Name: quantifying human norovirus virus-like particles binding to commensal bacteria using flow cytometry
Uploaded: 2020-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry at JoVE.com

私たちは、Sutouka Bharとシャネルモスビー・ハウンドアップが書かれた原稿の批判的なレビューをしてくれたことに感謝し、アルフォンソ・カリージョは細菌の標準的な曲線を生成するための支援を受けました。この研究は、国立衛生研究所(R21AI140012)からの助成金とフロリダ大学食品農業科学研究所からの種子助成金によって部分的に資金提供されています。

注:プロトコルに概説されている細菌の増殖条件は、エンテロバクタークロアカエとラクトバチルスガッセリの標準的な培養条件です。ウイルス:細菌の付着アッセイを他の細菌種と行うためには、細菌に適した標準的な条件下で培養する必要があります。
1. 細菌増殖培地の準備
<ol><li>
エンテボバクター・クロアカエ成長培地<ol>
<li>10gのトリプトン、...

<ol>
	<li>Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+global+burden+of+noroviruses+and+opportunities+for+prevention.">New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention.</a> Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).</li><li>Jones, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+bacteria+promote+human+and+mouse+norovirus+infection+of+B+cells.">Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells.</a> Science. 346 (6210), 755-759 (2014).</li><li>Baldridge, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commensal+microbes+and+interferon-lambda+determine+persistence+of+enteric+murine+norovirus+infection.">Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection.</a> Science. 347 (6219), 266-269 (2015).</li><li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterobacter+cloacae+inhibits+human+norovirus+infectivity+in+gnotobiotic+pigs.">Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs.</a> Scientific reports. 6, 25017 (2016).</li><li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Protective+Efficacy+of+Probiotics+and+Rice+Bran+against+Human+Norovirus+Infection+and+Diarrhea+in+Gnotobiotic+Pigs.">High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1699 (2016).</li><li>Rodr&#237;guez-D&#237;az, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+secretor+status+genotype+and+microbiota+composition+in+susceptibility+to+rotavirus+and+norovirus+infections+in+humans.">Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans.</a> Scientific Reports. 7, 45559 (2017).</li><li>Erickson, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+Facilitate+Enteric+Virus+Co-infection+of+Mammalian+Cells+and+Promote+Genetic+Recombination.">Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination.</a> Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).</li><li>Kuss, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+microbiota+promote+enteric+virus+replication+and+systemic+pathogenesis.">Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis.</a> Science. 334 (6053), 249-252 (2011).</li><li>Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lipopolysaccharide+binding+enhances+virion+stability+and+promotes+environmental+fitness+of+an+enteric+virus.">Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus.</a> Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).</li><li>Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+and+bacterial+envelope+components+enhance+mammalian+reovirus+thermostability.">Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability.</a> PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768 (2017).</li><li>Miura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histo-blood+group+antigen-like+substances+of+human+enteric+bacteria+as+specific+adsorbents+for+human+noroviruses.">Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses.</a> Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).</li><li>Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+norovirus+binding+to+select+bacteria+representative+of+the+human+gut+microbiota.">Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota.</a> PLOS One. 12 (3), (2017).</li><li>Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Related+enteric+viruses+have+different+requirements+for+host+microbiota+in+mice.">Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice.</a> Journal of Virology. , (2019).</li><li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids.">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li><li>Van Dycke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+human+norovirus+replication+model+in+zebrafish+larvae.">A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae.</a> PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009 (2019).</li><li>Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+to+histo-blood+group+antigen-expressing+bacteria+protects+human+norovirus+from+acute+heat+stress.">Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 659 (2015).</li><li>Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+norovirus+binding+to+gut-associated+bacterial+ligands.">Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands.</a> BMC Research Notes. 12 (1), 607 (2019).</li><li>Debbink, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within-host+evolution+results+in+antigenically+distinct+GII.4+noroviruses.">Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses.</a> Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).</li><li>Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Norwalk+virus-like+particles+to+ABH+histo-blood+group+antigens+is+blocked+by+antisera+from+infected+human+volunteers+or+experimentally+vaccinated+mice.">Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice.</a> Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).</li><li>Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+capture+with+histo-blood+group+antigens+reveals+novel+virus-ligand+interactions.">Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions.</a> Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).</li><li>Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GII.4+Human+Norovirus:+Surveying+the+Antigenic+Landscape.">GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape.</a> Viruses. 11 (2), (2019).</li><li>Prasad, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystallographic+structure+of+the+Norwalk+virus+capsid.">X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid.</a> Science. 286 (5438), 287-290 (1999).</li><li>Baric, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+self-assembly+of+norwalk+virus+capsid+protein+from+venezuelan+equine+encephalitis+virus+replicons.">Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons.</a> Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).</li><li>Rubio-del-Campo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noroviral+p-particles+as+an+in+vitro+model+to+assess+the+interactions+of+noroviruses+with+probiotics.">Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics.</a> PLOS One. 9 (2), 89586 (2014).</li><li>Tan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+modifications+of+norovirus+P+domain+resulted+in+a+new+type+of+subviral+particles,+the+small+P+particles.">Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles.</a> Virology. 410 (2), 345-352 (2011).</li></ol>

腸内ウイルスの細菌への結合を定量化する能力は、これらの細菌がウイルス感染を変化させるメカニズムを解明するための重要な第一歩である。本明細書に記載されている方法は、E.クロアカエ(グラム陰性細菌)およびL.ガッセリ(グラム陽性細菌)の両方とのヒトノロウイルスVLP相互作用を測定するために最適化されているが、目的の任意の哺乳類ウイル?...

ヒトノロウイルス(HuNovs)は、世界中の胃腸疾患の主な原因であり、毎年6億8,500万人の感染症と20万人以上の死亡を引き起こします。他の腸内ウイルスと同様に、この病原体の感染を増強するとともに、その代理ウイルスであるマウスノロウイルス22,33の感染を増強することが示されている。また、細菌がヒトノ,ロウイルス4、5、65による感染4を阻害する可能性があるという矛盾する報告もある。6いくつかのウイルスに対して、ウイルスと細菌の直接相互作用は、ウイルス感染22、7、8、9、107,8,9に影響を与えるメカニズムの根源であるように見え、10ヒトノロウイルスが細菌11、12,12の表面に直接結合することが電子顕微鏡によって示されている。したがって、これらの相互作用を特徴付けるのは、細菌がウイルス感染に影響を与えるメカニズムを決定する上で重要になってきました。この特性評価は、古典的に、宿,主微生物叢7、12、1312の構成要素である細菌種の配列に対7するウイルス結合を定量化することで始まった。これらの付着アッセイは、細菌に結合するウイルスの量を明らかにするだけでなく、この相互作用がウイルスの適性および生存に及ぼす影響を決定するのに役立ちます。
ウイルスの付着を定量するために、伝統的に採用される方法としては、ウイルスゲノム12または放射性標識ウイルスの生成を定量するPCRベースのアッセイと、ウイルス粒子7、8、9、138,9を定量するためのシンチ7レーションカウントの使用が含まれる。,13これらの方法を使用するには、一般的に高い刺激性ウイルス株へのアクセスとそれらを生成するためのインビトロ栽培技術が必要です。ヒトノロウイルス用の培養システムは22、14、1514に存在するが、15ヒトノロウイルス/細菌相互作用を定量化するためにPCRおよびシンチレーションカウントの使用を制限または排除するこれらの高濃度のストックを生成するために必要な堅牢な複製をサポートするものはない。
この問題を回避するために、ウイルス様粒子(VLPs)は、ヒトノロウイルスと細菌16、17,17との相互作用を調査するために生きたウイルスの代理として使用することができる。Vlps は、派生元のウイルスによく似た非感染性の粒子です。ヒトノロウイルスの場合、これらの粒子はVP1(そしていつかVP2)タンパク質の発現から生成され、遺伝物質を欠いた無傷のウイルスキャプシド(すなわち、ノロウイルスのRNA)を作成するために自己集合する。これらのVLPは、よく特徴付けられており、それらが由来する野生型ウイルスに構造的および抗原的に類似している18、19、20、21、22、23。18,19,20,21,22,23したがって、VLPは、ヒトノロウイルスとコメンサルバクテリアの表面相互作用を調べるための理想的な代理として機能します。VLPには遺伝物質が欠けているため、PCRベースのアッセイはウイルス結合の定量化には使用できません。抗体ベースのフローサイトメトリー法は、先に説明したものであり、半定量的に16の方法で細菌に結合する低レベルのVLPを検出することができる。この方法は、グラム陰性およびグラム陽性の共生菌16の両方に結合するヒトノロウイルスVLPの正確な定量を可能にするように最適化された。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7002</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaeroPack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R681001</td>
			<td>Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FacsDiva software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1605</td>
			<td>Used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554657</td>
			<td>Used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12473281</td>
			<td>Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRS Powder</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>288130</td>
			<td>Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MA5-18241</td>
			<td>Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norovirus GII.4 VLP</td>
			<td>Creative Biostructure</td>
			<td>CBS-V700</td>
			<td>human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP665</td>
			<td>Dilute to 1X prior to use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S10467</td>
			<td>Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td>Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying human norovirus virus-like particles binding to commensal bacteria using flow cytometry

コメンサルバクテリアは、真核生物ウイルスの感染に影響を与えるために十分に確立されています。病原体と宿主微生物叢との間の直接結合は、これらのウイルスの多くについて感染を改変する原因である。このように、ウイルス-バクテリア結合の性質を特徴付けるのは、細菌がウイルス感染を変えるメカニズムを解明するために必要な基礎的なステップである。ヒトノロウイルスの場合、コメンサルバクテリアはB細胞感染を増強する。ウイルスは、これらの細菌に直接結合し、この直接相互作用が感染増強のメカニズムに関与していることを示す。放射性標識ウイルスおよびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のシンチレーションカウントを含む細菌とウイルスとの相互作用を定量化するために、様々な技術を使用することができます。どちらの方法も生きたウイルスの使用を必要とし、実験室で生成する必要があります。現在、ヒトノロウイルスに利用可能な確立されたインビトロ培養システムは、高濃度ウイルスストックの生成を可能にするのに十分な堅牢性を持っていません。生きたウイルスの代わりに、ノロウイルスと細菌の相互作用を特徴付けるためにウイルス様粒子(VLPs)が使用されてきました。ここでフローサイトメトリー法は、グラム陰性およびグラム陽性菌に対するVLP結合を定量するウイルス特異的抗体を用いて記載される。試験した細菌へのVLP結合の背景抗体結合および正確な定量化を減少させるアッセイの最適化のために、細菌のみ及びアイソタイプ制御の両方を含む。VLP:細菌比率が高いと、VLPは細菌集団の大部分に結合する。しかし、VLP量が減少すると、結合する細菌の割合も減少します。最終的に、この方法は、ノロウイルスを調節する特定の条件および構造成分を解明する将来の実験で使用することができる:細菌相互作用。

ヒトノロウイルスVLPをコメンサルバクテリアに結合する定量化に用いる格言戦略を図1に示す。代表的な密度ドットは、単一集団でVLP付着が決定されるように、細胞の破片および細胞塊を排除するためにサンプルがどのようにゲートされたかの概要を提供する(図1A)。代表的なヒストグラムは、イソタイプ対照抗...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry at JoVE.com

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

このプロトコルの目的は、ヒトノロウイルスの真核生物病原体の細菌への結合を定量化することです。初期のウイルス-細菌付着アッセイを行った後、フローサイトメトリーは、集団内のウイルス結合細菌を検出するために使用される。

フローサイトメトリーを用いた経月細菌に結合するヒトノロウイルスウイルス様粒子の定量化

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

ウイルスと細菌の相互作用は、成功したウイルス感染および宿主免疫応答の刺激のために重要であり得る。しかし、現在、ヒトノロウイルスの高度に濃縮され精製されたストックは、実験室で生産することはできません。この技術は、ウイルス様の粒子または生きたウイルスのいずれかが利用可能な細菌に結合する任意のウイルスで使用することができます。これにより、これらのウイルスと細菌の相互作用を定量化することができます。凍結グリセロールストックから直接寒天プレートからエンターボバクタークロアカエの単一の単一の分離コロニーで液体培地の5ミリリットルを接種します。一晩細菌を成長させます。翌日、培養物の1.3ミリリットルのアリコートを2つの別々の1.5ミリリットル遠心管に移す。チューブを10,000 x gで5分間遠心分離する。上清を取り除き、洗浄ごとに1ミリリットルの滅菌1X PBSを使用してサンプルを2回洗浄します。サンプルを10,000 x gで再び5分間遠心分離する。上清を取り除き、滅菌1X PBSの1.3ミリリットルでペレットを再懸濁します。0.5ミリリットルの洗浄培養から始まり、10からマイナス1からマイナス4まで1X PBS中の細菌を連続して希釈する。分光光度計を用いて、洗浄された希釈されていない培養液と4つの希釈液の光密度を600ナノメートルで測定する。1X PBSで10倍の連続希釈を、以前の希釈液ごとに実行します。各シリーズの最後の3つの希釈液の100マイクロリットルを寒天プレートに広げ、各サンプルの1ミリリットル当たりのコロニー形成単位の数を決定します。プレートを室温で5分間乾燥させます。プレートを反転し、インキュベーターでインキュベートします。原稿に記載されている試薬、抗体、および細菌を調製した後、BSL-2バイオセーフティキャビネット内のすべての材料を組み立てます。ヒトノロウイルスのウイルス様粒子はBSL-2病原体としてリストされており、VLPを用いて行うすべての作業は、認定バイオセーフティキャビネットで行う必要があります。細菌の各チューブにヒトノロウイルスVLPの10マイクログラムを追加し、ピペット処理によって徹底的に混合します。一定の回転で摂氏37度で1時間チューブをインキュベートします。インキュベーション後、チューブを10,000 x gで5分間遠心分離します。吸引し、上清を捨て、PBSの1ミリリットルで細菌ペレットを再懸濁する。洗浄ステップを一度繰り返した後、チューブを10,000 X gで再び5分間遠心します。上清を捨て、5%ブロッキングバッファーの150マイクロリットルでVLP-バクテリアペレットを再懸濁します。一般的なエラーは、チューブがスワップされ、間違った処理が追加されるということです。これを防ぐために、すべてのチューブを正しい処理に対応するラインに並べ、チューブに一度に1つの治療を加えます。各細菌サンプルに対して、希釈されたヒトノロウイルスGII抗体を50マイクロリットル調製する。5%ブロッキングバッファーを使用して、E.cloacaeサンプルに対して抗体を1〜125に希釈します。同じ希釈比を使用して、各細菌サンプルに対して50マイクロリットルの希釈アイソタイプ抗体を調製します。各取り付けアッセイサンプルを350マイクロリットルのアリコートに分け、清潔な1.5ミリリットルの遠心管に移します。染色されていないコントロールを作成するには、各細菌サンプルから最初のアリコートに50マイクロリットルのブロッキングバッファーを追加します。染色されたサンプルについては、GII抗体希釈液の50マイクロリットルをアリコートの第2のセットに加える。アイソタイプコントロールを作成するには、希釈アイソタイプ抗体の50マイクロリットルをアリコートの第3セットに加えます。氷の上と暗闇の中で30分間すべてのサンプルをインキュベートします。次に、10,000 X gで全てのサンプルを5分間遠心分離する。上清を捨て、各サンプルをFCSBの150マイクロリットルで再懸濁します。再度、10,000 X gで全てのサンプルを5分間遠心分離する。再度、上清を捨てて、FCSBの100マイクロリットルでサンプルを再中断します。サンプルを最後に1回遠心し、上清を捨て、150マイクロリットルのFCSBでサンプルを再中断します。各サンプルを400マイクロリットルのFCSBを含むチューブに移し、合計容量は550マイクロリットルです。サンプルは、フローサイトメトリーで分析されるまで摂氏4度で保存します。VLP付着はフローサイトメトリーを用いて測定した。まず、密度プロットを使用して細胞の破片をゲートアウトし、その後のドットプロットゲーティングを使用して細菌のダブレットと細胞塊を除去しました。代表的なヒストグラムは、細菌のみのサンプルにおけるPEシグナルの欠如と、不染色およびアイソタイプ制御と比較してVLP:細菌サンプルにおけるPE信号強度の変化を示す。10マイクログラムのVLPで1時間のインキュベーションの後、フローサイトメトリーはE.colacaeとL.gasseriの両方に結合する粒子を検出した。このアッセイに対する結合定量の限界を決定するために、VLPsの希釈系列を細菌に添加する前に生成した。VLPの量の減少は、VLPによって結合されたパーセント細菌に対応する減少をもたらした。ウイルスを知る:細菌比と実験間の比率の一貫性を保つことは、結果を解釈する上で重要です。細菌およびウイルス変異体は、この相互作用を媒介する微生物表面構造を特異的に決定するために生成することができる。この技術により、ウイルス遺伝子型の変化、細菌の増殖条件、細菌表面構造の変化がウイルス結合をどのように変化させるかなど、ノロウイルスと細菌の相互作用に影響を与える状況や条件に関する質問に答えることができます。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

ヒトのインビトロ</em免疫バランスの初期状態の認識のためのスクリーニングツールとして>抑制

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによるヒト好中球の核因子の活性を検出するために簡単で効率的な方法

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Tetracistronicミニゲノムを含むウイルス様粒子とバイオセーフティレベル2の条件の下ではエボラウイルスのライフサイクルのモデル化

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

簡単かつ迅速なプロトコル非酵素的に浸潤リンパ球の分析のための新鮮なヒト組織を解離

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry

免疫組織化学およびフローサイトメトリーを用いた気管支生検における空間分布と表現型の同定：ヒト肺樹状細胞

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

イメージングフローサイトメトリーを使用したT細胞同種反応性の測定

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

フローサイトメトリーをイメージングを用いた人間システムの免疫シナプスの定性・定量分析

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

全血によって人間の Monocyte のサブセットの解析フローのフローサイトメトリー解析

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

好中球系統細胞の質量細胞法解析に対する全骨髄の調製

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...