Name: quantifying human norovirus virus-like particles binding to commensal bacteria using flow cytometry
Uploaded: 2020-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry at JoVE.com

היינו רוצים להודות לסוטונקה בהאר ולשנל מוסבי-רדיפות על הסקירה הקריטית של כתב היד הכתוב, כמו גם אלפונסו קאריו לסיוע ביצירת עקומות סטנדרטיות חיידקית. עבודה זו ממומנת בחלקו על ידי מענק מן המכון הלאומי לבריאות (R21AI140012) ועל ידי מענק זרע מאוניברסיטת פלורידה, המכון למזון ומדעי החקלאות.

הערה: תנאי הגדילה החיידקיים המתוארים בפרוטוקול הם תנאי התרבות הסטנדרטיים עבור מתקני הצמיחה של החברה ולקטטבק. Lactobacillus gasseri כדי לבצע את הווירוס: בקטריה מצורף שיטת עם מינים חיידקיים אחרים, החיידקים שנבחרו צריך להיות תרבותי תחת תנאים סטנדרטיים המתאימים לחיידק.
1. הכנת ב...

<ol>
	<li>Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+global+burden+of+noroviruses+and+opportunities+for+prevention.">New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention.</a> Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).</li><li>Jones, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+bacteria+promote+human+and+mouse+norovirus+infection+of+B+cells.">Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells.</a> Science. 346 (6210), 755-759 (2014).</li><li>Baldridge, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commensal+microbes+and+interferon-lambda+determine+persistence+of+enteric+murine+norovirus+infection.">Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection.</a> Science. 347 (6219), 266-269 (2015).</li><li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterobacter+cloacae+inhibits+human+norovirus+infectivity+in+gnotobiotic+pigs.">Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs.</a> Scientific reports. 6, 25017 (2016).</li><li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Protective+Efficacy+of+Probiotics+and+Rice+Bran+against+Human+Norovirus+Infection+and+Diarrhea+in+Gnotobiotic+Pigs.">High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1699 (2016).</li><li>Rodr&#237;guez-D&#237;az, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+secretor+status+genotype+and+microbiota+composition+in+susceptibility+to+rotavirus+and+norovirus+infections+in+humans.">Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans.</a> Scientific Reports. 7, 45559 (2017).</li><li>Erickson, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+Facilitate+Enteric+Virus+Co-infection+of+Mammalian+Cells+and+Promote+Genetic+Recombination.">Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination.</a> Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).</li><li>Kuss, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+microbiota+promote+enteric+virus+replication+and+systemic+pathogenesis.">Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis.</a> Science. 334 (6053), 249-252 (2011).</li><li>Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lipopolysaccharide+binding+enhances+virion+stability+and+promotes+environmental+fitness+of+an+enteric+virus.">Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus.</a> Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).</li><li>Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+and+bacterial+envelope+components+enhance+mammalian+reovirus+thermostability.">Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability.</a> PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768 (2017).</li><li>Miura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histo-blood+group+antigen-like+substances+of+human+enteric+bacteria+as+specific+adsorbents+for+human+noroviruses.">Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses.</a> Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).</li><li>Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+norovirus+binding+to+select+bacteria+representative+of+the+human+gut+microbiota.">Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota.</a> PLOS One. 12 (3), (2017).</li><li>Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Related+enteric+viruses+have+different+requirements+for+host+microbiota+in+mice.">Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice.</a> Journal of Virology. , (2019).</li><li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids.">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li><li>Van Dycke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+human+norovirus+replication+model+in+zebrafish+larvae.">A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae.</a> PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009 (2019).</li><li>Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+to+histo-blood+group+antigen-expressing+bacteria+protects+human+norovirus+from+acute+heat+stress.">Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 659 (2015).</li><li>Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+norovirus+binding+to+gut-associated+bacterial+ligands.">Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands.</a> BMC Research Notes. 12 (1), 607 (2019).</li><li>Debbink, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within-host+evolution+results+in+antigenically+distinct+GII.4+noroviruses.">Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses.</a> Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).</li><li>Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Norwalk+virus-like+particles+to+ABH+histo-blood+group+antigens+is+blocked+by+antisera+from+infected+human+volunteers+or+experimentally+vaccinated+mice.">Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice.</a> Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).</li><li>Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+capture+with+histo-blood+group+antigens+reveals+novel+virus-ligand+interactions.">Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions.</a> Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).</li><li>Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GII.4+Human+Norovirus:+Surveying+the+Antigenic+Landscape.">GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape.</a> Viruses. 11 (2), (2019).</li><li>Prasad, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystallographic+structure+of+the+Norwalk+virus+capsid.">X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid.</a> Science. 286 (5438), 287-290 (1999).</li><li>Baric, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+self-assembly+of+norwalk+virus+capsid+protein+from+venezuelan+equine+encephalitis+virus+replicons.">Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons.</a> Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).</li><li>Rubio-del-Campo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noroviral+p-particles+as+an+in+vitro+model+to+assess+the+interactions+of+noroviruses+with+probiotics.">Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics.</a> PLOS One. 9 (2), 89586 (2014).</li><li>Tan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+modifications+of+norovirus+P+domain+resulted+in+a+new+type+of+subviral+particles,+the+small+P+particles.">Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles.</a> Virology. 410 (2), 345-352 (2011).</li></ol>

היכולת לכמת כריכת וירוסים לחיידקים מהווה צעד ראשון קריטי להסבר המנגנונים שבהם חיידקים אלה משנים זיהום נגיפי. השיטות המתוארות במסמך זה היו ממוטבות למדוד אינטראקציות אנושיות של ה-VIP של האדם עם שניהם E. cloacae (חיידק גראם שלילי) ו -L. gasseri (חיידק גרם-חיובי), אבל יכול להיו?...

האדם noroviruses (HuNoVs) הם הגורם המוביל של מחלת העיכול ברחבי העולם, אחראי על 685,000,000 זיהומים ומעל 200,000 מקרי מוות בכל שנה1. כמו עם וירוסים אחרים חיטוט, הנוכחות של חיידקים המ, הוכח לשפר את הזיהום של הפתוגן הזה, כמו גם וירוס פונדקאית שלה, מורטין norovirus2,3. ישנם גם דיווחים סותרים כי חיידקים עשויים לעכב זיהום על ידי האדם norovirus4,5,6. עבור מספר וירוסים, אינטראקציה ישירה בין הנגיף לבין החיידקים מופיעים באופן מיני המנגנונים המשפיעים על זיהום נגיפי2,7,8,9,10, וזה הוכח באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני כי noroviruses אנושיים לאגד ישירות על פני השטח של חיידקים11,12. לכן, אפיון אינטראקציות אלה הפכה לקריטית כדי לקבוע את המנגנונים שבהם החיידק משפיע על זיהום נגיפי. אפיון זה התחיל באופן קלאסי עם כבילה ויראלי הכריכה למערך של מינים חיידקיים, כי הם מרכיבים של המארחים מיקרובידום7,12,13. ההחזקה הזאת טוענת לא רק לחשוף את כמות הווירוס מאוגד חיידקים, אלא גם לסייע בקביעת ההשפעה של האינטראקציה הזאת על כושר והישרדות נגיפי.
כדי לכמת מצורף ויראלי, שיטות מועסקים באופן מסורתי כוללים מבוסס PCR המבוסס איזה מכמת ויראלי גנום12 או הדור של וירוס רדיויניום ושימוש בטעמים שונים לכמת חלקיקים ויראלי7,8,9,13. השימוש בשיטות אלה מחייב בדרך כלל גישה למניות וירוסים באיכות גבוהה ובטכניקות טיפוח-תרגול של מבחנה. בעוד מספר מערכות התרבות עבור norovirus האדם כעת קיימים2,14,15, ללא תמיכה שכפול חזק הנדרש כדי ליצור אלה מניות מרוכז מאוד אשר מגביל או מבטלת את השימוש ב-PCR ו הספירה לספור לכמת האנושית norovirus/אינטראקציות בקטריאלי.
כדי לעקוף בעיה זו, חלקיקים כמו וירוס (אחמי ם) ניתן להשתמש כפונדקאית כדי לחיות וירוס לחקור אינטראקציות בין האדם norovirus וחיידקים16,17. אחמי ם הם חלקיקים לא מדבקים הדומים מאוד לוירוס שממנו הם נגזרים. במקרה של norovirus אנושי, חלקיקים אלה מופקים מן הביטוי של VP1 (ומתישהו VP2) חלבון, אשר להרכיב את עצמי ליצור הקפיסידים ויראלי ללא פגע חסר חומר גנטי (כלומר, RNA עבור norovirus). האח מים האלה היו מאופיינים היטב, הם באופן מבנית ואנטי בדומה וירוסים בסוג פראי מהם הם נגזר18,19,20,21,22,23. לכן, אחמי ם משמשים כתחליף אידיאלי לחקירת האינטראקציות של פני השטח בין חיידקי הנגיף האנושי לבין חיידק הקומנדאני. , בהתחשב בעובדה שאין בנמצא חומר גנטי. מבוסס PCR לא יכול לשמש לכמת כריכה נגיפית מבוסס נוגדן זרימה cy, השיטה תוארה בעבר היה מסוגל לזהות רמות נמוכות של איגוד ה-VIP לחיידקים בדרך חצי כמותית16. שיטה זו היתה ממוטבת כדי לאפשר כימות מדויק של כריכת האח מים של norovirus האנושי לשני גרם שלילי ו גראם בקטריה החיידק16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7002</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaeroPack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R681001</td>
			<td>Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FacsDiva software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1605</td>
			<td>Used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554657</td>
			<td>Used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12473281</td>
			<td>Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRS Powder</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>288130</td>
			<td>Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MA5-18241</td>
			<td>Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norovirus GII.4 VLP</td>
			<td>Creative Biostructure</td>
			<td>CBS-V700</td>
			<td>human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP665</td>
			<td>Dilute to 1X prior to use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S10467</td>
			<td>Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td>Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying human norovirus virus-like particles binding to commensal bacteria using flow cytometry

חיידקים הקומנדסאל מבוססים היטב כדי להשפיע על זיהום של וירוסים איקריוטית. כריכה ישירה בין הפתוגן לבין microbiome מארח אחראי על שינוי זיהום עבור רבים מווירוסים אלה. כך, אפיון האופי של הכריכה של חיידקים וירוס הוא צעד היסוד הדרוש כדי להבהיר את המנגנון (ים) שבו חיידקים לשנות זיהום נגיפי. בחיידק האדם, חיידקי הקומנדסאל משפרים את הדלקת התאים B. הווירוס נקשר ישירות חיידקים אלה, המציין כי אינטראקציה ישירה זו מעורבת במנגנון של שיפור הזיהום. ניתן להשתמש במגוון טכניקות כדי לכמת את האינטראקציות בין חיידקים ווירוסים, כולל ספירת שרשרת וירוסים ותגובת שרשראות פולימראז (PCR). שתי השיטות מחייבות שימוש בווירוס החי, שייתכן שיהיה צורך ליצור אותם במעבדה. כיום, אף אחד הקים מערכות תרבות מבחנה זמין עבור norovirus אנושי חזקים מספיק כדי לאפשר דור של מניות ויראלי מרוכזת מאוד. במקום וירוס חי, חלקיקים כמו וירוס (האח מים) שימשו כדי לאפיין את האינטראקציות בין norovirus וחיידקים. בזאת שיטת הזרימה cy, מתוארת עם שימושים נוגדנים ספציפיים וירוס כדי לכמת את הכריכה של VIP לחיידקים גראם שליליים וגראם חיוביים. הכללה של שני חיידקים בלבד ו isotype מותר אופטימיזציה של הקביעה כדי להפחית את כריכת נוגדן הרקע וכימות מדויקת של המצורף VIP לחיידקים נבדק. אח מים גבוהה: יחסי חיידק התוצאה בכריכת אחמי ם לאחוזים גדולים של אוכלוסיית החיידקים. עם זאת, כאשר הכמויות של ה-VIP מופחת, אחוז החיידקים מאוגדים גם פוחתת. בסופו של דבר, שיטה זו יכולה להיות מועסק בניסויים עתידיים להבהיר את התנאים הספציפיים ורכיבים מבניים המסדירים norovirus: אינטראקציות בקטריאלי.

אסטרטגיות האיסוף המשמשות לכמת את כריכת ה-VIP של האדם וירוס לחיידקים הללו מוצגים באיור 1. נקודות צפיפות הנציג מספק סקירה של כיצד דגימות היו מגודרת כדי לחסל את הפסולת הסלולרית והגושים תאים כך המצורף VIP נקבע על סינגתן אוכלוסיות (איור 1א</strong...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry at JoVE.com

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

המטרה של פרוטוקול זה היא לכמת את הכריכה של הפתוגן איקריוטית האנושי הנגיף כדי חיידקים. לאחר ביצוע הראשונית וירוס חיידק הקובץ המצורף, הזרימה cy, לנסות לזהות חיידקים מאוגדים וירברית בתוך האוכלוסייה.

כימות האדם Norovirus וירוס כריכת כריכה של חיידקים קומנדסאל באמצעות זרימה Cy, לנסות

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

אינטראקציות וירוסים-חיידקיים יכולות להיות חשובות לזיהום ויראלי מוצלח ולגירוי של תגובה חיסונית מארחת. אבל נכון לעכשיו, מלאי מרוכז ומטוהר מאוד של norovirus אנושי לא יכול להיות מיוצר במעבדה. טכניקה זו יכולה לשמש עם כל וירוס שנקשר לחיידקים, שעבורם חלקיקים דמויי וירוס או וירוס חי זמינים.זה מאפשר לנו לכמת אינטראקציות בין וירוסים וחיידקים אלה. לחסן חמישה מיליליטר של מדיום נוזלי עם מושבה מבודדת אחת של Cloacae Enterobacter מצלחת אגר ישירות ממלאי גליצרול קפוא. לגדל את החיידקים בן לילה.למחרת, להעביר 1.3 aliquots מיליליטר של התרבות לשני צינורות צנטריפוגה 1.5 מיליליטר נפרדים. צנטריפוגה הצינורות ב 10, 000 x גרם במשך חמש דקות. הסר את supernatants, ולאחר מכן לשטוף את הדגימות פעמיים באמצעות מיליליטר אחד של PBS סטרילי 1X עבור כל לשטוף.צנטריפוגה הדגימות שוב ב 10, 000 x g במשך חמש דקות. הסר את supernatant ו resuspend גלולה ב 1.3 מיליליטר של PBS 1X סטרילי. החל 0.5 מיליליטר של תרבות שטף, באופן סדרתי לדלל את החיידקים ב PBS 1X מ 10 למינוס אחד עד 10 למינוס ארבע.באמצעות ספקטרופוטומטר, למדוד את הצפיפות האופטית של התרבות סחוט undiluted וכל אחד מארבעת הדילולים ב 600 ננומטר. בצע דילול סדרתי פי 10 ב- PBS 1X עבור כל אחד מהדילולים הקודמים. להפיץ 100 microliters של שלושת הדילולים האחרונים עבור כל סדרה על לוחות אגר כדי לקבוע את מספר המושבה להרכיב יחידות למיליליטר עבור כל מדגם.אפשר לצלחות להתייבש בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. להפוך את הצלחות ולהטמם אותם באינקובטור. לאחר הכנת הראוגנטים, הנוגדנים והחיידקים כמתואר בכתב היד, הרכיבו את כל החומרים בארון BSL-2 biosafety.חלקיקים דמויי וירוס עבור norovirus אנושי מפורטים כמו BSL-2 פתוגנים וכל העבודה לבצע באמצעות VLP צריך להתבצע ארון biosafety מוסמך. הוסף 10 מיקרוגרם של VLPs norovirus אנושי לכל צינור של חיידקים ומערבבים ביסודיות על ידי pipetting. דגירה הצינורות במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס עם סיבוב מתמיד.לאחר הדגירה, צנטריפוגה הצינורות ב 10, 000 x גרם במשך חמש דקות. שאף והשליך את העל-טבעי והתן מחדש את גלולת החיידקים במיליליטר אחד של PBS. לאחר חזרה על צעדי לשטוף פעם אחת, צנטריפוגה הצינורות שוב ב 10, 000 X g במשך חמש דקות.השליכו את גלולת חיידקי ה-VLP ב-150 מיקרוליטרים של חיץ חסימה של 5%. שגיאה נפוצה המתרחשת היא כי צינורות מוחלפים ואת הטיפול הלא נכון מתווסף. כדי למנוע זאת, לסדר את כל הצינורות בשורות התואמות את הטיפול הנכון ולהוסיף טיפול אחד בבת אחת לצינורות.עבור כל דגימת חיידקים, להכין 50 microliters של נוגדן NOROVIRUS GII אנושי מדולל. באמצעות חיץ חסימה של 5%, לדלל את הנוגדן 1 עד 125 עבור דגימות E.cloacae. הכינו 50 מיקרוליטרים של נוגדן isotype מדולל לכל דגימת חיידקים באמצעות אותם יחסי דילול.חלק כל דגימת בדיקה מצורפת ל-350 מיליליטר aliquots על-ידי העברתם לצינורות צנטריפוגה נקיים של 1.5 מיליליטר. כדי ליצור פקדים שאינם נגועים, הוסף 50 מיקרוליטרים של מאגר חסימה לאליקוט הראשון מכל דגימת חיידקים. לדגימות המוכתמות, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של דילול הנוגדנים של GII לסט השני של האלקוטים.צור את פקדי האזאוטיפים על-ידי הוספת 50 מיקרוליטרים של נוגדן האזאוטיפים המדולל לקבוצה השלישית של האליקוטים. דגירה כל הדגימות על קרח ובחושך במשך 30 דקות. ואז צנטריפוגה כל הדגימות ב10, 000 X G במשך חמש דקות.השלך את העל-טבעיים והתן מחדש כל דגימה ב- 150 מיקרוליטרים של FCSB. שוב, צנטריפוגה כל הדגימות ב10, 000 X G במשך חמש דקות. שוב, להשליך את supernatants ולתלות מחדש את הדגימות ב 100 microliters של FCSB.לאחר צנטריפוגה הדגימות בפעם האחרונה והשליכת supernatants, resuspend הדגימות ב 150 microliters של FCSB. העבר כל דגימה לצינור המכיל 400 מיקרוליטרים של FCSB עבור נפח כולל של 550 מיקרוליטרים. לאחסן את הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס עד שהם מנותחים על ידי ציטומטריה זרימה.קובץ מצורף VLP נמדד באמצעות ציטומטריית זרימה. ראשית, חלקות צפיפות שימשו לשער החוצה פסולת הסלולר, ואחריו העלילה נקודה הבאים gating כדי להסיר כפילויות חיידקיות גושים הסלולר. היסטוגרמות מייצגות מדגימות חוסר אות PE בדגימות חיידקיות בלבד ושינוי בעוצמת האות PE בדגימות VLP:חיידק בהשוואה לפקדים לא מזוהמים ואיזוטיפים.לאחר שעה אחת של דגירה עם 10 מיקרוגרם של VLP, ציטומטריית זרימה זיהתה כריכת חלקיקים הן E.colacae והן L.gasseri. כדי לקבוע את המגבלה של כימות מחייב עבור מבחן זה, סדרת דילול של VLPs נוצר לפני הוספת החיידקים. הפחתות בכמות VLP גרמו הפחתות תואמות לאחוז החיידקים מאוגדים על ידי VLP.לדעת את הנגיף:יחס חיידק ושמירה על היחס עקבי בין ניסויים חשוב בפענוח תוצאות. מוטנטים חיידקיים ויראליים יכולים להיווצר כדי לקבוע באופן ספציפי את מבני השטח המיקרוביאליים המתווים אינטראקציה זו. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לענות על שאלות לגבי נסיבות ותנאים המשפיעים על אינטראקציות norovirus-חיידקי, כולל כיצד שינויים גנוטיפ וירוס, תנאי צמיחה חיידקיים, ושינויים במבני פני השטח חיידקי לשנות מחייב ויראלי.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

פשוט ויעילה שיטה לגילוי הפעלת פקטור גרעינית בנויטרופילים אדם על ידי זרימת cytometry

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

דוגמנות מחזור החיים של נגיף האבולה תחת 2 תנאים ברמת בטיחות ביולוגיים עם חלקיקים כמו וירוס המכילים Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

פרוטוקול פשוט ומהיר לללא אנזימי רקמות אנושיות טריות לנתק לניתוח להחדרה לימפוציטים

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry

האדם תאים דנדריטים ריאות: הפריסה המרחבית וזיהוי פנוטיפי ב Endobronchial ביופסיות שימוש אימונוהיסטוכימיה ו cytometry זרימה

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

מדידת T Cell Alloreactivity שימוש cytometry זרימה הדמיה

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

ניתוחים כמותיים של הסינפסה המערכת החיסונית בגוף האדם באמצעות הדמיה Cytometry זרימה

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

אפיון של קבוצות משנה מונוציט האנושית על ידי דם לזרום Cytometry ניתוח

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...