Name: quantifying human norovirus virus-like particles binding to commensal bacteria using flow cytometry
Uploaded: 2020-04-29T14:00:00
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Nos gustaría agradecer a Sutonuka Bhar y Chanel Mosby-Haundrup por su revisión crítica del manuscrito escrito, así como a Alfonso Carrillo por su ayuda con la generación de curvas estándar bacterianas. Este trabajo se financia en parte con una subvención del Instituto Nacional de Salud (R21AI140012) y con una subvención de semillas de la Universidad de Florida, Instituto de Ciencias Alimentarias y Agrícolas.

NOTA: Las condiciones de crecimiento bacteriano descritas en el protocolo son condiciones de cultivo estándar para Enterobacter cloacae y Lactobacillus gasseri. Para realizar el virus:ensayo de unión bacteriana con otras especies bacterianas, las bacterias elegidas deben ser cultivadas bajo condiciones estándar apropiadas para la bacteria.
1. Preparación del medio de crecimiento bacteriano
<ol><li>
Medios de crecimiento enterobacter cloacae<ol>
<li>Preparar el ...

<ol>
	<li>Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+global+burden+of+noroviruses+and+opportunities+for+prevention.">New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention.</a> Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).</li><li>Jones, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+bacteria+promote+human+and+mouse+norovirus+infection+of+B+cells.">Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells.</a> Science. 346 (6210), 755-759 (2014).</li><li>Baldridge, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commensal+microbes+and+interferon-lambda+determine+persistence+of+enteric+murine+norovirus+infection.">Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection.</a> Science. 347 (6219), 266-269 (2015).</li><li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterobacter+cloacae+inhibits+human+norovirus+infectivity+in+gnotobiotic+pigs.">Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs.</a> Scientific reports. 6, 25017 (2016).</li><li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Protective+Efficacy+of+Probiotics+and+Rice+Bran+against+Human+Norovirus+Infection+and+Diarrhea+in+Gnotobiotic+Pigs.">High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1699 (2016).</li><li>Rodr&#237;guez-D&#237;az, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+secretor+status+genotype+and+microbiota+composition+in+susceptibility+to+rotavirus+and+norovirus+infections+in+humans.">Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans.</a> Scientific Reports. 7, 45559 (2017).</li><li>Erickson, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+Facilitate+Enteric+Virus+Co-infection+of+Mammalian+Cells+and+Promote+Genetic+Recombination.">Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination.</a> Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).</li><li>Kuss, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+microbiota+promote+enteric+virus+replication+and+systemic+pathogenesis.">Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis.</a> Science. 334 (6053), 249-252 (2011).</li><li>Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lipopolysaccharide+binding+enhances+virion+stability+and+promotes+environmental+fitness+of+an+enteric+virus.">Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus.</a> Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).</li><li>Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+and+bacterial+envelope+components+enhance+mammalian+reovirus+thermostability.">Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability.</a> PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768 (2017).</li><li>Miura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histo-blood+group+antigen-like+substances+of+human+enteric+bacteria+as+specific+adsorbents+for+human+noroviruses.">Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses.</a> Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).</li><li>Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+norovirus+binding+to+select+bacteria+representative+of+the+human+gut+microbiota.">Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota.</a> PLOS One. 12 (3), (2017).</li><li>Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Related+enteric+viruses+have+different+requirements+for+host+microbiota+in+mice.">Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice.</a> Journal of Virology. , (2019).</li><li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids.">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li><li>Van Dycke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+human+norovirus+replication+model+in+zebrafish+larvae.">A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae.</a> PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009 (2019).</li><li>Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+to+histo-blood+group+antigen-expressing+bacteria+protects+human+norovirus+from+acute+heat+stress.">Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 659 (2015).</li><li>Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+norovirus+binding+to+gut-associated+bacterial+ligands.">Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands.</a> BMC Research Notes. 12 (1), 607 (2019).</li><li>Debbink, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within-host+evolution+results+in+antigenically+distinct+GII.4+noroviruses.">Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses.</a> Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).</li><li>Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Norwalk+virus-like+particles+to+ABH+histo-blood+group+antigens+is+blocked+by+antisera+from+infected+human+volunteers+or+experimentally+vaccinated+mice.">Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice.</a> Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).</li><li>Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+capture+with+histo-blood+group+antigens+reveals+novel+virus-ligand+interactions.">Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions.</a> Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).</li><li>Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GII.4+Human+Norovirus:+Surveying+the+Antigenic+Landscape.">GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape.</a> Viruses. 11 (2), (2019).</li><li>Prasad, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystallographic+structure+of+the+Norwalk+virus+capsid.">X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid.</a> Science. 286 (5438), 287-290 (1999).</li><li>Baric, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+self-assembly+of+norwalk+virus+capsid+protein+from+venezuelan+equine+encephalitis+virus+replicons.">Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons.</a> Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).</li><li>Rubio-del-Campo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noroviral+p-particles+as+an+in+vitro+model+to+assess+the+interactions+of+noroviruses+with+probiotics.">Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics.</a> PLOS One. 9 (2), 89586 (2014).</li><li>Tan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+modifications+of+norovirus+P+domain+resulted+in+a+new+type+of+subviral+particles,+the+small+P+particles.">Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles.</a> Virology. 410 (2), 345-352 (2011).</li></ol>

La capacidad de cuantificar la unión de los virus entéricos a las bacterias es un primer paso crítico para esclarecer los mecanismos por los cuales estas bacterias alteran la infección viral. Los métodos descritos en este documento se han optimizado para medir las interacciones de VLP de norovirus humanos con E. cloacae (bacteria gramnegativa) y L. gasseri (una bacteria grampositiva), pero pueden adaptarse para su uso con cualquier virus de mamífero y bacteria de i...

Los norovirus humanos (HuNoV) son la principal causa de enfermedad gastrointestinal en todo el mundo, responsable de 685 millones de infecciones y más de 200.000 muertes cada año1. Al igual que con otros virus entéricos, se ha demostrado que la presencia de bacterias comensales mejora la infección de este patógeno, así como su virus sustituto, norovirus murino2,3. También hay informes contradictorios de que las bacterias pueden inhibir la infección por norovirus humano4,5,6. Para varios virus, la interacción directa entre el virus y las bacterias parece subyacen a los mecanismos que afectan la infección viral2,7,8,9,10, y se ha demostrado a través de microscopía electrónica que los norovirus humanos se unen directamente a las superficies de las bacterias11,,12. Por lo tanto, caracterizar estas interacciones se ha vuelto fundamental para determinar los mecanismos por los cuales las bacterias afectan la infección viral. Esta caracterización ha comenzado clásicamente con la cuantificación de la unión viral7a una serie de especies bacterianas que son componentes del microbioma huésped7,12,,13. Estos ensayos de apego no sólo revelan la cantidad de virus ligados a las bacterias, sino que también ayudan a determinar el impacto de esta interacción en la aptitud viral y la supervivencia.
Para cuantificar el apego viral, los métodos tradicionalmente empleados incluyen ensayos basados en PCR que cuantifican los genomas virales12 o la generación de virus radiomarcados y el uso de recuento de centelleo para cuantificar partículas virales7,,8,9,13. El uso de estos métodos generalmente requiere el acceso a las poblaciones de virus de alto valor y a las técnicas de cultivo in vitro con las que generarlos. Mientras que varios sistemas de cultivo para el norovirus humano existen ahora2,14,15, ninguno apoya la replicación robusta necesaria para generar estas poblaciones altamente concentradas que restringe o elimina el uso de PCR y recuento de centelleo para cuantificar las interacciones norovirus humanos / bacterianas.
Para evitar este problema, las partículas similares a virus (VLP) se pueden utilizar como sustituto del virus vivo para investigar las interacciones entre el norovirus humano y las bacterias16,17. Los VLP son partículas no infecciosas que se asemejan mucho al virus del que se derivan. En el caso del norovirus humano, estas partículas se generan a partir de la expresión de la proteína VP1 (y en algún momento del VP2), que se autoensamblan para crear cápsides virales intactos que carecen de material genético (es decir, ARN para norovirus). Estos VLP han sido bien caracterizados, son estructural y antígenos similares a los virus de tipo salvaje de los que se derivan18,,19,,20,,21,,22,,23. Por lo tanto, los VLP sirven como un sustituto ideal para investigar las interacciones superficiales entre el norovirus humano y las bacterias comensales. Dado que los VLP carecen de material genético, los ensayos basados en PCR no pueden utilizarse para cuantificar la unión viral. Anteriormente se describió un método de citometría de flujo basado en anticuerpos que era capaz de detectar niveles bajos de unión de VLP a las bacterias de manera semicuantitativa16. Este método fue optimizado para permitir la cuantificación precisa de la unión de Norovirus humano VLP a bacterias commensalgramas gramnegativas y gram-positivas16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7002</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaeroPack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R681001</td>
			<td>Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FacsDiva software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1605</td>
			<td>Used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554657</td>
			<td>Used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12473281</td>
			<td>Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRS Powder</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>288130</td>
			<td>Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MA5-18241</td>
			<td>Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norovirus GII.4 VLP</td>
			<td>Creative Biostructure</td>
			<td>CBS-V700</td>
			<td>human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP665</td>
			<td>Dilute to 1X prior to use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S10467</td>
			<td>Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td>Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying human norovirus virus-like particles binding to commensal bacteria using flow cytometry

Las bacterias commensales están bien establecidas para afectar la infección de los virus eucariotas. La unión directa entre el patógeno y el microbioma huésped es responsable de alterar la infección de muchos de estos virus. Por lo tanto, caracterizar la naturaleza de la unión virus-bacteria es un paso fundamental necesario para esclarecer el mecanismo o mecanismos por los cuales las bacterias alteran la infección viral. Para el norovirus humano, las bacterias commensales mejoran la infección de la célula B. El virus se une directamente a estas bacterias, lo que indica que esta interacción directa está implicada en el mecanismo de mejora de la infección. Se pueden utilizar diversas técnicas para cuantificar las interacciones entre bacterias y virus, incluido el recuento de centelleo de virus radiomarcados y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Ambos métodos requieren el uso de virus vivos, que puede necesitar ser generado en el laboratorio. Actualmente, ninguno de los sistemas de cultivo in vitro establecidos disponibles para el norovirus humano es lo suficientemente robusto como para permitir la generación de poblaciones virales altamente concentradas. En lugar de virus vivos, se han utilizado partículas similares a virus (VLP) para caracterizar las interacciones entre el norovirus y las bacterias. Aquí se describe un método de citometría de flujo con los usos de anticuerpos específicos del virus para cuantificar la unión de VLP a bacterias gramnegativas y gram-positivas. La inclusión de los controles de bacterias solamente y de isotipo permitió la optimización del ensayo para reducir la unión de anticuerpos de fondo y la cuantificación precisa de la fijación de VLP a las bacterias probadas. Las altas relaciones VLP:bacterium dan como resultado la unión de los VLP a grandes porcentajes de la población bacteriana. Sin embargo, cuando las cantidades de VLP se disminuyen, el porcentaje de bacterias unidas también disminuye. En última instancia, este método se puede emplear en futuros experimentos que aclaran las condiciones específicas y los componentes estructurales que regulan el norovirus: interacciones bacterianas.

Las estrategias de gating utilizadas para cuantificar la unión de VLP de norovirus humanos a las bacterias commensales se muestran en la Figura 1. Punto de densidad representativa proporciona una visión general de cómo se encerradon las muestras para eliminar los desechos celulares y los grumos celulares, por lo que se determinó la conexión de VLP en las poblaciones de singlete(Figura 1A). Los histogramas re...

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Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

El objetivo de este protocolo es cuantificar la unión del norovirus humano del patógeno eucariota a las bacterias. Después de realizar un ensayo inicial de apego a la bacteria del virus, la citometría de flujo se utiliza para detectar bacterias ligadas viralmente dentro de la población.

Cuantificación de partículas similares al virus del norovirus humanos que se unen a bacterias comensales mediante citometría de flujo

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

Las interacciones virus-bacterianas pueden ser importantes para una infección viral exitosa y la estimulación de una respuesta inmunitaria del huésped. Pero actualmente, las existencias altamente concentradas y purificadas de norovirus humano no se pueden producir en el laboratorio. Esta técnica se puede utilizar con cualquier virus que se une a las bacterias, para los cuales hay partículas similares a virus o virus vivos.Nos permite cuantificar las interacciones entre estos virus y bacterias. Inocular cinco mililitros de medio líquido con una sola colonia aislada de Enterobacter cloacae de una placa de agar directamente de un caldo de glicerol congelado. Crecer las bacterias de la noche a la mañana.Al día siguiente, transfiera 1,3 mililitros alícuotas del cultivo a dos tubos separados de centrífuga de 1,5 mililitros. Centrifugar los tubos a 10.000 x g durante cinco minutos. Retire los sobrenadantes y, a continuación, lave las muestras dos veces con un mililitro de 1 PBS estéril para cada lavado.Centrifugar las muestras de nuevo a 10.000 x g durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y resusppend el pellet en 1,3 mililitros de 1X PBS estéril. A partir de 0,5 mililitros de cultivo lavado, diluir en serie las bacterias en 1X PBS de 10 a menos uno a 10 a menos cuatro.Usando un espectrofotómetro, mida la densidad óptica del cultivo lavado sin diluir y cada una de las cuatro diluciones a 600 nanómetros. Realice diluciones seriales de 10 veces en 1X PBS para cada una de las diluciones anteriores. Esparza 100 microlitros de las últimas tres diluciones para cada serie en placas de agar para determinar el número de unidades formadoras de colonias por mililitro para cada muestra.Deje que las placas se sequen a temperatura ambiente durante cinco minutos. Invierta las placas e incubarlas en la incubadora. Después de preparar los reactivos, anticuerpos y bacterias como se describe en el manuscrito, ensamble todos los materiales en un gabinete de bioseguridad BSL-2.Las partículas similares a virus para el norovirus humano se enumeran como patógenos BSL-2 y todo el trabajo realizado con VLP debe llevarse a cabo en un gabinete de bioseguridad certificado. Añadir 10 microgramos de VLFP de norovirus humanos a cada tubo de bacterias y mezclar a fondo por pipeteo. Incubar los tubos durante una hora a 37 grados Celsius con rotación constante.Después de la incubación, centrifugar los tubos a 10.000 x g durante cinco minutos. Aspirar y desechar el sobrenadante y resuspender el pellet bacteriano en un mililitro de PBS. Después de repetir los pasos de lavado una vez, centrifugar los tubos de nuevo a 10.000 X g durante cinco minutos.Deseche el sobrenadante y resuspendir el pellet de bacterias VLP en 150 microlitros de 5% tampón de bloqueo. Un error común que ocurre es que los tubos se intercambian y se agrega el tratamiento incorrecto. Para evitarlo, organizar todos los tubos en líneas que correspondan al tratamiento correcto y añadir un tratamiento a la vez a los tubos.Para cada muestra bacteriana, prepare 50 microlitros de anticuerpos iGE de norovirus humano diluido. Usando un tampón de bloqueo del 5%, diluya el anticuerpo del uno al 125 para las muestras de E.cloacae. Preparar 50 microlitros de anticuerpos isotipos diluidos para cada muestra bacteriana utilizando las mismas proporciones de dilución.Divida cada muestra de ensayo de unión en alícuotas de 350 microlitros transfiriéndolas a tubos limpios de centrífuga de 1,5 mililitros. Para crear controles no manchados, añada 50 microlitros de tampón de bloqueo a la primera alícuota de cada muestra bacteriana. Para las muestras manchadas, añada 50 microlitros de la dilución de anticuerpos INDICE al segundo conjunto de alícuotas.Cree los controles isotipos añadiendo 50 microlitros del anticuerpo isotipo diluido al tercer conjunto de alícuotas. Incubar todas las muestras sobre hielo y en la oscuridad durante 30 minutos. Luego centrifuga todas las muestras a 10.000 X g durante cinco minutos.Desechar los sobrenadantes y resuspender cada muestra en 150 microlitros de FCSB. Una vez más, centrifugar todas las muestras a 10.000 X g durante cinco minutos. Una vez más, desechar los sobrenadantes y resuspender las muestras en 100 microlitros de FCSB.Después de centrifugar las muestras una última vez y descartar los sobrenadantes, resuspender las muestras en 150 microlitros de FCSB. Transfiera cada muestra a un tubo que contenga 400 microlitros de FCSB para un volumen total de 550 microlitros. Almacene las muestras en 4 grados Celsius hasta que sean analizadas por citometría de flujo.La fijación de VLP se midió utilizando citometría de flujo. En primer lugar, se utilizaron parcelas de densidad para eliminar los desechos celulares, seguidos de la posterior parcela de puntos para eliminar dobletes bacterianos y grumos celulares. Los histogramas representativos demuestran la falta de señal de PE en muestras bacterianas solamente y un cambio en la intensidad de la señal de PE en las muestras VLP:bacterium en comparación con los controles no manchados e isotipos.Después de una hora de incubación con 10 microgramos de VLP, la citometría de flujo detectó la unión de partículas a E.colacae y L.gasseri. Para determinar el límite de cuantificación vinculante para este ensayo, se generó una serie de dilución de los VMP antes de agregar a las bacterias. Las reducciones en la cantidad de VLP resultaron en reducciones correspondientes al porcentaje de bacterias unidas por VLP.Conocer la relación virus:bacterium y mantener la relación consistente entre los experimentos es importante para interpretar los resultados. Se pueden generar mutantes bacterianos y virales para determinar específicamente las estructuras de superficie microbiana que median esta interacción. Esta técnica permite a los investigadores responder preguntas sobre circunstancias y condiciones que afectan las interacciones norovirus-bacterianas, incluyendo cómo los cambios en el genotipo del virus, las condiciones de crecimiento bacteriano y los cambios en las estructuras superficiales bacterianas alteran la unión viral.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

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Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Investigación

Inmunología e Infección

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Un método simple y eficiente para detectar la activación del factor nuclear en neutrófilos humanos por citometría de flujo

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Modelado El ciclo de vida de Ebola Virus Bajo Nivel de Bioseguridad 2 Condiciones Con-Virus como partículas que contienen Tetracistronic minigenomas

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

Un protocolo simple y rápida para no enzimáticamente disociarse Tejidos Humanos frescas para el Análisis de los linfocitos infiltrantes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry

Las células dendríticas humanas de pulmón: distribución espacial y fenotípica de identificación en endobronquial biopsias mediante inmunohistoquímica y citometría de flujo

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

La medición de células T Alorreactividad recurriendo a imágenes de Citometría de Flujo

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Análisis cualitativo y cuantitativo de la sinapsis inmune en el sistema humano utilizando imágenes de citometría de flujo

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Caracterización de subconjuntos de monocitos humanos de sangre análisis de citometría de flujo

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Preparación de la médula ósea entera para el análisis de citometría de masa de células de linaje neutrófilo

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...