Name: quantifying human norovirus virus-like particles binding to commensal bacteria using flow cytometry
Uploaded: 2020-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Sutonuka Bhar og Chanel Mosby-Haundrup for deres kritiske gjennomgang av det skriftlige manuskriptet, samt Alfonso Carrillo for hjelp med å generere bakterielle standardkurver. Dette arbeidet er delvis finansiert av et stipend fra National Institute of Health (R21AI140012) og av et frøstipend fra University of Florida, Institute of Food and Agricultural Sciences.

MERK: Bakterievekstforholdene som er skissert i protokollen er standard kulturforhold for Enterobacter cloacae og Lactobacillus gasseri. For å utføre viruset:bakterier vedlegg analyse med andre bakterielle arter, bør de valgte bakteriene dyrkes under standardforhold som passer for bakterien.
1. Forbereder bakteriell vekst medium
<ol><li>
Enterobacter cloacae vekst media<ol>
<li>Forbered væskemediet ved å oppløse 10 g tryptone, 5 g gjærekstrakt og 10 g natriu...

<ol>
	<li>Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+global+burden+of+noroviruses+and+opportunities+for+prevention.">New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention.</a> Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).</li><li>Jones, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+bacteria+promote+human+and+mouse+norovirus+infection+of+B+cells.">Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells.</a> Science. 346 (6210), 755-759 (2014).</li><li>Baldridge, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commensal+microbes+and+interferon-lambda+determine+persistence+of+enteric+murine+norovirus+infection.">Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection.</a> Science. 347 (6219), 266-269 (2015).</li><li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterobacter+cloacae+inhibits+human+norovirus+infectivity+in+gnotobiotic+pigs.">Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs.</a> Scientific reports. 6, 25017 (2016).</li><li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Protective+Efficacy+of+Probiotics+and+Rice+Bran+against+Human+Norovirus+Infection+and+Diarrhea+in+Gnotobiotic+Pigs.">High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1699 (2016).</li><li>Rodr&#237;guez-D&#237;az, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+secretor+status+genotype+and+microbiota+composition+in+susceptibility+to+rotavirus+and+norovirus+infections+in+humans.">Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans.</a> Scientific Reports. 7, 45559 (2017).</li><li>Erickson, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+Facilitate+Enteric+Virus+Co-infection+of+Mammalian+Cells+and+Promote+Genetic+Recombination.">Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination.</a> Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).</li><li>Kuss, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+microbiota+promote+enteric+virus+replication+and+systemic+pathogenesis.">Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis.</a> Science. 334 (6053), 249-252 (2011).</li><li>Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lipopolysaccharide+binding+enhances+virion+stability+and+promotes+environmental+fitness+of+an+enteric+virus.">Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus.</a> Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).</li><li>Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+and+bacterial+envelope+components+enhance+mammalian+reovirus+thermostability.">Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability.</a> PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768 (2017).</li><li>Miura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histo-blood+group+antigen-like+substances+of+human+enteric+bacteria+as+specific+adsorbents+for+human+noroviruses.">Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses.</a> Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).</li><li>Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+norovirus+binding+to+select+bacteria+representative+of+the+human+gut+microbiota.">Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota.</a> PLOS One. 12 (3), (2017).</li><li>Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Related+enteric+viruses+have+different+requirements+for+host+microbiota+in+mice.">Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice.</a> Journal of Virology. , (2019).</li><li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids.">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li><li>Van Dycke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+human+norovirus+replication+model+in+zebrafish+larvae.">A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae.</a> PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009 (2019).</li><li>Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+to+histo-blood+group+antigen-expressing+bacteria+protects+human+norovirus+from+acute+heat+stress.">Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 659 (2015).</li><li>Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+norovirus+binding+to+gut-associated+bacterial+ligands.">Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands.</a> BMC Research Notes. 12 (1), 607 (2019).</li><li>Debbink, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within-host+evolution+results+in+antigenically+distinct+GII.4+noroviruses.">Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses.</a> Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).</li><li>Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Norwalk+virus-like+particles+to+ABH+histo-blood+group+antigens+is+blocked+by+antisera+from+infected+human+volunteers+or+experimentally+vaccinated+mice.">Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice.</a> Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).</li><li>Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+capture+with+histo-blood+group+antigens+reveals+novel+virus-ligand+interactions.">Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions.</a> Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).</li><li>Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GII.4+Human+Norovirus:+Surveying+the+Antigenic+Landscape.">GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape.</a> Viruses. 11 (2), (2019).</li><li>Prasad, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystallographic+structure+of+the+Norwalk+virus+capsid.">X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid.</a> Science. 286 (5438), 287-290 (1999).</li><li>Baric, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+self-assembly+of+norwalk+virus+capsid+protein+from+venezuelan+equine+encephalitis+virus+replicons.">Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons.</a> Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).</li><li>Rubio-del-Campo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noroviral+p-particles+as+an+in+vitro+model+to+assess+the+interactions+of+noroviruses+with+probiotics.">Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics.</a> PLOS One. 9 (2), 89586 (2014).</li><li>Tan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+modifications+of+norovirus+P+domain+resulted+in+a+new+type+of+subviral+particles,+the+small+P+particles.">Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles.</a> Virology. 410 (2), 345-352 (2011).</li></ol>

Evnen til å kvantifisere binding av enteriske virus til bakterier er et kritisk første skritt for å belyse mekanismene som disse bakteriene endrer virusinfeksjon. Metodene som er beskrevet her, er optimalisert for å måle humant norovirus VLP-interaksjoner med både E. cloacae (gram-negativ bakterie) og L. gasseri (en grampositiv bakterie), men kan tilpasses for bruk med ethvert pattedyrvirus og bakterie av interesse. Mens VLPs er et ideelt alternativ til levende vir...

Humane norovirus (HuNoVs) er den ledende årsaken til gastrointestinal sykdom over hele verden, ansvarlig for 685 millioner infeksjoner og over 200.000 dødsfall hvert år1. Som med andre enteriske virus, har tilstedeværelsen av kommensale bakterier vist seg å forbedre infeksjon en av dette patogenet, samt surrogatviruset, murine norovirus2,3. Det er også motstridende rapporter om at bakterier kan hemme infeksjon av humant norovirus4,5,6. For flere virus ser direkte interaksjon mellom viruset og bakteriene ut til å ligge til grunn for mekanismene som påvirker virusinfeksjon2,,7,8,9,10, og det har blitt vist gjennom elektronmikroskopi at humane norovirus binder seg direkte til overflatene av bakterier11,12. Derfor har karakterisering av disse interaksjonene blitt avgjørende for å bestemme mekanismene som bakterier påvirker virusinfeksjon. Denne karakteriseringen har klassisk begynt med kvantifiserende viral binding til en rekke bakterielle arter som er komponenter i verten mikrobiome7,,12,13. Disse vedleggsanalysene avslører ikke bare mengden virus som er bundet til bakterier, men også bidrar til å bestemme virkningen av denne interaksjonen på viral kondisjon og overlevelse.
For å kvantifisere viral vedlegg, tradisjonelt brukte metoder inkluderer PCR-baserte analyser som kvantifiserer virale genomer12 eller generering av radiomerket virus og bruk av scintillation telling for å kvantifisere viruspartikler7,,8,9,13. Bruken av disse metodene krever vanligvis tilgang til høytiterviruslagre og in vitro dyrkingsteknikker som å generere dem. Mens flere kultursystemer for humant norovirus nå eksisterer2,14,15, støtter ingen den robuste replikeringen som kreves for å generere disse svært konsentrerte bestandene som begrenser eller eliminerer bruken av PCR og scintillation telling for å kvantifisere menneskelig norovirus / bakterielle interaksjoner.15
For å omgå dette problemet, virus-lignende partikler (VLPs) kan brukes som et surrogat for å leve virus for å undersøke interaksjoner mellom menneskelig norovirus og bakterier16,17. VLPs er ikke-smittsomme partikler som ligner viruset som de er avledet fra. Når det gjelder humant norovirus, genereres disse partiklene fra uttrykket av VP1 (og en gang VP2)-proteinet, som selv monterer for å skape intakte virale capsids som mangler genetisk materiale (dvs. RNA for norovirus). Disse VLPs har vært godt preget, er strukturelt og antigenically lik vill-type virus som de er avledet18,,19,20,21,22,23. Derfor fungerer VLPs som et ideelt surrogat for å undersøke overflateinteraksjonene mellom humant norovirus og komstaserende bakterier. Gitt at VLPs mangler genetisk materiale, PCR-baserte analyser kan ikke brukes til å kvantifisere viral binding. En antistoffbasert flow cytometrimetode ble tidligere beskrevet og i stand til å oppdage lave nivåer av VLP binding til bakterier på en semi-kvantitativ måte16. Denne metoden ble optimalisert for å tillate nøyaktig kvantifisering av humant norovirus VLP binding til både gram-negative og gram-positive commensal bakterier16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7002</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaeroPack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R681001</td>
			<td>Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FacsDiva software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1605</td>
			<td>Used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554657</td>
			<td>Used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12473281</td>
			<td>Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRS Powder</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>288130</td>
			<td>Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MA5-18241</td>
			<td>Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norovirus GII.4 VLP</td>
			<td>Creative Biostructure</td>
			<td>CBS-V700</td>
			<td>human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP665</td>
			<td>Dilute to 1X prior to use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S10467</td>
			<td>Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td>Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying human norovirus virus-like particles binding to commensal bacteria using flow cytometry

Commensal bakterier er godt etablert for å påvirke infeksjon av eukaryyotiske virus. Direkte binding mellom patogenet og vertsmikrobiomet er ansvarlig for å endre infeksjon for mange av disse virusene. Dermed er det å karakterisere arten av virus-bakterier binding et grunnleggende skritt som trengs for å belyse mekanismen(e) som bakterier endrer virusinfeksjon. For humant norovirus forbedrer kommensale bakterier B-celleinfeksjon. Viruset binder seg direkte til disse bakteriene, noe som indikerer at denne direkte interaksjonen er involvert i mekanismen for infeksjonsforbedring. En rekke teknikker kan brukes til å kvantifisere interaksjoner mellom bakterier og virus, inkludert scintillation telling av radiomerkede virus og polymerase kjedereaksjon (PCR). Begge metodene krever bruk av levende virus, som kan måtte genereres i laboratoriet. For tiden er ingen av de etablerte in vitro kultursystemene som er tilgjengelige for humant norovirus, robuste nok til å tillate generering av svært konsentrerte virusbestander. I stedet for levende virus har viruslignende partikler (VLPs) blitt brukt til å karakterisere interaksjonene mellom norovirus og bakterier. Her i en flow cytometri metode er beskrevet med bruker virus spesifikke antistoffer for å kvantifisere VLP binding til gram-negative og gram-positive bakterier. Inkludering av både bakterier og isotypekontroller tillatt for optimalisering av analysen for å redusere bakgrunnsantistoffbinding og nøyaktig kvantifisering av VLP-vedlegg til bakteriene som er testet. Høye VLP:bakterieforhold resulterer i at VLPs binding til store prosenter av bakteriepopulasjonen. Men når VLP-mengder reduseres, reduseres også prosentandelen av bakterier som er bundet. Til syvende og sist kan denne metoden brukes i fremtidige eksperimenter som belyser de spesifikke forholdene og strukturelle komponentene som regulerer norovirus:bakterielle interaksjoner.

Gatingstrategiene som brukes til å kvantifisere humant norovirus VLP-binding til komserbakterier, vises i figur 1. Representativ tetthetdot gir en oversikt over hvordan prøver ble inngjerdet for å eliminere cellulær rusk og celleklumper, slik at VLP-vedlegg ble bestemt på singletpopulasjoner (figur 1A). Representative histogrammer viser lave nivåer av anti-norovirus antistoffsignal hos bakterier bare prøve...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry at JoVE.com

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

Målet med denne protokollen er å kvantifisere binding av eukaryyotisk patogen humant norovirus til bakterier. Etter å ha utført en innledende virus-bakterie vedlegg analyse, flyt cytometri brukes til å oppdage viralt bundet bakterier i befolkningen.

Kvantifisere humant norovirus viruslignende partikler binding til commensal bakterier ved hjelp av flow cytometri

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

Virus-bakterielle interaksjoner kan være viktig for vellykket virusinfeksjon og stimulering av en vert immunrespons. Men for tiden kan ikke svært konsentrert og renset lager av menneskelig norovirus produseres i laboratoriet. Denne teknikken kan brukes med ethvert virus som binder seg til bakterier, som enten viruslignende partikler eller levende virus er tilgjengelige.Det gjør oss i stand til å kvantifisere interaksjoner mellom disse virusene og bakteriene. Inokuler fem milliliter flytende medium med en enkelt isolert koloni Enterobacter cloacae fra en agarplate direkte fra frossen glyserol lager. Vokse bakteriene over natten.Dagen etter, overføre 1,3 milliliter aliquots av kulturen i to separate 1,5 milliliter sentrifuge rør. Sentrifuger rørene på 10,000 x g i fem minutter. Fjern supernativa, vask deretter prøvene to ganger med en milliliter steril 1X PBS for hver vask.Sentrifuger prøvene igjen ved 10.000 x g i fem minutter. Fjern den overnaturlige og resuspend pellet i 1,3 milliliter sterile 1X PBS. Fra og med 0,5 milliliter vasket kultur, fortynner bakteriene i 1X PBS fra 10 til minus en til 10 til minus fire.Ved hjelp av et spektrofotometer måler du den optiske tettheten til den vasket ufortynnede kulturen og hver av de fire fortynningene ved 600 nanometer. Utfør 10 ganger seriefortynninger i 1X PBS for hver av de tidligere fortynningene. Spred 100 mikroliter av de tre siste fortynningene for hver serie på agarplater for å bestemme antall kolonidannende enheter per milliliter for hver prøve.La platene tørke ved romtemperatur i fem minutter. Inverter platene og inkuber dem i inkubatoren. Etter å ha forberedt reagenser, antistoffer og bakterier som beskrevet i manuskriptet, montere alle materialene i et BSL-2 biosikkerhetsskap.Viruslignende partikler for humant norovirus er oppført som BSL-2 patogener, og alt arbeid som utfører med VLP, skal utføres i et sertifisert biosikkerhetsskap. Tilsett 10 mikrogram humant norovirus VLPs til hvert rør av bakterier og bland godt ved pipettering. Inkuber rørene i en time ved 37 grader Celsius med konstant rotasjon.Etter inkubasjon sentrifuger rørene ved 10, 000 x g i fem minutter. Aspirer og kast det overnaturlige og resuspend bakteriepellet i en milliliter PBS. Etter å ha gjentatt vasketrinnene én gang, sentrifuger rørene igjen ved 10.000 X g i fem minutter.Kast den overnaturlige og gjenoppuss vLP-bakteriepellet i 150 mikroliter på 5% blokkerende buffer. En vanlig feil som oppstår er at rør byttes og feil behandling legges til. For å forhindre dette, ordne alle rør i linjer som tilsvarer riktig behandling og legg til en behandling samtidig til rørene.For hver bakteriell prøve, forberede 50 mikroliter fortynnet humant norovirus GII antistoff. Bruk 5% blokkeringsbuffer, fortynne antistoffet en til 125 for E.cloacae prøver. Forbered 50 mikroliter fortynnet isotypeantistoff for hver bakteriell prøve ved hjelp av de samme fortynningsforholdene.Del hver festeanalyseprøve i 350 mikroliter aliquots ved å overføre dem til rene 1,5 milliliter sentrifugerør. Hvis du vil opprette uopphetede kontroller, legger du til 50 mikroliter med blokkeringsbuffer til det første aliquot fra hver bakteriell prøve. For de fargede prøvene, tilsett 50 mikroliter av GII-antistofffortynningen til det andre settet med aliquots.Lag isotypekontrollene ved å legge til 50 mikroliter av det fortynnede isotypeantistoffet til det tredje settet med aliquots. Inkuber alle prøvene på is og i mørket i 30 minutter. Sentrifuger deretter alle prøvene ved 10.000 X g i fem minutter.Kast supernativa og resuspend hver prøve i 150 mikroliter fcsb. Igjen, sentrifugere alle prøvene på 10, 000 X g i fem minutter. Igjen, kast supernativa og resuspend prøvene i 100 mikroliter av FCSB.Etter å ha sentrifugert prøvene en siste gang og kastet supernativa, gjenbruke prøvene i 150 mikroliter av FCSB. Overfør hver prøve til et rør som inneholder 400 mikroliter FCSB for et totalt volum på 550 mikroliter. Oppbevar prøvene ved 4 grader Celsius til de analyseres ved strømningscytometri.VLP-vedlegg ble målt ved hjelp av strømningscytometri. Først ble tetthetsplott brukt til å gate ut cellulært rusk, etterfulgt av påfølgende dot plot gating for å fjerne bakterielle dobler og cellulære klumper. Representative histogrammer viser mangel på PE-signal i bakterielle bare prøver og et skifte i PE-signalintensitet i VLP:bakterieprøver sammenlignet med uopphetede og isotypekontroller.Etter en time inkubasjon med 10 mikrogram VLP påviste strømningscytometri partikkelbinding til både E.colacae og L.gasseri. For å bestemme grensen for bindende kvantifisering for denne analysen, ble det generert en fortynningsserie av VIP-ene før de kom i tillegg til bakteriene. Reduksjoner i mengden VLP resulterte i tilsvarende reduksjoner av prosentbakterier bundet av VLP.Å vite viruset: bakterieforhold og holde forholdet konsekvent mellom eksperimenter er viktig for å tolke resultater. Bakterielle og virale mutanter kan genereres for å spesifikt bestemme de mikrobielle overflatestrukturene som medierer denne interaksjonen. Denne teknikken gjør det mulig for forskere å svare på spørsmål om omstendigheter og forhold som påvirker norovirus-bakterielle interaksjoner, inkludert hvordan endringer i virusgenomtype, bakterielle vekstforhold og endringer i bakterielle overflatestrukturer endrer viral binding.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

En enkel og effektiv metode for å oppdage kjernefysiske faktor Activation i Human Nøytrofile ved flowcytometri

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Modellering livssyklusen til Ebola virus Under biosikkerhetsnivå 2 forhold med viruslignende partikler som inneholder Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

En enkel og Rapid-protokollen til ikke-enzymatisk distansere Ferske menneskelig vev for analyse av infiltrerende Lymfocytter

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry

Menneske Lung dendrittiske celler: Romlig fordeling og Fenotypisk Identifikasjon i Endobronchial Biopsi Bruke Immunohistochemistry og flowcytometri

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Måling av T-celle alloreaktiviteten hjelp Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Kvalitativ og kvantitativ analyse av immun Synapse i menneskelige systemet ved hjelp av Imaging flowcytometri

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolasjon og In Vitro kultur Murine og menneskelig Alveolar makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Karakteristikk av menneskelig Monocyte delsett av hele blod flyte cytometri analyse

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Utarbeidelse av hele benmarg for Mass flowcytometri analyse av nøytrofile-Lineage celler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...