Name: quantifying human norovirus virus-like particles binding to commensal bacteria using flow cytometry
Uploaded: 2020-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry at JoVE.com

수토누카 바르와 샤넬 모스비-하운드루프가 작성된 원고에 대한 비판적 검토와 세균 표준 곡선 생성에 도움을 준 알폰소 카릴로에게 감사드립니다. 이 작품은 건강의 국립 연구소에서 보조금에 의해 부분적으로 자금 (R21AI140012) 플로리다 대학에서 종자 보조금에 의해, 식품 및 농업 과학 연구소.

참고: 프로토콜에 설명 된 세균 성장 조건은 Enterobacter cloacae 및 유산 균 gasseri에대 한 표준 배양 조건. 바이러스를 수행하기 위하여:박테리아 부착 분석은 그밖 세균종으로, 선택된 박테리아는 박테리아를 위해 적당한 표준 조건 하에서 배양되어야 합니다.
1. 세균 성장 배지 준비
<ol><li>
엔테로박터 클로아카성장매체<ol>
<li>디이온화(DI) 물 1L에 트립톤 10g, ...

<ol>
	<li>Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+global+burden+of+noroviruses+and+opportunities+for+prevention.">New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention.</a> Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).</li><li>Jones, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+bacteria+promote+human+and+mouse+norovirus+infection+of+B+cells.">Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells.</a> Science. 346 (6210), 755-759 (2014).</li><li>Baldridge, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commensal+microbes+and+interferon-lambda+determine+persistence+of+enteric+murine+norovirus+infection.">Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection.</a> Science. 347 (6219), 266-269 (2015).</li><li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterobacter+cloacae+inhibits+human+norovirus+infectivity+in+gnotobiotic+pigs.">Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs.</a> Scientific reports. 6, 25017 (2016).</li><li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Protective+Efficacy+of+Probiotics+and+Rice+Bran+against+Human+Norovirus+Infection+and+Diarrhea+in+Gnotobiotic+Pigs.">High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1699 (2016).</li><li>Rodr&#237;guez-D&#237;az, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+secretor+status+genotype+and+microbiota+composition+in+susceptibility+to+rotavirus+and+norovirus+infections+in+humans.">Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans.</a> Scientific Reports. 7, 45559 (2017).</li><li>Erickson, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+Facilitate+Enteric+Virus+Co-infection+of+Mammalian+Cells+and+Promote+Genetic+Recombination.">Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination.</a> Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).</li><li>Kuss, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+microbiota+promote+enteric+virus+replication+and+systemic+pathogenesis.">Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis.</a> Science. 334 (6053), 249-252 (2011).</li><li>Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lipopolysaccharide+binding+enhances+virion+stability+and+promotes+environmental+fitness+of+an+enteric+virus.">Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus.</a> Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).</li><li>Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+and+bacterial+envelope+components+enhance+mammalian+reovirus+thermostability.">Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability.</a> PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768 (2017).</li><li>Miura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histo-blood+group+antigen-like+substances+of+human+enteric+bacteria+as+specific+adsorbents+for+human+noroviruses.">Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses.</a> Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).</li><li>Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+norovirus+binding+to+select+bacteria+representative+of+the+human+gut+microbiota.">Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota.</a> PLOS One. 12 (3), (2017).</li><li>Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Related+enteric+viruses+have+different+requirements+for+host+microbiota+in+mice.">Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice.</a> Journal of Virology. , (2019).</li><li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids.">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li><li>Van Dycke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+human+norovirus+replication+model+in+zebrafish+larvae.">A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae.</a> PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009 (2019).</li><li>Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+to+histo-blood+group+antigen-expressing+bacteria+protects+human+norovirus+from+acute+heat+stress.">Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 659 (2015).</li><li>Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+norovirus+binding+to+gut-associated+bacterial+ligands.">Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands.</a> BMC Research Notes. 12 (1), 607 (2019).</li><li>Debbink, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within-host+evolution+results+in+antigenically+distinct+GII.4+noroviruses.">Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses.</a> Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).</li><li>Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Norwalk+virus-like+particles+to+ABH+histo-blood+group+antigens+is+blocked+by+antisera+from+infected+human+volunteers+or+experimentally+vaccinated+mice.">Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice.</a> Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).</li><li>Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+capture+with+histo-blood+group+antigens+reveals+novel+virus-ligand+interactions.">Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions.</a> Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).</li><li>Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GII.4+Human+Norovirus:+Surveying+the+Antigenic+Landscape.">GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape.</a> Viruses. 11 (2), (2019).</li><li>Prasad, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystallographic+structure+of+the+Norwalk+virus+capsid.">X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid.</a> Science. 286 (5438), 287-290 (1999).</li><li>Baric, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+self-assembly+of+norwalk+virus+capsid+protein+from+venezuelan+equine+encephalitis+virus+replicons.">Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons.</a> Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).</li><li>Rubio-del-Campo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noroviral+p-particles+as+an+in+vitro+model+to+assess+the+interactions+of+noroviruses+with+probiotics.">Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics.</a> PLOS One. 9 (2), 89586 (2014).</li><li>Tan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+modifications+of+norovirus+P+domain+resulted+in+a+new+type+of+subviral+particles,+the+small+P+particles.">Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles.</a> Virology. 410 (2), 345-352 (2011).</li></ol>

박테리아에 장바이러스의 결합을 정량화하는 기능은 이 박테리아가 바이러스성 감염을 바꾸는 기계장치를 해명하기 위한 중요한 첫번째 단계입니다. 본 명세서에 기재된 방법은 인간 노로바이러스 VLP 상호작용을 E. 클로아카(gram-negative 박테리아) 및 L. gasseri(그람 양성 박테리아)와 측정하도록 최적화되었지만, 임의의 포유류 바이러스 및 관심 있는 박테리아...

인간 노로바이러스(HuNoVs)는 전 세계적으로 위장병의 주요 원인으로,매년6억 8,500만 건의 감염과 200,000명 이상의 사망을 초래합니다. 다른 장내 바이러스와 마찬가지로, 동보 박테리아의 존재는 이 병원체뿐만 아니라 대리 바이러스, 뮤린 노로바이러스2,,3의감염을 향상시키는 것으로 나타났다. 박테리아가 인간 노로 바이러스4,,5,,6에의한 감염을 억제 할 수 있다는 충돌보고서가 있습니다. 여러 바이러스의 경우, 바이러스와 박테리아 간의 직접적인 상호작용은 바이러스감염에영향을 미치는 메커니즘의 근간을 이룬 것으로 나타나며2,7,,8,,9,,10,전자 현미경을 통해 인간 노로바이러스가 박테리아11,,12의표면에 직접 결합하는 것으로 나타났다. 그러므로, 이 상호 작용을 특성화하는 것은 박테리아가 바이러스성 감염에 영향을 미치는 기계장치를 결정하는 것이 중요하게 되었습니다. 이러한 특성화는 숙주 미생물군유전체7,,12,,13의성분인 세균종의 배열에 대한 바이러스 결합을 정량화하는 것으로 고전적으로 시작되었다. 이 첨부 성 분석은 박테리아에 묶인 바이러스의 양을 밝힐 뿐만 아니라 바이러스 적합성 및 생존에 이 상호 작용의 충격을 결정하는 것을 돕습니다.
바이러스 부착을 정량화하기 위해, 전통적으로 채택된 방법은 바이러스 게놈12 또는 방사성 표지된 바이러스의 생성을 정량화하는 PCR 기반 측정법을 포함하고 있으며, 바이러스입자를정량화하기 위해 분신계계의 사용7,8,,9,,13. 이러한 방법의 사용은 일반적으로 높은 티터 바이러스 주식과 그들을 생성하는 시험관 내 재배 기술에 대한 액세스를 필요로한다. 인간 노로 바이러스에 대한 여러 배양 시스템은 지금 존재하지만2,,14,15,아무도 제한하거나 인간의 노로 바이러스 / 세균 상호 작용을 정량화하기 위해 PCR 및 종축 계수의 사용을 제거 이러한 고농축 주식을 생성하는 데 필요한 강력한 복제를 지원하지 않습니다.14
이 문제를 우회하기 위해, 바이러스 유사 입자(VLPs)는 인간 노로바이러스와박테리아(16,,17)사이의 상호작용을 조사하기 위해 바이러스를 살리기 위해 대리로 사용될 수 있다. VLPs는 밀접하게 그(것)들이 파생되는 바이러스를 닮은 비 감염성 입자입니다. 인간 노로바이러스의 경우, 이들 입자는 유전물질이 결여된 손상되지 않은 바이러스 성 캡시드(즉, 노로바이러스를 위한 RNA)를 만들기 위해 자가 조립하는 VP1(및 언젠가 VP2) 단백질의 발현으로부터 생성된다. 이들 VLP는 잘 특징지어지고 있으며, 구조적으로 그리고 항원적으로 유사하며, 이들은,18,19,,20,,21,,22,,23에서유래되는 야생형 바이러스와 유사하다. 따라서, VLP는 인간 노로바이러스와 공생 박테리아 사이의 표면 상호 작용을 조사하기위한 이상적인 대리역할을합니다. VLPs는 유전 물질이 부족하다는 것을 감안할 때, PCR 기지를 둔 세포는 바이러스성 결합을 정량화하기 위하여 이용될 수 없습니다. 항체 기반 유동 세포분석 방법은 이전에 설명되었고 반정량적인 방식으로 박테리아에 결합하는 낮은 수준의 VLP를 검출할 수있었다 16. 이 방법은 그람 음성 및 그람 양성 공생박테리아(16)에결합하는 인간 노로바이러스 VLP의 정확한 정량화를 허용하도록 최적화되었다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7002</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaeroPack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R681001</td>
			<td>Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FacsDiva software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1605</td>
			<td>Used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554657</td>
			<td>Used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12473281</td>
			<td>Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRS Powder</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>288130</td>
			<td>Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MA5-18241</td>
			<td>Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norovirus GII.4 VLP</td>
			<td>Creative Biostructure</td>
			<td>CBS-V700</td>
			<td>human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP665</td>
			<td>Dilute to 1X prior to use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S10467</td>
			<td>Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td>Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying human norovirus virus-like particles binding to commensal bacteria using flow cytometry

생균은 진핵 바이러스의 감염에 영향을 미치기 위하여 잘 설치됩니다. 병원체와 숙주 미생물군유전체 사이의 직접 결합은 이러한 바이러스의 많은 감염을 변경하는 책임이 있다. 따라서, 바이러스-박테리아 결합의 특성화는 박테리아가 바이러스 감염을 변화시키는 메커니즘(들)을 해명하는 데 필요한 기초 단계이다. 인간 노로 바이러스에 대 한, 연구용 박테리아 B 세포 감염을 향상. 바이러스는 직접 이러한 박테리아에 바인딩, 이 직접 적인 상호 작용 감염 향상의 메커니즘에 관여 하는 것을 나타내는. 방사성 표지된 바이러스 및 중합효소 연쇄 반응(PCR)의 주식 계수를 포함하여 박테리아와 바이러스 간의 상호 작용을 정량화하는 데 다양한 기술을 사용할 수 있습니다. 두 방법 모두 실험실에서 생성해야 할 수도 있는 살아있는 바이러스의 사용을 필요로 합니다. 현재, 인간 노로바이러스에 사용할 수 있는 체외 배양 시스템 중 어느 것도 고농축 바이러스 성 주식의 생성을 허용할 만큼 충분히 견고하지 않다. 살아있는 바이러스 대신에, 바이러스 같이 입자 (VLPs)는 노로바이러스와 박테리아 사이 상호 작용을 특성화하기 위하여 이용되었습니다. 본 명세서에서 유동 세포분석 방법은 그람 음성 및 그람 양성 박테리아에 VLP 결합을 정량화하기 위해 바이러스 특이적 항체를 사용하여 기술된다. 박테리아 만 및 이소형 대조군 모두의 포함은 시험된 박테리아에 대한 VLP 부착의 배경 항체 결합 및 정확한 정량화를 감소시키기 위해 분석법의 최적화를 허용하였다. 높은 VLP: 박테리아 비율은 세균 인구의 큰 비율에 결합하는 VLPs 귀착됩니다. 그러나, VLP 수량 감소 하는 경우, 결합 하는 박테리아의 백분율 또한 감소. 궁극적으로, 이 방법은 노로바이러스:세균 상호 작용을 조절하는 특정 조건 및 구조적 구성 요소를 해명하는 향후 실험에 사용될 수 있다.

공생 박테리아에 결합하는 인간 노로바이러스 VLP를 정량화하는 데 사용되는 게이팅 전략은 도 1에나타내었다. 대표적인 밀도 도트는 VLP 부착이 단일 집단에서 결정되도록 세포 파편 및 세포 덩어리를 제거하기 위해 시료를 문게 한 방법에 대한 개요를제공합니다(그림 1A). 대표적인 히스토그램은 이소형 조절 항체?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry at JoVE.com

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

이 프로토콜의 목적은 진핵 병원체 인간 노로바이러스의 결합을 박테리아에 정량화하는 것이다. 초기 바이러스-박테리아 부착 분석을 수행한 후, 유동 세포측정은 집단 내에서 바이러스 결합 박테리아를 검출하는 데 사용된다.

유세포측정을 사용하여 공생 균에 결합하는 인간 노로바이러스 바이러스와 같은 입자 정량화

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

바이러스 세균성 상호 작용은 호스트 면역 반응의 성공적인 바이러스 감염 및 자극을 위해 중요할 수 있습니다. 그러나 현재, 인간 노로 바이러스의 고농축 및 정제 된 재고는 실험실에서 생성 될 수 없습니다. 이 기술은 바이러스와 같은 입자 또는 살아있는 바이러스를 사용할 수있는 박테리아에 결합하는 모든 바이러스와 함께 사용할 수 있습니다.그것은 우리가 이 바이러스와 박테리아 사이 상호 작용을 정량화하는 것을 가능하게 합니다. 냉동 글리세롤 육수에서 직접 한 천 판에서 Enterobacter 클로카의 단일 절연 식민지와 액체 매체의 5 밀리리터를 접종. 하룻밤 박테리아를 성장.다음 날, 문화의 1.3 밀리리터 알리쿼트를 별도의 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기다. 튜브를 10, 000 x g에서 5분간 원심분리합니다. 수퍼나티를 제거한 다음, 세척할 때마다 멸균 1X PBS 1밀리리터를 사용하여 샘플을 두 번 세척합니다.샘플을 10, 000 x g에서 5분 동안 다시 원심분리합니다. 상체를 제거하고 멸균 1X PBS의 1.3 밀리리터에서 펠릿을 다시 분리하십시오. 세척 된 배양의 0.5 밀리리터로 시작하여 10에서 마이너스 10에서 마이너스 4까지 1X PBS에서 박테리아를 연속적으로 희석시하십시오.분광계를 사용하여, 세척되지 않은 희석 배양의 광학 밀도와 600 나노미터에서 4개의 희석제 각각을 측정합니다. 이전 희석제 각각에 대해 1X PBS에서 10배 의 직렬 희석을 수행합니다. 각 계열에 대한 마지막 3개의 희석제 100마이크로리터를 각 시료에 대해 밀리리터당 콜로니 성형 유닛수를 결정합니다.접시가 실온에서 5분간 건조되도록 합니다. 접시를 반전시키고 인큐베이터에서 배양합니다. 원고에 설명된 바와 같이 시약, 항체 및 박테리아를 준비한 후, BSL-2 생물안전 캐비닛에 모든 물질을 조립한다.인간 노로바이러스를 위한 바이러스 와 같은 입자는 BSL-2 병원체로 나열되고 VLP를 사용하여 수행하는 모든 작업은 인증된 생물안전 캐비닛에서 수행되어야 합니다. 박테리아의 각 튜브에 인간 노로 바이러스 VLP의 10 마이크로 그램을 추가하고 파이펫팅에 의해 철저하게 혼합. 일정한 회전과 섭씨 37도에서 1 시간 동안 튜브를 배양.인큐베이션 후, 5 분 동안 10, 000 x g에서 튜브를 원심 분리합니다. 흡인 및 슈퍼 나탄을 폐기하고 PBS의 1 밀리리터에서 세균 펠릿을 다시 중단. 세척 단계를 한 번 반복한 후, 5 분 동안 10, 000 X g에서 튜브를 원심 분리합니다.상체를 버리고 5 % 차단 버퍼의 150 마이크로 리터에서 VLP 박테리아 펠릿을 다시 중단하십시오. 발생하는 일반적인 오류는 튜브를 교환하고 잘못된 치료가 추가된다는 것입니다. 이를 방지하기 위해 올바른 치료에 해당하는 모든 튜브를 한 번에 튜브에 추가합니다.각 세균성 시료에 대해, 희석된 인간 노로바이러스 GII 항체의 50마이크로리터를 준비한다. 5% 블로킹 버퍼를 사용하여, E.cloacae 샘플에 대해 항체를 1대 125로 희석한다. 동일한 희석 비를 사용하여 각 세균 성 시료에 대해 희석 된 동형 항체 50 마이크로 리터를 준비하십시오.각 부착 분석 분석 샘플을 깨끗한 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 이송하여 350 마이크로리터 알리쿼트로 나눕니다. 스테인드 컨트롤을 만들려면 각 세균 샘플의 첫 번째 알리쿼트에 블로킹 버퍼 50 마이크로리터를 추가합니다. 스테인드 샘플의 경우, 2차 알리쿼트 세트에 GII 항체 희석의 50마이크로리터를 추가합니다.희석된 이소형 항체의 50마이크로리터를 알리쿼트의 세 번째 세트에 추가하여 등형 대조군을 생성한다. 얼음과 어둠 속에서 30분 동안 모든 샘플을 배양합니다. 그런 다음 모든 샘플을 10, 000 X g에서 5분 동안 원심분리합니다.슈퍼네티츠를 폐기하고 각 샘플을 FCSB의 150 마이크로리터로 재보힙합니다. 다시 말하지만, 원심 분리기는 5 분 동안 10, 000 X g의 모든 샘플을 원심 분리합니다. 다시 말하지만, 슈퍼네이터를 버리고 FCSB의 100 마이크로리터에서 샘플을 다시 중단하십시오.시료를 원심분리한 후 최종 한 번 은은하고 슈퍼네티츠를 폐기한 후 FCSB의 150마이크로리터에서 샘플을 다시 중단합니다. 각 샘플을 FCSB 의 400 마이크로리터를 포함하는 튜브로 전달하여 총 550 마이크로리터를 사용할 수 있습니다. 시료를 섭씨 4도에 저장하여 혈류 세포측정에 의해 분석될 때까지 보관합니다.VLP 부착은 유동 세포측정을 사용하여 측정되었다. 첫째, 밀도 플롯은 세포 파편을 게이트하는 데 사용되었고, 그 다음에는 세균이중과 세포 덩어리를 제거하기 위해 후속 점도 플롯 게이팅이 뒤따랐습니다. 대표적인 히스토그램은 세균성 만 샘플에서 PE 신호의 부족과 VLP:박테리아 샘플의 PE 신호 강도의 변화를 입증하여 얼룩이 없는 및 동종 형 대조군과 비교됩니다.10 마이크로그램의 VLP를 가진 잠복한 후, 유동 세포측정은 E.colacae와 L.gasseri 모두에 결합하는 입자 결합을 검출했습니다. 이 분석체에 대한 결합 정량화의 한계를 결정하기 위해, VLP의 희석 시리즈는 박테리아에 첨가하기 전에 생성되었다. VLP의 양감소는 VLP에 의해 결합된 백분율 박테리아에 대응하는 감소 귀착되었습니다.바이러스를 알고: 박테리아 비율을 알고 실험 사이 일관된 비율을 유지하는 것은 결과를 해석에 중요합니다. 세균및 바이러스 돌연변이체는 이러한 상호 작용을 중화시키는 미생물 표면 구조를 구체적으로 결정하기 위해 생성될 수 있다. 이 기술은 연구원이 바이러스 유전자형에 있는 변경, 세균성 성장 조건 및 세균성 표면 구조물에 있는 변경이 바이러스성 결합을 바꾸는 방법을 포함하여 노로바이러스 세균성 상호 작용에 영향을 미치는 상황 및 조건에 관하여 질문에 대답하는 것을 허용합니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

사람의 체외에서</em면역 불균형의 초기 국가의 인정을위한 심사 도구를> 억제

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

연구

면역학 및 감염병학

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

유동 세포 계측법에 의해 인간 호중구에 핵 팩터 활성화를 감지 할 간단하고 효율적인 방법

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Tetracistronic Minigenomes를 포함하는 바이러스 입자와 바이오 안전성 수준이 조건에서 에볼라 바이러스의 수명주기를 모델링

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

침투 림프구의 분석을위한 비 효소 해리 신선한 인간의 조직에 대한 간단하고 빠른 프로토콜

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry

면역 및 유동 세포 계측법을 사용하여 기관지 생검의 공간 분포 및 표현형 확인 : 인간의 폐 수지상 세포

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

이미징 유동 세포 계측법을 사용하여 T 세포 Alloreactivity의 측정

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Cytometry 이미징 사용 하 여 인간의 시스템에 면역 시 냅 스의 질적 및 양적 분석

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

전체 혈액에 의해 인간 Monocyte 하위 집합의 Flow Cytometry 분석

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

호중구 계보 세포의 질량 세포 분석 분석을위한 전체 골수의 준비

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...