Name: quantifying human norovirus virus-like particles binding to commensal bacteria using flow cytometry
Uploaded: 2020-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry at JoVE.com

Vi vill tacka Sutonuka Bhar och Chanel Mosby-Haundrup för deras kritiska granskning av det skriftliga manuskriptet, liksom Alfonso Carrillo för hjälp med att generera bakteriella standardkurvor. Detta arbete finansieras delvis av ett bidrag från National Institute of Health (R21AI140012) och av ett frö bidrag från University of Florida, Institute of Food and Agricultural Sciences.

OBS: De bakterietillväxtförhållanden som beskrivs i protokollet är standardodlingsförhållanden för Enterobacter cloacae och Lactobacillus gasseri. För att utföra viruset: bakterier fastsättning analys med andra bakteriearter, bör de valda bakterierna odlas under standardförhållanden som är lämpliga för bakterien.
1. Förbereda bakteriell tillväxt Medium
<ol><li>
Enterobacter cloacae tillväxt media<ol>
<li>Förbered flytande medium genom att lösa ...

<ol>
	<li>Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+global+burden+of+noroviruses+and+opportunities+for+prevention.">New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention.</a> Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).</li><li>Jones, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+bacteria+promote+human+and+mouse+norovirus+infection+of+B+cells.">Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells.</a> Science. 346 (6210), 755-759 (2014).</li><li>Baldridge, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commensal+microbes+and+interferon-lambda+determine+persistence+of+enteric+murine+norovirus+infection.">Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection.</a> Science. 347 (6219), 266-269 (2015).</li><li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterobacter+cloacae+inhibits+human+norovirus+infectivity+in+gnotobiotic+pigs.">Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs.</a> Scientific reports. 6, 25017 (2016).</li><li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Protective+Efficacy+of+Probiotics+and+Rice+Bran+against+Human+Norovirus+Infection+and+Diarrhea+in+Gnotobiotic+Pigs.">High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1699 (2016).</li><li>Rodr&#237;guez-D&#237;az, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+secretor+status+genotype+and+microbiota+composition+in+susceptibility+to+rotavirus+and+norovirus+infections+in+humans.">Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans.</a> Scientific Reports. 7, 45559 (2017).</li><li>Erickson, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+Facilitate+Enteric+Virus+Co-infection+of+Mammalian+Cells+and+Promote+Genetic+Recombination.">Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination.</a> Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).</li><li>Kuss, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+microbiota+promote+enteric+virus+replication+and+systemic+pathogenesis.">Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis.</a> Science. 334 (6053), 249-252 (2011).</li><li>Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lipopolysaccharide+binding+enhances+virion+stability+and+promotes+environmental+fitness+of+an+enteric+virus.">Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus.</a> Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).</li><li>Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+and+bacterial+envelope+components+enhance+mammalian+reovirus+thermostability.">Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability.</a> PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768 (2017).</li><li>Miura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histo-blood+group+antigen-like+substances+of+human+enteric+bacteria+as+specific+adsorbents+for+human+noroviruses.">Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses.</a> Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).</li><li>Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+norovirus+binding+to+select+bacteria+representative+of+the+human+gut+microbiota.">Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota.</a> PLOS One. 12 (3), (2017).</li><li>Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Related+enteric+viruses+have+different+requirements+for+host+microbiota+in+mice.">Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice.</a> Journal of Virology. , (2019).</li><li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids.">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li><li>Van Dycke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+human+norovirus+replication+model+in+zebrafish+larvae.">A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae.</a> PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009 (2019).</li><li>Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+to+histo-blood+group+antigen-expressing+bacteria+protects+human+norovirus+from+acute+heat+stress.">Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 659 (2015).</li><li>Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+norovirus+binding+to+gut-associated+bacterial+ligands.">Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands.</a> BMC Research Notes. 12 (1), 607 (2019).</li><li>Debbink, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within-host+evolution+results+in+antigenically+distinct+GII.4+noroviruses.">Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses.</a> Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).</li><li>Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Norwalk+virus-like+particles+to+ABH+histo-blood+group+antigens+is+blocked+by+antisera+from+infected+human+volunteers+or+experimentally+vaccinated+mice.">Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice.</a> Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).</li><li>Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+capture+with+histo-blood+group+antigens+reveals+novel+virus-ligand+interactions.">Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions.</a> Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).</li><li>Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GII.4+Human+Norovirus:+Surveying+the+Antigenic+Landscape.">GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape.</a> Viruses. 11 (2), (2019).</li><li>Prasad, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystallographic+structure+of+the+Norwalk+virus+capsid.">X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid.</a> Science. 286 (5438), 287-290 (1999).</li><li>Baric, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+self-assembly+of+norwalk+virus+capsid+protein+from+venezuelan+equine+encephalitis+virus+replicons.">Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons.</a> Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).</li><li>Rubio-del-Campo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noroviral+p-particles+as+an+in+vitro+model+to+assess+the+interactions+of+noroviruses+with+probiotics.">Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics.</a> PLOS One. 9 (2), 89586 (2014).</li><li>Tan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+modifications+of+norovirus+P+domain+resulted+in+a+new+type+of+subviral+particles,+the+small+P+particles.">Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles.</a> Virology. 410 (2), 345-352 (2011).</li></ol>

Förmågan att kvantifiera bindning av enteriska virus till bakterier är ett kritiskt första steg för att belysa de mekanismer genom vilka dessa bakterier förändrar virusinfektion. De metoder som beskrivs häri har optimerats för att mäta humant norovirus VLP interaktioner med både E. cloacae (gramnegativa bakterien) och L. gasseri (en grampositiv bakterie), men kan anpassas för användning med alla däggdjursvirus och bakterie av intresse. Medan VLPs är ett id...

Humana norovirus (HuNoVs) är den främsta orsaken till gastrointestinal sjukdom över hela världen, som ansvarar för 685 miljoner infektioner och över 200.000 dödsfall varje år1. Som med andra enteriska virus, förekomsten av commensal bakterier har visat sig öka infektion av denna patogen samt dess surrogatvirus, murine norovirus2,3. Det finns också motstridiga rapporter om att bakterier kan hämma infektion av humant norovirus4,,5,6. För flera virus verkar direkt interaktion mellan viruset och bakterier ligga bakom de mekanismer som påverkar virusinfektion2,7,8,9,10, och det har visats genom elektronmikroskopi att humana norovirus binder direkt till ytan av bakterier11,12. Därför har karakterisering av dessa interaktioner blivit avgörande för att bestämma de mekanismer genom vilka bakterier påverkar virusinfektion. Denna karakterisering har klassiskt börjat med att kvantifiera viral bindning till en rad bakteriearter som är komponenter i värdmikrobiomet7,,12,13. Dessa bifogad fil analyser inte bara avslöja mängden virus bunden till bakterier, men också stöd för att fastställa effekterna av denna interaktion på viral kondition och överlevnad.
För att kvantifiera viral kvarstad, traditionellt använda metoder inkluderar PCR-baserade analyser som kvantifierar virala genom12 eller generering av radioaktivt märkt virus och användning av scintillation räkna för att kvantifiera viruspartiklar7,8,9,13. Användningen av dessa metoder kräver i allmänhet tillgång till högiterviruslager och in vitro-odlingstekniker för att generera dem. Medan flera kultursystem för humant norovirus nu finns2,14,15, stöder ingen den robusta replikering som krävs för att generera dessa starkt koncentrerade bestånd som begränsar eller eliminerar användningen av PCR och scintillation räkna för att kvantifiera humant norovirus /bakteriella interaktioner.
För att kringgå detta problem, virusliknande partiklar (VLPs) kan användas som ett surrogat för att leva virus för att undersöka interaktioner mellan mänskliga norovirus och bakterier16,17. Vlps är icke-infektiösa partiklar som liknar det virus som de härrör från. När det gäller humant norovirus genereras dessa partiklar från uttrycket av VP1 -proteinet (och någon gång VP2)-proteinet, som självmonterar för att skapa intakta viruskapsider som saknar genetiskt material (dvs. RNA för norovirus). Dessa VLPs har väl karakteriserats, är strukturellt och antigeniskt liknar de vilda virus från vilka de härstammar18,19,20,21,22,23. Därför fungerar VLPs som ett idealiskt surrogat för att undersöka ytan interaktioner mellan mänskliga norovirus och commensal bakterier. Med tanke på att VLPs saknar genetiskt material kan PCR-baserade analyser inte användas för att kvantifiera virusbindning. En antikroppsbaserad flödescytometrimetod har tidigare beskrivits och kan detektera låga nivåer av VLP-bindning till bakterier på ett semikvantativt sätt16. Denna metod har optimerats för att möjliggöra exakt kvantifiering av humant norovirus VLP bindning till både gramnegativa och grampositiva commensalbakterier16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7002</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaeroPack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R681001</td>
			<td>Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FacsDiva software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1605</td>
			<td>Used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554657</td>
			<td>Used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12473281</td>
			<td>Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRS Powder</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>288130</td>
			<td>Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MA5-18241</td>
			<td>Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norovirus GII.4 VLP</td>
			<td>Creative Biostructure</td>
			<td>CBS-V700</td>
			<td>human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP665</td>
			<td>Dilute to 1X prior to use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S10467</td>
			<td>Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td>Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying human norovirus virus-like particles binding to commensal bacteria using flow cytometry

Commensal bakterier är väl etablerade för att påverka infektion av eukaryota virus. Direkt bindning mellan patogenen och värdmikrobiomet är ansvarig för att ändra infektion för många av dessa virus. Således, karakterisera arten av virus-bakterier bindande är ett grundläggande steg som behövs för att belysa den mekanism (er) genom vilken bakterier ändra virusinfektion. För humant norovirus, commensal bakterier förbättra B-cellinfektion. Viruset binder direkt till dessa bakterier, vilket tyder på att denna direkta interaktion är involverad i mekanismen för infektionsförbättring. En mängd olika tekniker kan användas för att kvantifiera interaktioner mellan bakterier och virus, inklusive scintillation räkna radiolabeled virus och polymeras kedjereaktion (PCR). Båda metoderna kräver användning av levande virus, som kan behöva genereras i laboratoriet. För närvarande är inget av de etablerade in vitro-odlingssystem som finns tillgängliga för humant norovirus tillräckligt robusta för att möjliggöra generering av starkt koncentrerade viruslager. I stället för levande virus har virusliknande partiklar (VLPs) använts för att karakterisera samspelet mellan norovirus och bakterier. Häri beskrivs en flödescytometrimetod med användningar av virusspecifika antikroppar för att kvantifiera VLP-bindning till gramnegativa och grampositiva bakterier. Införande av endast bakterier och isotypkontroller som är tillåtna för optimering av analysen för att minska bakgrundsantikroppsbindning och exakt kvantifiering av VLP-fastsättning på de testade bakterierna. Höga VLP:bakterieförhållanden resulterar i VLPs som binder till stora andelar av bakteriepopulationen. Men när VLP-mängder minskas minskar också andelen bakterier som är bundna. I slutändan kan denna metod användas i framtida experiment som belyser de specifika villkor och strukturella komponenter som reglerar norovirus:bakteriella interaktioner.

De gatingstrategier som används för att kvantifiera VLP-bindning av humant norovirus till commensalbakterier visas i figur 1. Representativ densitet punkt ger en översikt över hur prover var gated att eliminera cellulära skräp och cell klumpar så VLP fastsättning fastställdes på singlet populationer (figur 1A). Representativa histogram visar låga nivåer av anti-norovirus antikroppssignal i bakterier e...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry at JoVE.com

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

Målet med detta protokoll är att kvantifiera bindningen av eukaryota patogenen humant norovirus till bakterier. Efter att ha utfört en första virusbakterien fastsättningsanalys, flöde cytometri används för att upptäcka viralt bundna bakterier inom befolkningen.

Kvantifiera Human Norovirus Virus-liknande partiklar bindning till commensal bakterier med hjälp av flow cytometri

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

Virus-bakterieinteraktioner kan vara viktiga för framgångsrik virusinfektion och stimulering av ett värd immunsvar. Men för närvarande, mycket koncentrerad och renad lager av mänskliga norovirus kan inte produceras i labbet. Denna teknik kan användas med alla virus som binder till bakterier, för vilka antingen virusliknande partiklar eller levande virus finns tillgängliga.Det gör det möjligt för oss att kvantifiera interaktioner mellan dessa virus och bakterier. Inokulera fem milliliter flytande medium med en enda isolerad koloni av Enterobacter cloacae från en agarplatta direkt från fryst glycerol lager. Odla bakterierna över natten.Följande dag överför 1,3 milliliter alikvoter av kulturen till två separata 1,5 milliliter centrifugrör. Centrifugera rören vid 10, 000 x g i fem minuter. Ta bort supernatanterna och tvätta sedan proverna två gånger med en milliliter steril 1X PBS för varje tvätt.Centrifugera proverna igen vid 10, 000 x g i fem minuter. Ta bort supernatanten och resuspend pelleten i 1,3 milliliter steril 1X PBS. Från och med 0,5 milliliter tvättad kultur, seriellt späd bakterierna i 1X PBS från 10 till minus en till 10 till minus fyra.Med hjälp av en spektrofotometer, mäta den optiska densiteten hos den tvättade outspädda kulturen och var och en av de fyra utspädningar vid 600 nanometer. Utför 10-faldiga serieutspädningar i 1X PBS för var och en av de tidigare spädningarna. Sprid 100 mikroliter av de tre sista utspädningarna för varje serie på agarplattor för att bestämma antalet kolonibildande enheter per milliliter för varje prov.Låt plattorna torka i rumstemperatur i fem minuter. Invertera plattorna och inkubera dem i inkubatorn. Efter att ha förberett reagenserna, antikropparna och bakterierna enligt beskrivningen i manuskriptet, monterar du alla material i ett BSL-2-skåp för biosäkerhet.Virusliknande partiklar för humant norovirus är listade som BSL-2 patogener och allt arbete utför med hjälp av VLP bör utföras i en certifierad biosäkerhet skåp. Tillsätt 10 mikrogram humant norovirus VLPs till varje tub av bakterier och blanda noggrant genom pipettering. Inkubera rören i en timme i 37 grader Celsius med konstant rotation.Efter inkubation, centrifugera rören vid 10, 000 x g i fem minuter. Aspirera och kassera supernatanten och resuspend bakteriepelleten i en milliliter av PBS. Efter att tvätta stegen en gång, centrifugera rören igen vid 10, 000 X g i fem minuter.Kassera supernatanten och resuspend VLP-bakteriepelleten i 150 mikroliter av 5%-blockerande buffert. Ett vanligt fel som uppstår är att rör byts ut och fel behandling läggs till. För att förhindra detta, ordna alla rör i linjer som motsvarar rätt behandling och lägg till en behandling på en gång till rören.För varje bakterieprov, preparera 50 mikroliter av utspädd human norovirus GII-antikropp. Med hjälp av 5%blockerande buffert, späd antikroppen en till 125 för E.cloacae prover. Bered 50 mikroliter av utspädd isotypantikropp för varje bakterieprov med samma utspädningsförhållanden.Dela upp varje fästanalysprov i 350 alikvoter med mikroliter genom att överföra dem till rena centrifugrör på 1,5 milliliter. För att skapa ofläckade kontroller, lägg till 50 mikroliter av blockerande buffert till den första alikvoten från varje bakterieprov. För de färgade proverna, tillsätt 50 mikroliter av GII-antikroppsutspädningen till den andra uppsättningen alikvoter.Skapa isotype-kontrollerna genom att lägga till 50 mikroliter av den utspädda isotyp-antikroppen till den tredje uppsättningen alikvoter. Inkubera alla prover på is och i mörker i 30 minuter. Sedan centrifugera alla prover på 10, 000 X g i fem minuter.Kassera supernatanterna och resuspend varje prov i 150 mikroliter av FCSB. Återigen centrifugera alla prover vid 10, 000 X g i fem minuter. Återigen, kasta supernatanterna och resuspend proverna i 100 mikroliter av FCSB.Efter att ha centrifugerat proverna en sista gång och kasserat supernatanterna, återanvänder du proverna i 150 mikroliter av FCSB. Överför varje prov till ett rör som innehåller 400 mikroliter av FCSB för en total volym på 550 mikroliter. Förvara proverna på 4 grader Celsius tills de analyseras av flödescytometri.VLP-fastsättning mättes med hjälp av flödescytometri. Först densitet tomter användes för att gate ut cellulära skräp, följt av efterföljande dot tomt gating att ta bort bakteriella dubbletar och cellulära klumpar. Representativa histogram visar brist på PE-signal i bakteriella endast prover och en förskjutning i PE signalintensitet i VLP:bakterieprover jämfört med obeskrivliga och isotyp kontroller.Efter en timmes inkubation med 10 mikrogram VLP, upptäckte flödescytometri partikelbindning till både E.colacae och L.gasseri. För att bestämma gränsen för bindningskvantifiering för denna analys genererades en utspädningsserie av VLP före tillägg till bakterierna. Minskningar av mängden VLP resulterade i motsvarande minskningar till de procentiga bakterier som binds av VLP.Att känna till förhållandet virus:bakterie och hålla förhållandet konsekvent mellan experiment är viktigt för att tolka resultat. Bakteriella och virala mutanter kan genereras för att specifikt bestämma de mikrobiella ytstrukturer som förmedlar denna interaktion. Denna teknik gör det möjligt för forskare att svara på frågor om omständigheter och tillstånd som påverkar norovirus-bakteriell interaktioner, inklusive hur förändringar i virus genotyp, bakterietillväxt villkor, och förändringar i bakteriella ytstrukturer ändra viral bindning.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Mänskliga In Vitro Suppression som screeningmetod för erkännande av en tidig staten Immune obalans

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

En enkel och effektiv metod för att upptäcka Nuclear Factor Aktivering av humana neutrofiler genom flödescytometri

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Modellering livscykel Ebola Virus Under skyddsnivå 2 Villkor Med virusliknande partiklar innehållande Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

En enkel och snabb protokoll till icke enzymatiskt dissociera Färska mänskliga vävnader för analys av lymfocyter

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry

Human Lung dendritiska celler: Spatial distribution och fenotypisk identifiering i bronkerna Biopsier Använda Immunohistokemi och flödescytometri

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Mätning av T-cell alloreaktivitet Använda Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Kvalitativ och kvantitativ analys av immun synapsen i det mänskliga systemet använder Imaging flödescytometri

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolering och In Vitro kultur av murina och mänskliga alveolära makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Karakterisering av mänskliga monocyt delmängder av helblod Flow flödescytometri analys

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Beredning av hela benmärgen för Masscytometri analys av neutrofila-Lineage celler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...