Name: quantifying human norovirus virus-like particles binding to commensal bacteria using flow cytometry
Uploaded: 2020-04-29T14:00:00
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Vorremmo ringraziare Sutonuka Bhar e Chanel Mosby-Haundrup per la loro revisione critica del manoscritto scritto, così come Alfonso Carrillo per l'assistenza nella generazione di curve standard batteriche. Questo lavoro è finanziato in parte da una sovvenzione del National Institute of Health (R21AI140012) e da una sovvenzione di seme dell'Università della Florida, Istituto di Scienze dell'Alimentazione e dell'Agricoltura.

NOTA: Le condizioni di crescita batterica delineate nel protocollo sono condizioni di coltura standard per Enterobacter cloacae e Lactobacillus gasseri. Per eseguire il virus: i batteri attaccano il saggio con altre specie batteriche, i batteri scelti devono essere coltivati in condizioni standard appropriate per il batterio.
1. Preparazione di mezzo di crescita batterica
<ol><li>
Enterobacter cloacae crescita media<ol>
<li>Preparare il mezzo liquido sciogliendo 10...

<ol>
	<li>Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+global+burden+of+noroviruses+and+opportunities+for+prevention.">New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention.</a> Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).</li><li>Jones, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+bacteria+promote+human+and+mouse+norovirus+infection+of+B+cells.">Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells.</a> Science. 346 (6210), 755-759 (2014).</li><li>Baldridge, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commensal+microbes+and+interferon-lambda+determine+persistence+of+enteric+murine+norovirus+infection.">Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection.</a> Science. 347 (6219), 266-269 (2015).</li><li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterobacter+cloacae+inhibits+human+norovirus+infectivity+in+gnotobiotic+pigs.">Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs.</a> Scientific reports. 6, 25017 (2016).</li><li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Protective+Efficacy+of+Probiotics+and+Rice+Bran+against+Human+Norovirus+Infection+and+Diarrhea+in+Gnotobiotic+Pigs.">High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1699 (2016).</li><li>Rodr&#237;guez-D&#237;az, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+secretor+status+genotype+and+microbiota+composition+in+susceptibility+to+rotavirus+and+norovirus+infections+in+humans.">Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans.</a> Scientific Reports. 7, 45559 (2017).</li><li>Erickson, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+Facilitate+Enteric+Virus+Co-infection+of+Mammalian+Cells+and+Promote+Genetic+Recombination.">Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination.</a> Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).</li><li>Kuss, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+microbiota+promote+enteric+virus+replication+and+systemic+pathogenesis.">Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis.</a> Science. 334 (6053), 249-252 (2011).</li><li>Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lipopolysaccharide+binding+enhances+virion+stability+and+promotes+environmental+fitness+of+an+enteric+virus.">Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus.</a> Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).</li><li>Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+and+bacterial+envelope+components+enhance+mammalian+reovirus+thermostability.">Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability.</a> PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768 (2017).</li><li>Miura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histo-blood+group+antigen-like+substances+of+human+enteric+bacteria+as+specific+adsorbents+for+human+noroviruses.">Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses.</a> Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).</li><li>Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+norovirus+binding+to+select+bacteria+representative+of+the+human+gut+microbiota.">Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota.</a> PLOS One. 12 (3), (2017).</li><li>Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Related+enteric+viruses+have+different+requirements+for+host+microbiota+in+mice.">Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice.</a> Journal of Virology. , (2019).</li><li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids.">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li><li>Van Dycke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+human+norovirus+replication+model+in+zebrafish+larvae.">A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae.</a> PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009 (2019).</li><li>Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+to+histo-blood+group+antigen-expressing+bacteria+protects+human+norovirus+from+acute+heat+stress.">Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 659 (2015).</li><li>Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+norovirus+binding+to+gut-associated+bacterial+ligands.">Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands.</a> BMC Research Notes. 12 (1), 607 (2019).</li><li>Debbink, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within-host+evolution+results+in+antigenically+distinct+GII.4+noroviruses.">Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses.</a> Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).</li><li>Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Norwalk+virus-like+particles+to+ABH+histo-blood+group+antigens+is+blocked+by+antisera+from+infected+human+volunteers+or+experimentally+vaccinated+mice.">Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice.</a> Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).</li><li>Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+capture+with+histo-blood+group+antigens+reveals+novel+virus-ligand+interactions.">Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions.</a> Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).</li><li>Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GII.4+Human+Norovirus:+Surveying+the+Antigenic+Landscape.">GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape.</a> Viruses. 11 (2), (2019).</li><li>Prasad, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystallographic+structure+of+the+Norwalk+virus+capsid.">X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid.</a> Science. 286 (5438), 287-290 (1999).</li><li>Baric, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+self-assembly+of+norwalk+virus+capsid+protein+from+venezuelan+equine+encephalitis+virus+replicons.">Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons.</a> Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).</li><li>Rubio-del-Campo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noroviral+p-particles+as+an+in+vitro+model+to+assess+the+interactions+of+noroviruses+with+probiotics.">Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics.</a> PLOS One. 9 (2), 89586 (2014).</li><li>Tan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+modifications+of+norovirus+P+domain+resulted+in+a+new+type+of+subviral+particles,+the+small+P+particles.">Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles.</a> Virology. 410 (2), 345-352 (2011).</li></ol>

La capacità di quantificare il legame dei virus enterici ai batteri è un primo passo fondamentale per chiarire i meccanismi con cui questi batteri alterano l'infezione virale. I metodi qui descritti sono stati ottimizzati per misurare le interazioni VLP del norovirus umano sia con E. cloacae (batterio gram-negativo) che con L. gasseri (un batterio gram-positivo), ma possono essere adattati per l'uso con qualsiasi virus dei mammiferi e batterio di interesse. Mentre i VL...

I norovirus umani (HuNoVs) sono la principale causa di malattie gastrointestinali in tutto il mondo, responsabili di 685 milioni di infezioni e oltre 200.000 decessi ogni anno1. Come con altri virus enterici, la presenza di batteri commensale è stato indicato per migliorare l'infezione di questo agente patogeno così come il suo virus surrogato, murine norovirus2,3. Ci sono anche rapporti contrastanti che i batteri possono inibire l'infezione da norovirus umano4,5,6. Per diversi virus, l'interazione diretta tra il virus e i batteri sembra essere alla base dei meccanismi che influiscono sull'infezione virale2,,7,8,9,10, ed è stata dimostrata attraverso la microscopia elettronica che i norovirus umani legano direttamente alle superfici dei batteri11,12. Pertanto, caratterizzare queste interazioni è diventato fondamentale per determinare i meccanismi con cui i batteri influenzano l'infezione virale. Questa caratterizzazione è classicamente iniziata con la quantificazione del legame virale a una serie di specie batteriche che sono componenti del microbioma ospite7,12,13. Questi test di attaccamento non solo rivelano la quantità di virus legato ai batteri, ma aiutano anche a determinare l'impatto di questa interazione sulla forma fisica e sulla sopravvivenza virali.
Per quantificare l'attaccamento virale, i metodi tradizionalmente impiegati includono saggi basati su PCR che quantificano i genomi virali12 o la generazione di virus radioetichettato e l'uso del conteggio scintillio per quantificare le particelle virali7,8,9,13. L'uso di questi metodi richiede generalmente l'accesso alle scorte di virus ad alto tè e alle tecniche di coltivazione in vitro con cui generarle. Mentre diversi sistemi di coltura per il norovirus umano esistono attualmente2,14,15, nessuno supporta la replica robusta necessaria per generare questi stock altamente concentrati che limita o elimina l'uso di PCR scintill e conteggio per quantificare le interazioni uomo norovirus/ batteriche.
Per aggirare questo problema, le particelle simili a virus (VLP) possono essere utilizzate come surrogato per vivere il virus per studiare le interazioni tra norovirus umano e batteri16,17. I VLP sono particelle non infettive che assomigliano molto al virus da cui sono derivate. Nel caso del norovirus umano, queste particelle sono generate dall'espressione della proteina VP1 (e a volte VP2), che si auto-assemblano per creare capsidi virali intatti privi di materiale genetico (cioè RNA per norovirus). Questi VLP sono stati ben caratterizzati, sono strutturalmente e antigenicamente simili ai virus wild-type da cui sono derivati18,19,20,21,22,23. Pertanto, i VLP fungono da surrogato ideale per studiare le interazioni superficiali tra norovirus umano e batteri commensale. Dato che i VLP non dispongono di materiale genetico, i saggi basati su PCR non possono essere utilizzati per quantificare il legame virale. Un metodo di citometria di flusso basato su anticorpi è stato descritto in precedenza e in grado di rilevare bassi livelli di legame VLP ai batteri in modo semi-quantitativo16. Questo metodo è stato ottimizzato per consentire una quantificazione accurata del legame VLP del norovirus umano sia ai batteri commensale gram-negativi che gram-positivi16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7002</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaeroPack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R681001</td>
			<td>Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FacsDiva software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1605</td>
			<td>Used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554657</td>
			<td>Used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12473281</td>
			<td>Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRS Powder</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>288130</td>
			<td>Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MA5-18241</td>
			<td>Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norovirus GII.4 VLP</td>
			<td>Creative Biostructure</td>
			<td>CBS-V700</td>
			<td>human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP665</td>
			<td>Dilute to 1X prior to use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S10467</td>
			<td>Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td>Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying human norovirus virus-like particles binding to commensal bacteria using flow cytometry

I batteri commensale sono ben consolidati per influenzare l'infezione dei virus eucarioti. Il legame diretto tra l'agente patogeno e il microbioma ospite è responsabile dell'alterazione dell'infezione per molti di questi virus. Pertanto, caratterizzare la natura del legame virusbatterico è un passo fondamentale necessario per chiarire i meccanismi con cui i batteri alterano l'infezione virale. Per il norovirus umano, i batteri commensale migliorano l'infezione delle cellule B. Il virus si lega direttamente a questi batteri, indicando che questa interazione diretta è coinvolto nel meccanismo di miglioramento dell'infezione. Una varietà di tecniche può essere utilizzata per quantificare le interazioni tra batteri e virus, tra cui il conteggio scintillio dei virus radioetichettati e la reazione a catena della polimerasi (PCR). Entrambi i metodi richiedono l'uso di virus dal vivo, che potrebbe essere necessario generare in laboratorio. Attualmente, nessuno dei sistemi di coltura in vitro già stabiliti per il norovirus umano è abbastanza robusto da consentire la generazione di scorte virali altamente concentrate. Al posto del virus vivo, particelle simili a virus (VLP) sono state utilizzate per caratterizzare le interazioni tra norovirus e batteri. Qui viene descritto un metodo di citometria a flusso con anticorpi specifici del virus per quantificare il legame VLP ai batteri gram-negativi e gram-positivi. L'inclusione solo dei batteri e i controlli dell'isotipo hanno permesso l'ottimizzazione del saggio per ridurre il legame degli anticorpi di fondo e la quantificazione accurata dell'attaccamento VLP ai batteri testati. Alti rapporti VLP:batterio si traducono in VLP che si legano a grandi percentuali della popolazione batterica. Tuttavia, quando le quantità di VLP sono diminuite, diminuisce anche la percentuale di batteri legati. In definitiva, questo metodo può essere impiegato in esperimenti futuri che chiariscono le condizioni specifiche e i componenti strutturali che regolano il norovirus: le interazioni batteriche.

Le strategie di gating utilizzate per quantificare il legame VLP del norovirus umano ai batteri commensale sono mostrate nella Figura 1. Il punto di densità rappresentativo fornisce una panoramica di come i campioni sono stati recintati per eliminare i detriti cellulari e gli ammassamenti di cellule in modo che l'attacco VLP sia stato determinato su popolazioni singlet(Figura 1A). Gli istogrammi rappresentativi ...

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Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

L'obiettivo di questo protocollo è quantificare il legame del patogeno eucatotico norovirus umano ai batteri. Dopo aver eseguito un primo saggio di attaccamento virus-batterio, la citometria di flusso viene utilizzata per rilevare batteri viralmente legati all'interno della popolazione.

Quantificare le particelle umane simili al virus Norovirus legandosi ai batteri commensali utilizzando la citometria di flusso

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

Le interazioni virus-batteriche possono essere importanti per un'infezione virale di successo e la stimolazione di una risposta immunitaria ospite. Ma attualmente, lo stock altamente concentrato e purificato di norovirus umano non può essere prodotto in laboratorio. Questa tecnica può essere utilizzata con qualsiasi virus che si lega ai batteri, per i quali sono disponibili particelle simili a virus o virus vivi.Ci permette di quantificare le interazioni tra questi virus e batteri. Inoculare cinque millilitri di mezzo liquido con una singola colonia isolata di Enterobacter cloacae da una piastra di agar direttamente dallo stock di glicerolo congelato. Fai crescere i batteri durante la notte.Il giorno seguente, trasferire 1,3 aliquote millilitri della coltura in due tubi di centrifuga separati da 1,5 millilitri. Centrifugare i tubi a 10.000 x g per cinque minuti. Rimuovere i supernatanti, quindi lavare i campioni due volte utilizzando un millilitro di 1X PBS sterile per ogni lavaggio.Centrifugare nuovamente i campioni a 10.000 x g per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in 1,3 millilitri di 1X PBS sterile. A partire da 0,5 millilitri di coltura lavata, diluire serialmente i batteri in 1X PBS da 10 a meno uno a 10 a meno quattro.Usando uno spettrofotometro, misurare la densità ottica della coltura non diluita lavata e ciascuna delle quattro diluizioni a 600 nanometri. Eseguire diluizioni seriali di 10 volte in PBS 1X per ciascuna delle diluizioni precedenti. Stendere 100 microlitri delle ultime tre diluizioni per ogni serie su piastre di agar per determinare il numero di unità di formazione della colonia per millilitro per ciascun campione.Lasciare asciugare le piastre a temperatura ambiente per cinque minuti. Invertire i piatti e incubarli nell'incubatrice. Dopo aver preparato i reagenti, gli anticorpi e i batteri come descritto nel manoscritto, assemblare tutti i materiali in un armadietto di biosicurezza BSL-2.Particelle simili a virus per il norovirus umano sono elencate come agenti patogeni BSL-2 e tutto il lavoro eseguito utilizzando VLP deve essere condotto in un armadio di biosicurezza certificato. Aggiungere 10 microgrammi di VPP del norovirus umano a ciascun tubo di batteri e mescolare accuratamente mediante pipettazione. Incubare i tubi per un'ora a 37 gradi Celsius con rotazione costante.Dopo l'incubazione, centrifugare i tubi a 10.000 x g per cinque minuti. Aspirare e scartare il supernatante e rimescolare il pellet batterico in un millilitro di PBS. Dopo aver ripetuto i passaggi di lavaggio una volta, centrifugare nuovamente i tubi a 10.000 X g per cinque minuti.Scartare il supernatante e rimescolare il pellet di batteri VLP in 150 microlitri di tampone di blocco del 5%. Un errore comune che si verifica è che i tubi vengono scambiati e viene aggiunto il trattamento sbagliato. Per evitare ciò, disporre tutti i tubi in linee che corrispondono al trattamento corretto e aggiungere un trattamento tutto in una volta ai tubi.Per ogni campione batterico, preparare 50 microlitri di anticorpi GII di norovirus umano diluiti. Utilizzando il tampone di blocco del 5%, diluire l'anticorpo da uno a 125 per i campioni di E.cloacae. Preparare 50 microlitri di anticorpo isotipo diluito per ogni campione batterico utilizzando gli stessi rapporti di diluizione.Dividere ogni campione di saggio di attacco in 350 aliquote di microlitri trasferendole in tubi di centrifuga puliti da 1,5 millilitri. Per creare controlli non macchiati, aggiungere 50 microlitri di tampone di blocco alla prima aliquota di ogni campione batterico. Per i campioni macchiati, aggiungere 50 microlitri della diluizione dell'anticorpo GII al secondo set di aliquote.Creare i controlli dell'isotipo aggiungendo 50 microlitri dell'anticorpo dell'isotipo diluito al terzo set di aliquote. Incubare tutti i campioni sul ghiaccio e al buio per 30 minuti. Quindi centrifugare tutti i campioni a 10.000 X g per cinque minuti.Scartare i supernaganti e resopendire ogni campione in 150 microlitri di FCSB. Ancora una volta, centrifuga tutti i campioni a 10.000 X g per cinque minuti. Ancora una volta, scartare i supernaganti e resostillare i campioni in 100 microlitri di FCSB.Dopo aver centrifugato i campioni un'ultima volta e aver scartato i supernaganti, ha rimospendato i campioni in 150 microlitri di FCSB. Trasferire ogni campione in un tubo contenente 400 microlitri di FCSB per un volume totale di 550 microlitri. Conservare i campioni a 4 gradi Celsius fino a quando non vengono analizzati dalla citometria del flusso.L'attacco VLP è stato misurato utilizzando la citometria del flusso. In primo luogo, i grafici di densità sono stati utilizzati per eliminare i detriti cellulari, seguiti da successivi grafici a punti per rimuovere doppietti batterici e grumi cellulari. Gli istogrammi rappresentativi dimostrano una mancanza di segnale PE in campioni solo batterici e uno spostamento dell'intensità del segnale PE nei campioni di batteriO VLP rispetto ai controlli non macchiati e isotipi.Dopo un'ora di incubazione con 10 microgrammi di VLP, la citometria di flusso ha rilevato il legame delle particelle sia a E.colacae che a L.gasseri. Per determinare il limite di quantificazione vincolante per questo saggio, è stata generata una serie di diluizioni dei VPP prima dell'aggiunta ai batteri. La riduzione della quantità di VLP ha comportato riduzioni corrispondenti alla percentuale di batteri legati da VLP.Conoscere il rapporto virus-batterio e mantenere il rapporto coerente tra gli esperimenti è importante per interpretare i risultati. Mutanti batterici e virali possono essere generati per determinare specificamente le strutture superficiali microbiche che mediano questa interazione. Questa tecnica consente ai ricercatori di rispondere a domande riguardanti circostanze e condizioni che hanno un impatto sulle interazioni norovirus-batteriche, incluso il modo in cui i cambiamenti nel genotipo del virus, le condizioni di crescita batterica e i cambiamenti nelle strutture superficiali batteriche alterano il legame virale.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Umano In Vitro</emSoppressione> come strumento di screening per il riconoscimento di uno Stato precoce di squilibrio immunitario

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Immunologia e infezioni

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