Name: rapid, seamless generation of recombinant poxviruses using host range and visual selection
Uploaded: 2020-05-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection at JoVE.com

تم تمويل هذا المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة (AI114851) إلى ريال سعودي.

1. توليد متجه إعادة التركيب
<ol><li>تصميم التمهيديات لتوليد كاسيت التحديد. تصميم كل amplicon الفردية مع تسلسل متداخلة مع amplicons المجاورة وناقلات لتسهيل الجمعية الأنزيمية isothermal من جزيئات الحمض النووي، وتسمى أيضا جمعية جيبسون، وذلك باستخدام أي من عدة أدوات التصميم التمهيدي على الانترنت. ملاحظة: ?...

<ol>
	<li>Brochier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+eradication+of+rabies+using+recombinant+vaccinia-rabies+vaccine.">Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine.</a> Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).</li><li>Pastoret, P. P., Brochier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+use+of+a+vaccinia-rabies+recombinant+oral+vaccine+for+the+control+of+wildlife+rabies;+a+link+between+Jenner+and+Pasteur.">The development and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur.</a> Epidemiology and Infection. 116 (3), 235-240 (1996).</li><li>Chan, W. M., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+Poxviruses.">Oncolytic Poxviruses.</a> Annual review of virology. 1 (1), 119-141 (2014).</li><li>Nguyen, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus-mediated+expression+of+human+erythropoietin+in+tumors+enhances+virotherapy+and+alleviates+cancer-related+anemia+in+mice.">Vaccinia virus-mediated expression of human erythropoietin in tumors enhances virotherapy and alleviates cancer-related anemia in mice.</a> Molecular Therapy. 21 (11), 2054-2062 (2013).</li><li>Frentzen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-VEGF+single-chain+antibody+GLAF-1+encoded+by+oncolytic+vaccinia+virus+significantly+enhances+antitumor+therapy.">Anti-VEGF single-chain antibody GLAF-1 encoded by oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12915-12920 (2009).</li><li>Pastoret, P. P., Vanderplasschen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxviruses+as+vaccine+vectors.">Poxviruses as vaccine vectors.</a> Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 26 (5-6), 343-355 (2003).</li><li>COLLIER, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+a+stable+smallpox+vaccine.">The development of a stable smallpox vaccine.</a> The Journal of Hygiene. 53 (1), 76-101 (1955).</li><li>Weir, J. P., Bajsz&#225;r, G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+the+vaccinia+virus+thymidine+kinase+gene+by+marker+rescue+and+by+cell-free+translation+of+selected+mRNA.">Mapping of the vaccinia virus thymidine kinase gene by marker rescue and by cell-free translation of selected mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (4), 1210-1214 (1982).</li><li>Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus:+a+selectable+eukaryotic+cloning+and+expression+vector.">Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (23), 7415-7419 (1982).</li><li>Nakano, E., Panicali, D., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+vaccinia+virus:+demonstration+of+marker+rescue.">Molecular genetics of vaccinia virus: demonstration of marker rescue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (5), 1593-1596 (1982).</li><li>Falkner, F. G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dominant+selection+of+recombinant+vaccinia+viruses.">Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses.</a> Journal of Virology. 64 (6), 3108-3111 (1990).</li><li>Staib, C., Drexler, I., Ohlmann, M., Wintersperger, S., Erfle, V., Sutter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Host+Range+Selection+for+Genetic+Engineering+of+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara.">Transient Host Range Selection for Genetic Engineering of Modified Vaccinia Virus Ankara.</a> BioTechniques. 28 (6), 1137-1148 (2000).</li><li>Staib, C., Drexler, I., Sutter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+Isolation+of+Recombinant+MVA.">Construction and Isolation of Recombinant MVA.</a> Vaccinia Virus and Poxvirology. , 77-99 (2004).</li><li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marker+gene+swapping+facilitates+recombinant+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara+production+by+host-range+selection.">Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection.</a> Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).</li><li>Pfaller, C. K., Li, Z., George, C. X., Samuel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+PKR+and+RNA+adenosine+deaminase+ADAR1:+New+roles+for+old+players+as+modulators+of+the+interferon+response.">Protein kinase PKR and RNA adenosine deaminase ADAR1: New roles for old players as modulators of the interferon response.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (5), 573-582 (2011).</li><li>Bevilacqua, P. C., George, C. X., Samuel, C. E., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+the+protein+kinase+PKR+to+RNAs+with+secondary+structure+defects:+Role+of+the+tandem+A+-+G+mismatch+and+noncontigous+helixes.">Binding of the protein kinase PKR to RNAs with secondary structure defects: Role of the tandem A - G mismatch and noncontigous helixes.</a> Biochemistry. 37 (18), 6303-6316 (1998).</li><li>Krishnamoorthy, T., Pavitt, G. D., Zhang, F., Dever, T. E., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+Binding+of+the+Phosphorylated+Subunit+of+Initiation+Factor+2+(eIF2)+to+the+Regulatory+Subunits+of+Guanine+Nucleotide+Exchange+Factor+eIF2B+Is+Required+for+Inhibition+of+Translation+Initiation.">Tight Binding of the Phosphorylated Subunit of Initiation Factor 2 (eIF2) to the Regulatory Subunits of Guanine Nucleotide Exchange Factor eIF2B Is Required for Inhibition of Translation Initiation.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (15), 5018-5030 (2001).</li><li>Rothenburg, S., Georgiadis, M. M., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+eIF2&#945;+kinases:+Adapting+translational+control+to+diverse+stresses.">Evolution of eIF2&#945; kinases: Adapting translational control to diverse stresses.</a> Evolution of the Protein Synthesis Machinery and Its Regulation. , 235-260 (2016).</li><li>Bratke, K. A., McLysaght, A., Rothenburg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+host+range+genes+in+poxvirus+genomes.">A survey of host range genes in poxvirus genomes.</a> Infection, Genetics and Evolution. 14, 406-425 (2013).</li><li>Chang, H. W., Watson, J. C., Jacobs, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E3L+gene+of+vaccinia+virus+encodes+an+inhibitor+of+the+interferon-induced,+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase.">The E3L gene of vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (11), 4825-4829 (1992).</li><li>Romano, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+PKR+by+vaccinia+virus+E3:+role+of+complex+formation+and+the+E3+N-terminal+domain.">Inhibition of double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR by vaccinia virus E3: role of complex formation and the E3 N-terminal domain.</a> Molecular and Cellular Biology. 18 (12), 7304-7316 (1998).</li><li>Beattie, E., Tartaglia, J., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus-encoded+eIF-2+alpha+homolog+abrogates+the+antiviral+effect+of+interferon.">Vaccinia virus-encoded eIF-2 alpha homolog abrogates the antiviral effect of interferon.</a> Virology. 183 (1), 419-422 (1991).</li><li>Park, C., Peng, C., Brennan, G., Rothenburg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+inhibition+of+antiviral+protein+kinase+R+by+capripoxviruses+and+vaccinia+virus.">Species-specific inhibition of antiviral protein kinase R by capripoxviruses and vaccinia virus.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1438 (1), 18-29 (2019).</li><li>Rothenburg, S., Brennan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-Specific+Host-Virus+Interactions:+Implications+for+Viral+Host+Range+and+Virulence.">Species-Specific Host-Virus Interactions: Implications for Viral Host Range and Virulence.</a> Trends in Microbiology. , (2019).</li><li>Chakrabarti, S., Sisler, J. R., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compact,+synthetic,+vaccinia+virus+early/late+promoter+for+protein+expression.">Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression.</a> BioTechniques. 23 (6), 1094-1097 (1997).</li><li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli:+Transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution+(recombinant+DNA).">One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution (recombinant DNA).</a> Biochemistry. 86, 2172-2175 (1989).</li><li>Chung, C. T., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+storage+of+competent+Escherichia+coli+cells.">Preparation and storage of competent Escherichia coli cells.</a> Methods in Enzymology. 218, 621-627 (1993).</li><li>Rahman, M. M., Liu, J., Chan, W. M., Rothenburg, S., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myxoma+Virus+Protein+M029+Is+a+Dual+Function+Immunomodulator+that+Inhibits+PKR+and+Also+Conscripts+RHA/DHX9+to+Promote+Expanded+Host+Tropism+and+Viral+Replication.">Myxoma Virus Protein M029 Is a Dual Function Immunomodulator that Inhibits PKR and Also Conscripts RHA/DHX9 to Promote Expanded Host Tropism and Viral Replication.</a> PLOS Pathogens. 9 (7), 1003465 (2013).</li><li>Evans, D. H., Stuart, D., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+genetic+recombination+among+cotransfected+plasmid+DNAs+in+poxvirus-infected+mammalian+cells.">High levels of genetic recombination among cotransfected plasmid DNAs in poxvirus-infected mammalian cells.</a> Journal of Virology. 62 (2), 367-375 (1988).</li><li>Ball, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+homologous+recombination+in+vaccinia+virus+DNA.">High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA.</a> Journal of Virology. 61 (6), 1788-1795 (1987).</li><li>Spyropoulos, D. D., Roberts, B. E., Panicali, D. L., Cohen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineation+of+the+viral+products+of+recombination+in+vaccinia+virus-infected+cells.">Delineation of the viral products of recombination in vaccinia virus-infected cells.</a> Journal of Virology. 62 (3), 1046-1054 (1988).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dominant+host-range+selection+using+Chinese+hamster+ovary+cells+to+generate+marker-free+recombinant+viral+vectors+from+vaccinia+virus.">Transient dominant host-range selection using Chinese hamster ovary cells to generate marker-free recombinant viral vectors from vaccinia virus.</a> BioTechniques. 62 (4), 183-187 (2017).</li></ol>

هنا نقدم الاختلاف من استراتيجية اختيار علامة عابرة 32 لتوليد فيروسات vaccinia المؤتلفدون دون الاحتفاظ الحمض النووي الأجنبي في الفيروس المؤتلف النهائي. تستخدم استراتيجيتنا ضغطًا انتقائيًا بوساطة البروتين المضاد للفيروسات النباتية المضيف PKR بدلاً من أشكال أخرى من الضغط الانتقائ?...

كان لفيروس فاشينيا (VACV) دورًا أساسيًا في أول عملية ناجحة للقضاء على أحد مسببات الأمراض البشرية، وهو فيروس الدوالي (VARV)، من الطبيعة. منذ إبادة فيروس الدوالي ، لا تزال فيروسات الجدري بما في ذلك VACV مفيدة للفيروسات العلاجية لكل من الطب البشري والحيواني. على سبيل المثال، كان لقاح فيروس داء الكلب القائم على VACV فعالاً جداً في منع انتقال داء الكلب السيلفاتي في أوروبا1 والولايات المتحدة2. في الآونة الأخيرة، شهدت فيروسات الجدري المؤتلفة التي تعبر عن مجموعة متنوعة من الجزيئات المضادة للورم (على سبيل المثال، الأجسام المضادة ذات السلسلة الواحدة أو الإريثروبويتين البشري) نجاحًا مشجعًا كعوامل oncolytic3,4,5. VACV جذابة بشكل خاص كناقل لأنها قابلة بسهولة للتلاعب الجيني ، وتمتلك مجموعة مضيفة واسعة ، ومستقرة في ظل مجموعة متنوعة من الظروف ، مما يسمح بسهولة النقل وقابلية اللقاح في المجال6،7. وفي حين تم تطوير تقنيات متعددة لتوليد الـ VACV المؤتلف ة للتجارب المختبرية وتوليد اللقاحات، فإن الاستراتيجيات الحالية لتوليد هذه الفيروسات لها قيود ملحوظة.
وبسبب فائدة VACV، تم وضع استراتيجيات متعددة لتوليد فيروسات مؤتلفة. تستخدم الاستراتيجية الأولى إعادة التركيب المتجانسة لإدخال كاسيت بما في ذلك الجين المتحول وجين علامة يمكن اختياره مثل جين مقاومة المضادات الحيوية. ويحيط الكاسيت من قبل اثنين ~ 500 النيوكليوتيدات (NT) أو أكبر الأسلحة توجيه الجين إلى موقع معين في الجينوم الفيروسي، والتي يتم دمجها بعد ذلك بشكل ثابت من قبل أحداث كروس مزدوجة8,9,10. وهذه الاستراتيجية سريعة وفعالة؛ ومع ذلك ، فإنه يؤدي إلى مواد وراثية إضافية في شكل جين علامة التي قد تنتج آثار غير متوقعة. وعلاوة على ذلك، هناك حد أعلى عملي لعدد الجينات التي يمكن إدخالها محدودة بعدد علامات فريدة من نوعها قابلة للاختيار المتاحة. وقد عالجت استراتيجيات الاختيار المهيمنالعابر (TDS) هذه المسألة عن طريق تيسير توليد الفيروسات المؤتلفة "الندبية"11. باستخدام هذه الاستراتيجية، يتم دمج البلازميد الذي يحتوي على جين VACV متحول وجين علامة قابل للاختيار في الجينوم الفيروسي، ولكن دون وجود حمض نووي إضافي VACV. وينتج عن هذا النهج التكامل العابر للبلازميد بأكمله وازدواجية الجين VACV نتيجة للتكامل من خلال حدث كروس واحد. هذا الوسيط مستقر طالما يتم الحفاظ عليه تحت ضغط الاختيار ، مما يسمح بإثراء هذا البناء. عند إزالة التحديد، يتيح تكرار VACV حدث تقاطع ثانٍ يؤدي إلى إزالة البلازميد والتشكيل اللاحق للنوع البري (wt) أو الفيروس المؤتلف بنسبة 50:50 تقريبًا. في حين أن TDS يولد الفيروسات المؤتلفة دون الحاجة إلى إدخال مستقر من الحمض النووي الأجنبي، يجب فحص استنساخ الفيروسات متعددة للطفرة المتوقعة عن طريق تحليل التسلسل، وهي خطوة يحتمل أن تستغرق وقتا طويلا ومكلفة.
هنا، نقدم نهجا لتوليد فيروسات الجدري المؤتلفة الجمع بين أفضل جوانب كل من هذه النهج، على غرار النهج الذي تم وصفه لتكرار vaccinia تعديل غير كفء أنقرة12،13،14. تجمع هذه الاستراتيجية بين اختيار النطاق البصري والمضيف لتوليد الفيروسات المؤتلفة بسرعة عن طريق أحداث كروس مزدوجة ، والقضاء بعد ذلك على جين علامة قابلة للاختيار عن طريق إعادة التركيب المتجانسة. يسمح هذا النهج بتوليد سريع من المتحولات بوساطة إعادة التركيب المتجانسة ، مع الطبيعة "الندبية" لنهج TDS ، في حين لا تتطلب خطوة فحص لاحقة للتمييز بين النوع البري والفيروسات المتحولة. تستخدم طريقتنا أيضًا اختيار نطاق المضيف بدلاً من اختيار المضادات الحيوية ، مما يقضي على خطر التغيرات الفينوتيبيك المستحثة كيميائيًا في خط الخلية. لهذا النهج، اخترنا استخدام البروتين المضاد للفيروسات المضيف كيناز R (PKR) كعامل انتقائي لتوليد VACV المؤتلف. يتم التعبير عن PKR كمومر غير نشط في معظم أنواع الخلايا15. على ربط الحمض النووي الريبي مزدوجة تقطعت بهم السبل (dsRNA) في المجالات N-المحطة الطرفية dsRNA ملزمة، PKR dimerizes وautophosphorylated16. هذا الشكل النشط من الفوسفور PKR القوائم وحدة فرعية ألفا من عامل بدء eukaryotic 2 (eIF2), في نهاية المطاف تثبيط تسليم البادئ ميثيونيل-رنا إلى الريبوسوم, وبالتالي منع الترجمة داخل الخلايا وتمنع على نطاق واسع تكرار العديد من عائلات الفيروسات17,,18.
واستجابة للنشاط المضاد للفيروسات الواسع والقوي لـ PKR، طورت العديد من الفيروسات استراتيجية واحدة على الأقل لمنع تنشيط PKR. معظم الفيروسات الجدري التعبير عن اثنين من الخصوم PKR, مشفرة من قبل الجينات E3L و K3L في VACV, التي العداء PKR من خلال آليتين متميزتين19. E3 يمنع PKR homodimerization عن طريق ربط مزدوجة تقطعت بهم السبل RNA20,21, في حين K3 بمثابة مثبط pseudosubstrate عن طريق ملزمة مباشرة إلى PKR تنشيط وبالتالي تثبيط التفاعل مع الركيزة eIF2α22. والأهم من ذلك، أن هذين الخصمين PKR لا تمنع بالضرورة PKR من جميع الأنواع. على سبيل المثال، المتجانس K3 من فيروس جدري الغنم منعت بقوة PKR من الأغنام، في حين أن الجدري E3 homolog لم تظهر كبيرة PKR تثبيط23،24. في هذه الدراسة، نقدم طريقة لاستخدام الضغط الانتقائي بوساطة PKR جنبا إلى جنب مع اختيار الفلورسينس لتوليد المؤتلف VACV حذف لE3L و K3L (VC-R4)، والتي لا يمكن تكرارها في الخلايا المختصة PKR المستمدة من أنواع متنوعة. هذا الفيروس المؤتلف يوفر خلفية ممتازة للجيل السريع من الفيروسات المؤتلفة التي تعبر عن الجينات تحت سيطرة المروج E3L الأصلي.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2X-Q5 Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492L</td>
			<td>High-fidelity polymerase used in PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11593027</td>
			<td>Bacterial selective agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cell Scrapers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>08-100-242</td>
			<td>Cell scraper to harvest infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto 2 Cell imaging system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMAFD2000</td>
			<td>Fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube, GFP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AMEP4651</td>
			<td>GFP Cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube, RFP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AMEP4652</td>
			<td>RFP Cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenJet</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100489</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) Broth</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10855021</td>
			<td>Bacterial growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch DNA gel extraction kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1020L</td>
			<td>Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch Plasmid Miniprep kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1010L</td>
			<td>Miniprep kit ussed to purify plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q500 Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q500-110</td>
			<td>Sonicator for virus lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RK13 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-37</td>
			<td>Rabbit kidney cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Multiwell Cell Culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>Cell culture plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, seamless generation of recombinant poxviruses using host range and visual selection

كان لفيروس فاشينيا (VACV) دور ًا أساسيًا في القضاء على فيروس الدوالي (VARV)، وهو العامل المسبب للجدري، من الطبيعة. ومنذ استخدامه لأول مرة كلقاح، تم تطوير فيروس نقص المناعة البشرية المضاد للفيروسات السّافية كناقل للقاحات العلاجية وباعتباره فيروساً أوانيلاتيكياً. تستفيد هذه التطبيقات من الجينوم VACV الذي يتم التلاعب به بسهولة ومجموعة المضيف الواسعة كمنصة متميزة لتوليد فيروسات مؤتلفة مع مجموعة متنوعة من التطبيقات العلاجية. وقد وضعت عدة أساليب لتوليد VACV المؤتلف، بما في ذلك أساليب اختيار علامة واختيار المهيمنة العابرة. هنا ، نقدم تحسين ًا لطريقة اختيار مجموعة المضيف إلى جانب التعرف البصري للفيروسات المؤتلفة. لدينا طريقة يستفيد من الضغط الانتقائي التي تولدها المضيف ة مضادة للفيروسات بروتين كيناس R (PKR) إلى جانب جين الانصهار الفلورسنت التعبير عن MCherry الموسومة E3L، واحدة من اثنين من الخصوم PKR VACV. ويحيط الكاسيت، بما في ذلك الجين من الفائدة والانصهار mCherry-E3L من قبل تسلسل المستمدة من الجينوم VACV. بين الجين من الفائدة وmCherry-E3L هي منطقة أصغر التي هي مطابقة لأول ~ 150 النيوكليوتيدات من الذراع 3'، لتعزيز إعادة التركيب المتجانسة وفقدان الجين mCherry-E3L بعد الاختيار. نحن نثبت أن هذه الطريقة تسمح بكفاءة، وتوليد سلس من rVACV في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا دون الحاجة إلى اختيار المخدرات أو فحص واسع النطاق للفيروسات المتحولة.

استخدمنا الرسم التخطيطي الإجراء في الشكل 1 لتوليد VACV تفتقر إلى كل من الخصوم PKR E3L و K3L، عن طريق استبدال E3L مع EGFP في فيروس تم حذفه بالفعل لK3L (vP872). ويبين الشكل 2 اللويحات الفلورية الحمراء في خلايا RK13 الكفؤة PKR مما يدل على التعبير الفيروسي لmCherry-E3L، وكذلك EGFP أعرب عنه...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection at JoVE.com

Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

هذا هو وسيلة لتوليد "ندبة" فيروسات vaccinia المؤتلفة باستخدام اختيار مجموعة المضيف وتحديد البصرية للفيروسات المؤتلفة.

توليد سريع وسلس من فيروسات الجدري المؤتلفة باستخدام نطاق المضيف والاختيار البصري

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a ...

يستخدم أسلوبنا اختيار مجموعة المضيف وعلامات الفلورسنت لتوليد كفاءة وسلس من فيروس vaccina المؤتلف في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. هذه التقنية تجمع بين سرعة إعادة التركيب المتجانسة مع الطبيعة عديمة الندبة للاختيار المهيمن العابر. وبالإضافة إلى ذلك، نحن استضافة مجموعة مختارة للقضاء على إمكانية التغييرات الناجمة كيميائيا.ويمكن استخدام هذه الطريقة أيضا لتعديل فيروس التشنج أو فيروس الجدري الأخرى للتعبير عن الجينات الأجنبية، على سبيل المثال، لتوليد اللقاحات. إذا كنت تقوم بتنفيذ هذا البروتوكول مع تحديد الفلوريسنس فقط، يجب عليك التأكد من فحص ما يكفي من الفيروسات للكشف عن عمليات إعادة الكومبينات النادرة نسبيًا بدون ضغط انتقائي من PKR. ويعتمد هذا الأسلوب على كسب وخسارة علامات الفلورسنت لتحديد الفيروسات التي حصلت على أشرطة إعادة التركيب والكشف عن الفيروسات التي تم إعادة تجميعها بدون خدش.لتوليد ناقل إعادة الكومبونيشن، أولا إضافة 17 ميكرولترات من المياه الحرة DNase، 1.2 ميكرولترات من كل التمهيدي، وخمسة microliters من 5x PCR العازلة التفاعل، والحمض النووي قالب، و 0.5 ميكرولترات من البوليميراز الحمض النووي إلى أنبوب PCR واحد لكل أمبيرليكون. إضافة المياه مجاناً DNase إضافية لتحقيق حجم النهائي في كل أنبوب إلى 50 ميكرولترات. ووضع الأنابيب في ثيركلوسير.تذوب الحمض النووي في 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية قبل استخدام 25 طلقة من بروتوكول PCR من ثلاث خطوات كما هو مبين. لتصور منتجات التضخيم على جل agarose 1٪، إضافة 10 ميكرولترات من كل منتج الحمض النووي و 2 microliters من تحميل العازلة لكل بئر. تشغيل الجل لمدة ساعة واحدة في ثمانية فولت في السنتيمتر الواحد.في نهاية المدى، واستخدام طقم استخراج هلام الحمض النووي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة لتنقية هلام كل أمبليكون. Elute amplicons من العمود مع 50 ميكرولترات من المياه الحرة DNase والطرد المركزي الفوري. لتكرار ناقل الاستنساخ، أولا إضافة ميكروغرام واحد من الناقل، 17 ميكرولترات من المياه الحرة DNase، 2 ميكرولتر من العازلة رد فعل، و 1 ميكرولتر من EcoRI إلى أنبوب لمدة ساعة واحدة الحضانة في 37 درجة مئوية.في نهاية الحضانة، إضافة 0.2 picomoles من ناقلات خطية 10 ميكرولترات من المياه الحرة DNase، و 10 ميكرولترات من الحمض النووي الجمع مزيج ماجستير لكل أمبريكون معزولة. احتضان العينات في 50 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. في نهاية الحضانة، وتحويل E.coli المختصة كيميائيا مع اثنين من microliters من المنتج المجمعة وفقا للبروتوكولات القياسية.لوحة 100 ميكرولتر من الخلايا المحولة على لوحات أكاروز LB تكملها 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأمبيسيلين. بعد الحضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، حدد المستعمرات المعزولة جيدا لللقح في مرق لوريا تستكمل مع 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأمبيسيلين بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 225 الثورات في الدقيقة الواحدة. في صباح اليوم التالي، استخدمي عدة مصغرة بلازميد لعزل البلازميدات.وتحقق من تركيز ونقاء الحمض النووي على مقياس الطيف. لتوليد الفيروس المؤتلف، تصيب أحادية التقاء من الخلايا المناسبة مع الفيروس ليتم إعادة دمجها في تعدد العدوى من واحد في لوحة ستة جيدا. واحتضان الخلايا المصابة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة.في نهاية الحضانة، استبدال المابير في كل بئر مع DMEM الطازجة واستخدام كاشف transfection المتاحة تجاريا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. إضافة ثلاثة ميكروغرام من ناقلات إعادة الكومبينيشن من الفائدة لكل بئر. ضع اللوحة في الحاضنة لمدة 48 ساعة إضافية.قبل تجميع الخلايا من كل حالة transfection في أنابيب 1.5 ملليلتر الفردية. ثم تجميد ذوبان الخلايا المجمعة ثلاث مرات قبل sonicating lysates الناتجة لمدة 15 ثانية في 50٪ السعة. المقبل، serially 10-fold تمييع lysate سونيكاتيد، حصادها من 10 إلى الأول إلى 10 إلى التركيز السادس في DMEM الطازجة وإضافة ملليلتر واحد من كل تخفيف إلى آبار التقاء الفردية من بروتين كيناز R خط الخلية المختصة.وضع الخلايا في الحاضنة ثقافة الخلية لمدة ساعة واحدة قبل استبدال supernatants مع المتوسطة الطازجة وإعادة الخلايا إلى الحاضنة ثقافة الخلية. بعد 24 إلى 48 ساعة، تحديد الفيروسات المؤتلفة عن طريق المجهر الفلوري. لويحات من الفيروسات المؤتلفة التعبير عن الفلورس الأحمر بسبب التكامل بين الجين الانصهار mCherry-E3L.البلاك تنقية الفيروسات المؤتلفة ثلاث مرات على أنواع البرية RK13 الخلايا. بعد ثلاث جولات من تنقية البلاك، تصيب خلايا RK13 +E3L+K3L مع التخفيفات التسلسلية للبلاك. لتحديد الفيروسات المنهارة، عن طريق المجهر الفلوريسنس باستخدام نظام التصوير المناسب مجهزة GFP ومكعبات التصفية RFP.ثم البلاك تنقية الأخضر فقط VC-R4، أو لويحات E3L عديم اللون ثلاث مرات على RK13 + E3L + K3L الخلايا. ضمان عدم وجود لويحات الفلوريس الحمراء. تصيب الخلايا مع ما لا يقل عن 100 لوحة تشكيل وحدات لزيادة فرصك في تحديد لوحة عديم اللون.في حالات نادرة، قد تكون هناك حاجة إلى جولات متعددة من العدوى. لويحات الفلورسنت الحمراء في البروتين كيناز R المختصة RK13 الخلايا تدل على التعبير الفيروسي من mCherry-E3L. واللوحات أو اللوحات التي تعبر عن eGFP فقط في خلايا RK13 +E3L+K3L تؤكد انهيار علامة اختيار mCherry-E3L.لا يمكن لفيروس المؤتلف VC-R4، الذي يفتقر إلى كل من مضادات كيناز R البروتينية تكرار في البروتين كيناز R المختصة RK13 الخلايا بينما فيروس واضح VP872، الذي يعبر عن E3L هو النسخ المتماثل المختصة. للتأكد من أن هذا العجز عن تكرار في خلايا RK13 كان فقط بسبب فقدان E3L، تم استبدال GFP المحسنة مع E3L في فيروس VC-R4. ولدت فيروس ذات الصلة باستخدام نفس بروتوكول الاختيار.ومن المثير للاهتمام، في حين جعل هذا الفيروس، تم تحديد لويحات عديم اللون متسقة مع انهيار علامة اختيار mCherry-E3L قبل الاختيار في RK13 + E3L + K3L الخلايا التي هي عموما مطلوبة لتحديد المؤتلفات scarless. على الأرجح بسبب هوية التسلسل الممتدة بين كاسيت إعادة الدمج mCherry-E3L والمورث E3L يتم إدراجها في VC-R4. في المتوسط 12.6٪ من الفيرات ذرية خضع التأتلف مع البلازميد عبر، على غرار الترددات التي سبق الإبلاغ عنها.هنا، يتم عرض وتيرة لويحات عديم اللون نسبة إلى مجموع لويحات RK13 + E3L + K3L الخلايا، مما يدل على أن معدل الانهيار وفقدان علامة اختيار mCherry-E3L وقعت في تردد 1.8٪تقريبا. في المرحلة الأولى باستخدام الخلايا المختصة PKR يضمن أن جميع اللويحات مع فيروس المؤتلف الواردة. في المرحلة الثانية باستخدام الخلايا الناقصة PKR تمكن من الكشف عن الفيروس المؤتلف مع طي mCherry-E3L locus.ويتيح لنا هذا النهج توليد فيروسات بسرعة تحتوي على جينات خارجية، على سبيل المثال، لإنتاج اللقاحات الذي يقدم تعبير مختلف الخصوم الفيروسيين من نوع PKR. لتسهيل تحليل التفاعلات الخاصة بالأنواع مع PKR من مختلف المضيفين.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

توليد المؤتلف فيروسات الأنفلونزا من الحمض النووي البلازميد

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

فحوص للكشف عن العوامل رني المضيفة المعنية في الوقس عدوى فيروس باستخدام ذبابة الفاكهة خلايا

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

مزيج من الشريط اللاصق على أساس أخذ العينات والإسفار في الموقع تهجين للكشف السريع عن السالمونيلا على المنتجات الطازجة

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

جيل من الفيروسة الرملية المؤتلف استحداث اللقاحات وافقت عليها الهيئة في خلايا فيرو

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

تحجيم إنتاجية عالية التحديد من المكتبات الأجسام المضادة الاصطناعية-عرض فاجي

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

الجيل المؤتلف الإنسان مفتش حيدة النسيلة من مخلد خلايا التصنيف B

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

تحليل<em&gt; يرسينيا القولون</em&gt; المستجيب إزفاء في الخلايا المضيفة عن طريق بيتا لاكتاماز المستجيب الإنشطار

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

التقييم المرئية والمجهرية من طفرات إنمائية متسلسلة

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

استخدام مسببات الأمراض بكتيرية للتحقيق لاستجابات المضيف الخلوية ومستوى أورجانيسميك

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

جيل، والتضخيم، ومعايرة المؤتلف من فيروسات الجهاز التنفسي المخلوي

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...