering af supernatanterne opsplitning prøverne i 150 mikroliter af FCSB. Hver prøve overføres til et rør med 400 mikroliter FCSB for et samlet volumen på 550 mikroliter. Opbevar prøverne ved 4 grader Celsius, indtil de analyseres ved flowcytometri.VLP-tilbehør blev målt ved hjælp af flowcytometri. For det første blev tæthed plots brugt til at gate ud cellulære vragrester, efterfulgt af efterfølgende prik plot gating at fjerne bakterielle doublets og cellulære klumper. Repræsentative histogrammer udviser mangel på PE-signal i bakterieprøver og et skift i PE-signalintensiteten i VLP:bakterieprøver sammenlignet med uindgroede og isotypekontroller.Efter en times inkubation med 10 mikrogram VLP detekteres flowcytometri partikelbinding til både E.colacae og L.gasseri. For at bestemme grænsen for bindende kvantificering for denne analyse blev der genereret en fortyndingsserie af VIP'erne før tilføjelsen til bakterierne. Reduktioner i mængden af VLP resulterede i tilsvarende reduktioner til den procent bakterier bundet af VLP.Kendskab til virus: bakterie forholdet og holde forholdet konsistent mellem eksperimenter er vigtigt at fortolke resultater. Bakterielle og virale mutanter kan genereres til specifikt at bestemme de mikrobielle overfladestrukturer, der mægle denne interaktion. Denne teknik giver forskerne mulighed for at besvare spørgsmål om omstændigheder og betingelser, der påvirker norovirus-bakterielle interaktioner, herunder hvordan ændringer i virus genotype, bakteriel vækstbetingelser, og ændringer i bakterielle overfladestrukturer ændre viral binding.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

En enkel og effektiv metode til at påvise Nuclear Factor Aktivering i humane neutrofiler ved flowcytometri

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Modeling Lifecycle af Ebola virus Under biosikkerhedsniveau 2 Betingelser med virus-lignende partikler indeholdende Tetracistronic minigenomer

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

En enkel og hurtig protokol til ikke-enzymatisk dissociere frisk humant væv til analyse af lymfocytter

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry

Humane Lung dendritiske celler: Rumlig Distribution og Fænotypisk Identifikation i endobronchial Biopsier Brug Immunhistokemi og flowcytometri

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Måling af T-celle alloreaktivitet Brug Imaging flowcytometri

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Kvalitativ og kvantitativ analyse af den immun Synapse i det menneskelige System, ved hjælp af Imaging flowcytometri

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation og In Vitro kultur af Murine og menneskelige alveolær makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Karakterisering af humane monocyt delmængder af fuldblod Flow flowcytometri analyse

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Fremstilling af hele knoglemarv til masse cytometri analyse af neutrofile-Lineage celler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...