Name: quantifying human norovirus virus-like particles binding to commensal bacteria using flow cytometry
Uploaded: 2020-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry at JoVE.com

Sutonuka Bhar ve Chanel Mosby-Haundrup'a yazılı el yazmasının eleştirel incelemesi için teşekkür etmek istiyoruz, ayrıca Alfonso Carrillo'ya bakteriyel standart eğriler üretme konusunda yardımcı olmaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüsü'nün (R21AI140012) bir hibesi ve Florida Üniversitesi, Gıda ve Tarım Bilimleri Enstitüsü'nden bir tohum hibesi ile finanse edilmektedir.

NOT: Protokolde belirtilen bakteriyel büyüme koşulları Enterobacter cloacae ve Lactobacillus gasseriiçin standart kültür koşullarıdır. Virüsün diğer bakteri türleri ile bakteri eki testi gerçekleştirmek için, seçilen bakteriler bakteri için uygun standart koşullar altında kültürlü olmalıdır.
1. Bakteriyel Büyüme Ortamının Hazırlanması
<ol><li>
Enterobacter cloacae büyüme ortamı<ol>
<li>10 g tripton, 5 g maya ekstresi ve 10 g sodyu...

<ol>
	<li>Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+global+burden+of+noroviruses+and+opportunities+for+prevention.">New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention.</a> Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).</li><li>Jones, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+bacteria+promote+human+and+mouse+norovirus+infection+of+B+cells.">Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells.</a> Science. 346 (6210), 755-759 (2014).</li><li>Baldridge, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commensal+microbes+and+interferon-lambda+determine+persistence+of+enteric+murine+norovirus+infection.">Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection.</a> Science. 347 (6219), 266-269 (2015).</li><li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterobacter+cloacae+inhibits+human+norovirus+infectivity+in+gnotobiotic+pigs.">Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs.</a> Scientific reports. 6, 25017 (2016).</li><li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Protective+Efficacy+of+Probiotics+and+Rice+Bran+against+Human+Norovirus+Infection+and+Diarrhea+in+Gnotobiotic+Pigs.">High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1699 (2016).</li><li>Rodr&#237;guez-D&#237;az, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+secretor+status+genotype+and+microbiota+composition+in+susceptibility+to+rotavirus+and+norovirus+infections+in+humans.">Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans.</a> Scientific Reports. 7, 45559 (2017).</li><li>Erickson, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+Facilitate+Enteric+Virus+Co-infection+of+Mammalian+Cells+and+Promote+Genetic+Recombination.">Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination.</a> Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).</li><li>Kuss, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+microbiota+promote+enteric+virus+replication+and+systemic+pathogenesis.">Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis.</a> Science. 334 (6053), 249-252 (2011).</li><li>Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lipopolysaccharide+binding+enhances+virion+stability+and+promotes+environmental+fitness+of+an+enteric+virus.">Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus.</a> Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).</li><li>Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+and+bacterial+envelope+components+enhance+mammalian+reovirus+thermostability.">Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability.</a> PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768 (2017).</li><li>Miura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histo-blood+group+antigen-like+substances+of+human+enteric+bacteria+as+specific+adsorbents+for+human+noroviruses.">Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses.</a> Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).</li><li>Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+norovirus+binding+to+select+bacteria+representative+of+the+human+gut+microbiota.">Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota.</a> PLOS One. 12 (3), (2017).</li><li>Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Related+enteric+viruses+have+different+requirements+for+host+microbiota+in+mice.">Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice.</a> Journal of Virology. , (2019).</li><li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids.">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li><li>Van Dycke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+human+norovirus+replication+model+in+zebrafish+larvae.">A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae.</a> PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009 (2019).</li><li>Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+to+histo-blood+group+antigen-expressing+bacteria+protects+human+norovirus+from+acute+heat+stress.">Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 659 (2015).</li><li>Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+norovirus+binding+to+gut-associated+bacterial+ligands.">Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands.</a> BMC Research Notes. 12 (1), 607 (2019).</li><li>Debbink, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within-host+evolution+results+in+antigenically+distinct+GII.4+noroviruses.">Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses.</a> Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).</li><li>Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Norwalk+virus-like+particles+to+ABH+histo-blood+group+antigens+is+blocked+by+antisera+from+infected+human+volunteers+or+experimentally+vaccinated+mice.">Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice.</a> Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).</li><li>Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+capture+with+histo-blood+group+antigens+reveals+novel+virus-ligand+interactions.">Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions.</a> Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).</li><li>Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GII.4+Human+Norovirus:+Surveying+the+Antigenic+Landscape.">GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape.</a> Viruses. 11 (2), (2019).</li><li>Prasad, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystallographic+structure+of+the+Norwalk+virus+capsid.">X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid.</a> Science. 286 (5438), 287-290 (1999).</li><li>Baric, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+self-assembly+of+norwalk+virus+capsid+protein+from+venezuelan+equine+encephalitis+virus+replicons.">Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons.</a> Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).</li><li>Rubio-del-Campo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noroviral+p-particles+as+an+in+vitro+model+to+assess+the+interactions+of+noroviruses+with+probiotics.">Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics.</a> PLOS One. 9 (2), 89586 (2014).</li><li>Tan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+modifications+of+norovirus+P+domain+resulted+in+a+new+type+of+subviral+particles,+the+small+P+particles.">Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles.</a> Virology. 410 (2), 345-352 (2011).</li></ol>

Enterik virüslerin bakterilere bağlanmasını ölçebilme yeteneği, bu bakterilerin viral enfeksiyonu değiştirme mekanizmalarını açıklamak için kritik bir ilk adımdır. Burada açıklanan yöntemler hem E. cloacae (gram-negatif bakteri) hem de L. gasseri (gram-pozitif bakteri) ile insan norovirüs VLP etkileşimlerini ölçmek için optimize edilmiştir, ancak herhangi bir memeli virüsü ve ilgi bakterisi ile kullanılmak üzere uyarlanabilir. VLPs ek tahlill...

İnsan norovirüsler (HuNoVs) gastrointestinal hastalığın dünya çapında önde gelen nedeni, 685 milyon enfeksiyonlar ve 200.000 üzerinde ölümher yıl1sorumlu. Diğer enterik virüsler gibi, kommensal bakterilerin varlığı bu patojen enfeksiyonu geliştirmek için gösterilmiştir yanı sıra onun vekil virüs, murine norovirus2,3. Ayrıca bakterilerin insan norovirüs4,5,5,6tarafından enfeksiyonu inhibe edebilir çelişkili raporlar vardır. Çeşitli virüsler için, virüs ve bakteriler arasındaki doğrudan etkileşim viral enfeksiyon etkileyen mekanizmaların altında yatan görünür2,7,8,9,10, ve insan norovirüsler bakterilerin yüzeylerine doğrudan bağlamak elektron mikroskopisi ile gösterilmiştir11,12. Bu nedenle, bu etkileşimleri karakterize hangi bakteri viral enfeksiyon etkisi mekanizmaları belirlemek için kritik hale gelmiştir. Bu karakterizasyon klasik konak mikrobiyombileşenleriolan bakteri türlerinin bir dizi viral bağlayıcı niceleme ile başladı7 ,12,13. Bu eki tahliller sadece bakteri bağlı virüs miktarını ortaya çıkarmak değil, aynı zamanda viral fitness ve hayatta kalma bu etkileşimin etkisini belirlemede yardımcı.
Viral eki ölçmek için, geleneksel olarak kullanılan yöntemler viral genomlar ölçmek PCR tabanlı tahliller içerir12 veya radyoetiketli virüs üretimi ve viral parçacıklar ölçmek için sintillation sayma kullanımı7,8,9,13. Bu yöntemlerin kullanımı genellikle yüksek titer virüs stokları ve bunları oluşturmak için in vitro ekim teknikleri erişim gerektirir. İnsan norovirüs için çeşitli kültür sistemleri şimdi var iken2,14,15, hiçbiri kısıtlar veya pcr ve sintillation kullanımını ortadan kaldırır bu son derece konsantre stokları oluşturmak için gerekli sağlam çoğaltma desteği insan norovirüs / bakteriyel etkileşimleri ölçmek için sayma.
Bu sorunu aşmak için, virüs benzeri parçacıklar (VLPs) insan norovirüs ve bakteri arasındaki etkileşimleri araştırmak için virüs yaşamak için bir vekil olarak kullanılabilir16,17. VLP'ler, türetildiği virüse yakından benzeyen enfeksiyöz olmayan parçacıklardır. İnsan norovirüs durumunda, bu parçacıklar VP1 (ve bazen VP2) protein, kendi kendine genetik malzeme (yani, Noroviruses için RNA) eksik bozulmamış viral kapsidler oluşturmak için monte ifadesi oluşturulur. Bu VLP'ler iyi karakterize edilmiştir, yapısal ve antijektolojik olarak onlar türetilmiştir hangi vahşi tip virüsler benzer18,19,20,21,22,23. Bu nedenle, VLPs insan norovirüs ve kommensal bakteriler arasındaki yüzey etkileşimleri araştırmak için ideal bir vekil olarak hizmet vermektedir. VLP'lerin genetik materyalden yoksun olduğu göz önüne alındığında, PCR tabanlı testler viral bağlanmayı ölçmek için kullanılamaz. Antikor bazlı akış sitometri yöntemi daha önce tanımlanmış ve yarı-nicel bir şekilde bakterilere bağlama VLP bağlama düşük seviyelerde tespit edebiliyoruz16. Bu yöntem, hem gram-negatif hem de gram-pozitif kommensal bakterilere bağlanan insan norovirüs VLP'nin doğru nicelemesi için optimize edilerek optimize edildi16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7002</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaeroPack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R681001</td>
			<td>Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FacsDiva software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1605</td>
			<td>Used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554657</td>
			<td>Used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12473281</td>
			<td>Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRS Powder</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>288130</td>
			<td>Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MA5-18241</td>
			<td>Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norovirus GII.4 VLP</td>
			<td>Creative Biostructure</td>
			<td>CBS-V700</td>
			<td>human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP665</td>
			<td>Dilute to 1X prior to use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S10467</td>
			<td>Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td>Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td>Used for media preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying human norovirus virus-like particles binding to commensal bacteria using flow cytometry

Kommensal bakteriler ökaryotik virüslerin enfeksiyonunu etkilemek için iyi kurulmuştur. Patojen ve konak mikrobiyom arasında doğrudan bağlanma bu virüslerin çoğu için enfeksiyon değiştirme sorumludur. Bu nedenle, virüs-bakteri bağlanmasının doğası nın karakterize ilerlediği, bakterilerin viral enfeksiyonu değiştirdiği mekanizmanın (lar) aydınlatılabilmek için gerekli temel bir adımdır. Insan norovirüs için, kommensal bakteriler B hücre enfeksiyonu geliştirmek. Virüs doğrudan bu bakterilere bağlanır, bu doğrudan etkileşim enfeksiyon geliştirme mekanizması nda yer aldığını gösteren. Radyoetiketli virüslerin sinilasyon sayımı ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) dahil olmak üzere bakteri ve virüsler arasındaki etkileşimleri ölçmek için çeşitli teknikler kullanılabilir. Her iki yöntem de laboratuvarda oluşturulması gerekebilir canlı virüs, kullanımını gerektirir. Şu anda, insan norovirüs için mevcut kurulan in vitro kültür sistemlerinin hiçbiri son derece konsantre viral stokların üretimi için izin vermek için yeterince sağlam. Canlı virüs yerine, virüs benzeri parçacıklar (VLPs) norovirüs ve bakteri arasındaki etkileşimleri karakterize etmek için kullanılmıştır. Burada bir akış sitometri yöntemi gram-negatif ve gram-pozitif bakterilere VLP bağlayıcı ölçmek için virüs özgü antikorlar kullanır ile açıklanmıştır. Sadece bakterilerin ve izotip kontrollerinin dahil edilmesi, arka plan antikor bağlanmasını ve TEST EDILEN bakterilere VLP ekinin doğru nicelemeyi azaltmak için tahminin optimizasyonuna izin ver. Yüksek VLP:bakteri oranları VLP'lerin bakteri popülasyonunun büyük yüzdelerine bağlanmasına neden olur. Ancak, VLP miktarları azaldığında, bakterilerin yüzde bağlı da azalır. Sonuç olarak, bu yöntem norovirüs düzenleyen belirli koşulları ve yapısal bileşenleri açıklığa kavuşturan gelecekteki deneylerde kullanılabilir: bakteri etkileşimleri.

Kommensal bakterilere bağlanan insan norovirüs VLP'yi ölçmek için kullanılan gating stratejileri Şekil 1'degösterilmiştir. Temsili yoğunluk nokta, hücresel enkaz ve hücre kümelerini ortadan kaldırmak için numunelerin nasıl geçitlendiğine genel bir bakış sağlar, böylece VLP eki tekli popülasyonlarda belirlenir(Şekil 1A). Temsili histogramlar, sadece norovirüs VLP'si olmayan bakterilerde d?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry at JoVE.com

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

Bu protokolün amacı ökaryotik patojen insan norovirüsünün bakterilere bağlanmasını ölçmektir. İlk virüs-bakteri eki testi yaptıktan sonra, akış sitometrisi popülasyon içinde viral bağlı bakterileri tespit etmek için kullanılır.

Akış Sitometrikullanarak Commensal Bakterilere Bağlanan İnsan Norovirüs Benzeri Partiküllerin Ölçülmesi

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

Virüs-bakteriyel etkileşimler başarılı viral enfeksiyon ve bir konak bağışıklık yanıtı stimülasyonu için önemli olabilir. Ama şu anda, son derece konsantre ve insan norovirüs saf stok laboratuvarda üretilemez. Bu teknik, virüs benzeri parçacıklar veya canlı virüs mevcut olan bakterilere bağlanan herhangi bir virüs ile kullanılabilir.Bu virüsler ve bakteriler arasındaki etkileşimleri ölçmemizi sağlar. Doğrudan dondurulmuş gliserol stokbir agar plaka enterobacter cloacae tek bir izole koloni ile sıvı orta beş mililitre aşılamak. Bakterileri bir gecede büyütün.Ertesi gün, iki ayrı 1,5 mililitre santrifüj tüpler içine kültürün 1.3 mililitre aliquots aktarın. Tüpleri 10, 000 x g'de beş dakika santrifüj edin. Süpernatantları çıkarın, ardından her yıkama için bir mililitre steril 1X PBS kullanarak numuneleri iki kez yıkayın.Örnekleri tekrar 10, 000 x g'da beş dakika santrifüj edin. Supernatant çıkarın ve steril 1X PBS 1.3 mililitre pelet resuspend. Yıkanmış kültür 0,5 mililitre ile başlayarak, 1X PBS'deki bakterileri 10'dan eksi 10'a eksi 10'dan eksi dörde kadar seri olarak seyreltin.Bir spektrofotometre kullanarak, yıkanmamış kültürün optik yoğunluğunu ve her dört seyreltmenin her birini 600 nanometrede ölçün. Önceki seyreltmelerin her biri için 1X PBS'de 10 kat seri seyreltme gerçekleştirin. Her örnek için mililitre başına koloni oluşturan birimlerin sayısını belirlemek için her seri için son üç seyreltme 100 mikrolitrea agar plakaları üzerine yayın.Tabakların oda sıcaklığında beş dakika kurumasını bekleyin. Plakaları ters çevirin ve kuvöze yerleştirin. El yazmasında açıklandığı gibi reaktifler, antikorlar ve bakteriler hazırlandıktan sonra tüm malzemeleri BSL-2 biyogüvenlik kabininde bir araya getirin.İnsan norovirüs için virüs benzeri parçacıklar BSL-2 patojenleri olarak listelenir ve VLP kullanılarak yapılan tüm çalışmalar sertifikalı bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır. Her bakteri tüpüne 10 mikrogram insan norovirüs VLP'si ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. Tüpleri 37 santigrat derecede sabit rotasyonla bir saat kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra tüpleri 10,000 x g'de beş dakika santrifüj edin. Aspire ve supernatant atın ve PBS bir mililitre bakteriyel pelet resuspend. Yıkama adımlarını bir kez tekrarladıktan sonra tüpleri 10,000 X g'de beş dakika santrifüj edin.Supernatant atın ve% 5 engelleme tampon 150 mikrolitre VLP-bakteri pelet resuspend. Oluşan yaygın bir hata tüplertakas ve yanlış tedavi eklenir olmasıdır. Bunu önlemek için, doğru tedaviye karşılık gelen satırlarda tüm tüpleri düzenlemek ve tüplere aynı anda bir tedavi ekleyin.Her bakteri örneği için, seyreltilmiş insan norovirüs GII antikor 50 mikrolitre hazırlamak. %5 engelleme tamponu kullanarak, E.cloacae örnekleri için antikor 1 ila 125 seyreltin. Aynı seyreltme oranlarını kullanarak her bakteri örneği için seyreltilmiş isotip antikor 50 mikrolitre hazırlayın.Her ek test numunesini temiz 1,5 mililitrelik santrifüj tüplere aktararak 350 mikrolitrelik aliquots'a bölün. Lekesiz kontroller oluşturmak için, her bakteri örneğinden ilk aliquot için engelleme tampon 50 mikrolitre ekleyin. Lekeli numuneler için, ikinci aliquot setine 50 mikrolitre GII antikor seyreltme ekleyin.Üçüncü aliquot setine seyreltilmiş isotip antikorunun 50 mikrolitresini ekleyerek iyotip kontrollerini oluşturun. Tüm örnekleri buzda ve karanlıkta 30 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra beş dakika boyunca 10, 000 X g tüm örnekleri santrifüj.Süpernatantları atın ve her numuneyi 150 mikrolitre FCSB'de yeniden askıya alın. Yine, beş dakika boyunca 10, 000 X g tüm örnekleri santrifüj. Yine, supernatants atın ve FCSB 100 mikrolitre örnekleri resuspend.Numuneleri son bir kez santrifüj ettikten ve süpernatantları attıktan sonra, fcsb'nin 150 mikrolitresinde numuneleri yeniden askıya alın. Her numuneyi toplam 550 mikrolitre hacim için 400 mikrolitre FCSB içeren bir tüpe aktarın. Numuneleri akış sitometrisi tarafından analiz edilene kadar 4 derece santigrat derecede saklayın.VLP eki akış sitometrisi kullanılarak ölçüldü. İlk olarak, yoğunluk arazileri hücresel enkaz dışarı kapı için kullanılan, bakteriyel doublets ve hücresel kümeleri kaldırmak için sonraki nokta arsa gating izledi. Temsili histogramlar, sadece bakteri örneklerinde PE sinyali eksikliği ni ve VLP:bakteri örneklerinde lekesiz ve isotip kontrollere göre PE sinyal yoğunluğunda bir kayma olduğunu göstermektedir.10 mikrogram VLP ile bir saatlik kuluçkadan sonra akış sitometrisi hem E.colacae hem de L.gasseri'ye bağlanan parçacık tespit etti. Bu teşp için bağlayıcı nicelik sınırını belirlemek için, bakterilere ilave edilmeden önce VLP'lerin seyreltme serisi oluşturulmuştur. VLP miktarındaki azalmalar, VLP ile sınırlanan bakterilerin yüzdesine karşılık gelen azalmalarla sonuçlandı.Virüsün bakteri oranını bilmek ve deneyler arasındaki oranı tutarlı tutmak sonuçların yorumlanmasında önemlidir. Bakteriyel ve viral mutantlar özellikle bu etkileşim aracılık mikrobiyal yüzey yapılarını belirlemek için oluşturulabilir. Bu teknik, araştırmacıların virüs genotipindeki değişikliklerin, bakteriyel büyüme koşullarının ve bakteri yüzey yapılarındaki değişikliklerin viral bağlanmayı nasıl değiştirdiği de dahil olmak üzere norovirüs-bakteriyel etkileşimleri etkileyen durum ve koşullarla ilgili soruları yanıtlamalarına olanak tanır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Akım Sitometri tarafından İnsan Nötrofiller Nükleer Faktör Aktivasyon Algılama Basit ve Verimli Yöntemi

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Tetracistronic minigenomlar İçeren virüs benzeri partiküller ile Biyogüvenlik Seviyesi 2 Koşullarında Ebola virüsü Ömrü Modelleme

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

İnfiltratif Lenfositlerinin Analiz Olmayan enzimatik ayırmak Taze İnsan Dokusuna Basit ve Hızlı Protokolü

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry

İmünohistokimya ve Akım Sitometri Kullanımı Endobronşiyal Biyopsilerinde Mekansal Dağılımı ve Fenotipik Kimlik: İnsan Akciğer dendritik hücrelerin

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Görüntüleme Akım Sitometri Kullanımı T Hücresi alloreaktivitesini Ölçümü

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Akış Sitometresi Imaging kullanılarak insan sisteminde bağışıklık Synapse nitel ve nicel analiz

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

İnsan monosit alt kümeleri tam kan tarafından karakterizasyonu Akış Sitometresi Analizi

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...