Name: quantifying human norovirus virus-like particles binding to commensal bacteria using flow cytometry
Uploaded: 2020-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry at JoVE.com

Wir danken Sutonuka Bhar und Chanel Mosby-Haundrup für ihre kritische Überprüfung des schriftlichen Manuskripts sowie Alfonso Carrillo für die Unterstützung bei der Erzeugung bakterieller Standardkurven. Diese Arbeit wird zum Teil durch ein Stipendium des National Institute of Health (R21AI140012) und durch ein Saatgutstipendium der University of Florida, Institute of Food and Agricultural Sciences, finanziert.

HINWEIS: Die im Protokoll beschriebenen bakteriellen Wachstumsbedingungen sind Standardkulturbedingungen für Enterobacter cloacae und Lactobacillus gasseri. Um das Virus durchzuführen: Bakterien-Anhang assay mit anderen Bakterienarten, sollten die ausgewählten Bakterien unter Standardbedingungen für das Bakterium geeignet kultiviert werden.
1. Vorbereitung bakterielles Wachstumsmedium
<ol><li>
Enterobacter cloacae Wachstumsmedien<ol>
<li>Bereiten Sie flüssiges...

<ol>
	<li>Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+global+burden+of+noroviruses+and+opportunities+for+prevention.">New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention.</a> Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).</li><li>Jones, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+bacteria+promote+human+and+mouse+norovirus+infection+of+B+cells.">Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells.</a> Science. 346 (6210), 755-759 (2014).</li><li>Baldridge, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commensal+microbes+and+interferon-lambda+determine+persistence+of+enteric+murine+norovirus+infection.">Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection.</a> Science. 347 (6219), 266-269 (2015).</li><li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterobacter+cloacae+inhibits+human+norovirus+infectivity+in+gnotobiotic+pigs.">Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs.</a> Scientific reports. 6, 25017 (2016).</li><li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Protective+Efficacy+of+Probiotics+and+Rice+Bran+against+Human+Norovirus+Infection+and+Diarrhea+in+Gnotobiotic+Pigs.">High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1699 (2016).</li><li>Rodr&#237;guez-D&#237;az, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+secretor+status+genotype+and+microbiota+composition+in+susceptibility+to+rotavirus+and+norovirus+infections+in+humans.">Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans.</a> Scientific Reports. 7, 45559 (2017).</li><li>Erickson, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+Facilitate+Enteric+Virus+Co-infection+of+Mammalian+Cells+and+Promote+Genetic+Recombination.">Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination.</a> Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).</li><li>Kuss, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+microbiota+promote+enteric+virus+replication+and+systemic+pathogenesis.">Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis.</a> Science. 334 (6053), 249-252 (2011).</li><li>Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lipopolysaccharide+binding+enhances+virion+stability+and+promotes+environmental+fitness+of+an+enteric+virus.">Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus.</a> Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).</li><li>Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+and+bacterial+envelope+components+enhance+mammalian+reovirus+thermostability.">Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability.</a> PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768 (2017).</li><li>Miura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histo-blood+group+antigen-like+substances+of+human+enteric+bacteria+as+specific+adsorbents+for+human+noroviruses.">Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses.</a> Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).</li><li>Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+norovirus+binding+to+select+bacteria+representative+of+the+human+gut+microbiota.">Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota.</a> PLOS One. 12 (3), (2017).</li><li>Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Related+enteric+viruses+have+different+requirements+for+host+microbiota+in+mice.">Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice.</a> Journal of Virology. , (2019).</li><li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids.">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li><li>Van Dycke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+human+norovirus+replication+model+in+zebrafish+larvae.">A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae.</a> PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009 (2019).</li><li>Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+to+histo-blood+group+antigen-expressing+bacteria+protects+human+norovirus+from+acute+heat+stress.">Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 659 (2015).</li><li>Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+norovirus+binding+to+gut-associated+bacterial+ligands.">Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands.</a> BMC Research Notes. 12 (1), 607 (2019).</li><li>Debbink, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within-host+evolution+results+in+antigenically+distinct+GII.4+noroviruses.">Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses.</a> Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).</li><li>Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Norwalk+virus-like+particles+to+ABH+histo-blood+group+antigens+is+blocked+by+antisera+from+infected+human+volunteers+or+experimentally+vaccinated+mice.">Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice.</a> Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).</li><li>Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+capture+with+histo-blood+group+antigens+reveals+novel+virus-ligand+interactions.">Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions.</a> Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).</li><li>Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GII.4+Human+Norovirus:+Surveying+the+Antigenic+Landscape.">GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape.</a> Viruses. 11 (2), (2019).</li><li>Prasad, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystallographic+structure+of+the+Norwalk+virus+capsid.">X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid.</a> Science. 286 (5438), 287-290 (1999).</li><li>Baric, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+self-assembly+of+norwalk+virus+capsid+protein+from+venezuelan+equine+encephalitis+virus+replicons.">Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons.</a> Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).</li><li>Rubio-del-Campo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noroviral+p-particles+as+an+in+vitro+model+to+assess+the+interactions+of+noroviruses+with+probiotics.">Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics.</a> PLOS One. 9 (2), 89586 (2014).</li><li>Tan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+modifications+of+norovirus+P+domain+resulted+in+a+new+type+of+subviral+particles,+the+small+P+particles.">Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles.</a> Virology. 410 (2), 345-352 (2011).</li></ol>

Die Fähigkeit, die Bindung von enterischen Viren an Bakterien zu quantifizieren, ist ein entscheidender erster Schritt, um die Mechanismen aufzuklären, mit denen diese Bakterien eine Virusinfektion verändern. Die hier beschriebenen Methoden wurden optimiert, um menschliche Norovirus-VLP-Wechselwirkungen mit E. cloacae (gramnegatives Bakterium) und L. gasseri (ein grampositives Bakterium) zu messen, können aber für die Verwendung mit jedem Säugetiervirus und Bakteri...

Humane Noroviren (HuNoVs) sind die Hauptursache für Magen-Darm-Erkrankungen weltweit, verantwortlich für 685 Millionen Infektionen und über 200.000 Todesfälle pro Jahr1. Wie bei anderen enterischen Viren, das Vorhandensein von kommensalen Bakterien hat gezeigt, dass die Infektion dieses Erregers sowie sein Ersatzvirus, murines Norovirus2,3zu verbessern. Es gibt auch widersprüchliche Berichte, dass Bakterien infektiondurch menschliche sonrovirushemmenkönnen 4,5,6. Bei mehreren Viren scheint die direkte Interaktion zwischen dem Virus und Bakterien den Mechanismen zugrunde zu liegen, die dieVirusinfektion2,7,8,9,10, und es wurde durch Elektronenmikroskopie gezeigt, dass menschliche Noroviren direkt an die Oberflächen von Bakterien binden11,12. Daher ist die Charakterisierung dieser Wechselwirkungen entscheidend für die Bestimmung der Mechanismen geworden, durch die Bakterien die Virusinfektion beeinflussen. Diese Charakterisierung hat klassisch mit der Quantifizierung der viralen Bindung an eine Reihe von Bakterienarten begonnen, die Bestandteile des Wirtsmikrobioms7,12,13sind. Diese Anhang Assays offenbaren nicht nur die Menge an Virus an Bakterien gebunden, sondern auch helfen bei der Bestimmung der Auswirkungen dieser Interaktion auf virale Fitness und Überleben.
Zur Quantifizierung der viralen Anhaftung umfassen traditionell verwendete Methoden PCR-basierte Assays, die virale Genome12 oder die Erzeugung von radioaktiv markierten Viren quantifizieren, und die Verwendung von Szintillationszählungen zur Quantifizierung viraler Teilchen7,8,9,13. Die Anwendung dieser Methoden erfordert in der Regel den Zugang zu Beständen mit hohem Titervirus und In-vitro-Anbautechniken, mit denen sie erzeugt werden können. Während mehrere Kultursysteme für menschliches Norovirus jetzt2,14,15, keines unterstützt die robuste Replikation erforderlich, um diese hochkonzentrierten Bestände zu generieren, die die Verwendung von PCR und Szintillationszählung begrenzt oder eliminiert, um menschliche Norovirus/Bakterien-Wechselwirkungen zu quantifizieren.
Um dieses Problem zu umgehen, können virusähnliche Partikel (VLPs) als Ersatz für lebende Viren verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen menschlichen Noroviren und Bakterien zu untersuchen16,17. VLPs sind nicht-infektiöse Partikel, die dem Virus, von dem sie abgeleitet werden, sehr ähnlich sind. Beim menschlichen Norovirus werden diese Teilchen aus der Expression des VP1-Proteins (und irgendwann des VP2-Proteins) erzeugt, das sich selbst zusammensetzt, um intakte virale Kapsiden ohne genetisches Material (d.h. RNA für Noroviren) zu erzeugen. Diese VLPs sind gut charakterisiert, sind strukturell und antigen ähnlich wie die Wildtypviren, von denen sie abgeleitet sind18,19,20,21,22,23. Daher dienen VLPs als ideales Ersatzfürst, um die Oberflächenwechselwirkungen zwischen humanen Noroviren und Kommensalen zu untersuchen. Da VLPs an genetischem Material fehlen, können PCR-basierte Assays nicht zur Quantifizierung der viralen Bindung verwendet werden. Eine Antikörper-basierte Durchflusszytometrie-Methode wurde zuvor beschrieben und konnte niedrige KONZENTRATIONen von VLP-Bindung an Bakterien semiquantitativ erkennen16. Diese Methode wurde optimiert, um eine genaue Quantifizierung der menschlichen Norovirus-VLP-Bindung an gramnegative und grampositive Commensalbakterien zu ermöglichen16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7002</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaeroPack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R681001</td>
			<td>Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FacsDiva software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1605</td>
			<td>Used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554657</td>
			<td>Used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12473281</td>
			<td>Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRS Powder</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>288130</td>
			<td>Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MA5-18241</td>
			<td>Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norovirus GII.4 VLP</td>
			<td>Creative Biostructure</td>
			<td>CBS-V700</td>
			<td>human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP665</td>
			<td>Dilute to 1X prior to use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S10467</td>
			<td>Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td>Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying human norovirus virus-like particles binding to commensal bacteria using flow cytometry

Commensal Bakterien sind gut etabliert, um Infektion von eukaryotischen Viren zu beeinflussen. Die direkte Bindung zwischen dem Erreger und dem Wirtsmikrobiom ist für die Veränderung der Infektion für viele dieser Viren verantwortlich. Daher ist die Charakterisierung der Natur der Virus-Bakterien-Bindung ein grundlegender Schritt, der notwendig ist, um den Mechanismus(n) aufzuklären, durch den Bakterien eine Virusinfektion verändern. Für menschliche norovirus, kommensale Bakterien verbessern B-Zell-Infektion. Das Virus bindet direkt an diese Bakterien, was darauf hindeutet, dass diese direkte Interaktion in den Mechanismus der Infektion Verbesserung beteiligt ist. Eine Vielzahl von Techniken kann verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen Bakterien und Viren zu quantifizieren, einschließlich Szintillationszählung von radioaktiv markierten Viren und Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Beide Methoden erfordern die Verwendung von live-Virus, die möglicherweise im Labor erzeugt werden müssen. Derzeit ist keines der etablierten In-vitro-Kultursysteme, die für humane Noroviren verfügbar sind, robust genug, um die Erzeugung hochkonzentrierter Virusbestände zu ermöglichen. Anstelle von lebenden Viren wurden virusähnliche Partikel (VLPs) verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen Norovirus und Bakterien zu charakterisieren. Hierbei wird eine Durchflusszytometriemethode mit virusspezifischen Antikörpern beschrieben, um die VLP-Bindung an gramnegative und grampositive Bakterien zu quantifizieren. Die Einbeziehung sowohl von Bakterien als auch isotypischer Kontrollen ermöglichte die Optimierung des Assays, um die Hintergrundantikörperbindung und die genaue Quantifizierung der VLP-Bindung an die getesteten Bakterien zu reduzieren. Hohe VLP:Bakterien-Verhältnisse führen dazu, dass VLPs an große Prozentsätze der Bakterienpopulation binden. Wenn jedoch die VLP-Mengen verringert werden, nimmt auch der Anteil der gebundenen Bakterien ab. Letztlich kann diese Methode in zukünftigen Experimenten verwendet werden, um die spezifischen Bedingungen und strukturellen Komponenten zu klären, die norovirus regulieren: bakterielle Wechselwirkungen.

Die Gating-Strategien zur Quantifizierung der menschlichen Norovirus-VLP-Bindung an commensale Bakterien sind in Abbildung 1dargestellt. Repräsentativer Dichtepunkt bietet einen Überblick darüber, wie Proben abgezäutt wurden, um Zellablagerungen und Zellklumpen zu beseitigen, so dass die VLP-Befestigung auf Singlet-Populationen bestimmt wurde (Abbildung 1A). Repräsentative Histogramme zeigen niedrige Konzent...

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Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

Ziel dieses Protokolls ist es, die Bindung des eukaryotischen Erregers humanes Norovirus an Bakterien zu quantifizieren. Nach der Durchführung eines ersten Virus-Bakterium-Anhang-Assays wird die Durchflusszytometrie verwendet, um viral gebundene Bakterien in der Population zu erkennen.

Quantifizierung der menschlichen Norovirus-Virus-ähnlichen Partikelbindung an commensale Bakterien mittels Durchflusszytometrie

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

Virusbakterielle Wechselwirkungen können für eine erfolgreiche Virusinfektion und Stimulation einer Wirtsimmunantwort wichtig sein. Aber derzeit können hochkonzentrierte und gereinigte Bestände an humanem Norovirus nicht im Labor produziert werden. Diese Technik kann mit jedem Virus verwendet werden, der an Bakterien bindet, für die entweder virusähnliche Partikel oder lebende Viren zur Verfügung stehen.Es ermöglicht uns, Wechselwirkungen zwischen diesen Viren und Bakterien zu quantifizieren. Impfen Sie fünf Milliliter flüssiges Medium mit einer einzigen isolierten Kolonie Enterobacter Cloacae von einer Agarplatte direkt aus gefrorenem Glycerinbestand. Wachsen Sie die Bakterien über Nacht.Am nächsten Tag 1,3 Milliliter Aliquots der Kultur in zwei separate 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhren übertragen. Zentrifugieren Sie die Rohre fünf Minuten lang bei 10.000 x g. Entfernen Sie die Überräube, und waschen Sie die Proben dann zweimal mit einem Milliliter steriler 1X PBS für jede Wäsche.Zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang wieder bei 10.000 x g. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1,3 Milliliter steriler 1X PBS wieder auf. Beginnend mit 0,5 Milliliter gewaschener Kultur, verdünnen Sie die Bakterien in 1X PBS von 10 auf minus eins bis 10 bis minus vier.Messen Sie mit einem Spektralphotometer die optische Dichte der gewaschenen unverdünnten Kultur und jede der vier Verdünnungen bei 600 Nanometern. Führen Sie 10-fache serielle Verdünnungen in 1X PBS für jede der vorherigen Verdünnungen durch. Verteilen Sie 100 Mikroliter der letzten drei Verdünnungen für jede Serie auf Agarplatten, um die Anzahl der koloniebildenden Einheiten pro Milliliter pro Probe zu bestimmen.Lassen Sie die Platten bei Raumtemperatur fünf Minuten trocknen. Invertieren Sie die Platten und inkubieren Sie sie im Inkubator. Nach der Herstellung der Reagenzien, Antikörper und Bakterien, wie im Manuskript beschrieben, montieren Sie alle Materialien in einem BSL-2 Biosicherheitsschrank.Virusähnliche Partikel für humane Noroviren sind als BSL-2-Erreger gelistet, und alle Arbeiten, die mit VLP durchgeführt werden, sollten in einem zertifizierten Biosicherheitsschrank durchgeführt werden. Fügen Sie 10 Mikrogramm menschliche Norovirus-VLPs zu jeder Röhre von Bakterien hinzu und mischen Sie sie gründlich durch Pipettieren. Inkubieren Sie die Rohre für eine Stunde bei 37 Grad Celsius mit konstanter Rotation.Zentrifugieren Sie die Rohre nach der Inkubation fünf Minuten lang bei 10.000 x g. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das bakterielle Pellet in einem Milliliter PBS wieder auf. Nachdem Sie die Waschschritte einmal wiederholt haben, zentrieren Sie die Rohre fünf Minuten lang wieder bei 10.000 X g.Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das VLP-Bakterienpellet in 150 Mikroliter5%Sperrpuffer wieder aus. Ein häufiger Fehler, der auftritt, ist, dass Rohre ausgetauscht werden und die falsche Behandlung hinzugefügt wird. Um dies zu verhindern, ordnen Sie alle Rohre in Linien an, die der richtigen Behandlung entsprechen, und fügen Sie den Röhren eine Behandlung auf einmal hinzu.Für jede bakterielle Probe 50 Mikroliter verdünnter humaner Norovirus-GII-Antikörper zubereiten. Verdünnen Sie den Antikörper mit 5% Blockierpuffer 1 bis 125 für E.cloacae-Proben. Bereiten Sie 50 Mikroliter verdünnten Isotyp-Antikörpers für jede Bakterielle Probe mit den gleichen Verdünnungsverhältnissen vor.Teilen Sie jede Befestigungsprobe in 350 Mikroliter-Aliquots auf, indem Sie sie in saubere 1,5 Milliliter Zentrifugenrohre übertragen. Um ungefärbte Steuerelemente zu erstellen, fügen Sie dem ersten Aliquot aus jeder Bakterienprobe 50 Mikroliter Blockierpuffer hinzu. Für die gefärbten Proben 50 Mikroliter der GII-Antikörperverdünnung zu dem zweiten Satz von Aliquots hinzufügen.Erstellen Sie die Isotyp-Steuerelemente, indem Sie 50 Mikroliter des verdünnten Isotyp-Antikörpers zu dem dritten Satz von Aliquots hinzufügen. Alle Proben auf Eis und im Dunkeln 30 Minuten lang bebrüten. Dann zentrifugieren Sie alle Proben bei 10.000 X g für fünf Minuten.Entsorgen Sie die Überräube und setzen Sie jede Probe in 150 Mikroliter FCSB wieder aus. Wiederum Zentrifugieren Sie alle Proben bei 10.000 X g für fünf Minuten. Verwerfen Sie erneut die Überräube und setzen Sie die Proben in 100 Mikroliter FCSB wieder aus.Nachdem Sie die Proben ein letztes Mal zentrifugiert und die Überstande entsorgt haben, setzen Sie die Proben in 150 Mikroliter FCSB wieder aus. Übertragen Sie jede Probe in ein Rohr mit 400 Mikroliter FCSB für ein Gesamtvolumen von 550 Mikrolitern. Bewahren Sie die Proben bei 4 Grad Celsius auf, bis sie durch Durchflusszytometrie analysiert werden.Die VLP-Befestigung wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen. Zuerst wurden Dichtediagramme verwendet, um zelluläre Trümmer auszukleben, gefolgt von nachfolgenden Punktdiagramm-Gating, um bakterielle Doublets und Zellklumpen zu entfernen. Repräsentative Histogramme zeigen einen Mangel an PE-Signal in bakteriellen Proben und eine Verschiebung der PE-Signalintensität in VLP:Bakteriumproben im Vergleich zu ungefärbten und Isotyp-Kontrollen.Nach einer Stunde Inkubation mit 10 Mikrogramm VLP wurde die Durchflusszytometrie partikelbindend an E.colacae und L.gasseri nachgewiesen. Um die Grenze der Bindungsquantifizierung für diesen Test zu bestimmen, wurde vor der Zugabe zu den Bakterien eine Verdünnungsreihe der VLPs erzeugt. Die Verringerung der VLP-Menge führte zu entsprechenden Reduktionen der durch VLP gebundenen Prozentbakterien.Das Virus:Bakterium-Verhältnis zu kennen und das Verhältnis zwischen den Experimenten konsistent zu halten, ist wichtig für die Interpretation der Ergebnisse. Bakterielle und virale Mutanten können erzeugt werden, um gezielt die mikrobiellen Oberflächenstrukturen zu bestimmen, die diese Wechselwirkung vermitteln. Diese Technik ermöglicht es Forschern, Fragen zu Umständen und Bedingungen zu beantworten, die Norovirus-Bakterien-Wechselwirkungen beeinflussen, einschließlich, wie Veränderungen des Virusgenotyps, bakterielle Wachstumsbedingungen und Veränderungen in bakteriellen Oberflächenstrukturen die virale Bindung verändern.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Mensch In Vitro Suppression als Screening-Tool für die Anerkennung von Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Eine einfache und effiziente Methode, um Nuclear Factor Aktivierung in menschlichen Neutrophilen Erkennen von Durchflusszytometrie

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Modellierung des Lebenszyklus von Ebola Virus unter Biosafety Level 2 Bedingungen mit Virus-ähnlichen Partikeln, die Tetracistronic Minigenome

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

Eine einfache und schnelle Protokoll zum Nicht enzymatisch Dissociate Frische menschlichen Geweben zur Analyse der infiltrierenden Lymphozyten

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry

Menschliche Lunge Dendritische Zellen: Räumliche Verteilung und phänotypische Identifizierung in Endobronchial Biopsien mittels Immunhistochemie und Durchflusszytometrie

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Die Messung der T-Zell-Alloreaktivität Mit Imaging Durchflusszytometrie

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Qualitative und Quantitative Analyse der immun Synapse im menschlichen System mit Hilfe von Imaging Durchflusszytometrie

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Charakterisierung der menschliche Monocyte Teilmengen von Vollblut Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Vorbereitung des ganzen Knochenmarks für die Mass Cytometry Analyse von Neutrophilen-Linienzellen

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...