Name: rapid, seamless generation of recombinant poxviruses using host range and visual selection
Uploaded: 2020-05-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection at JoVE.com

Dette projekt blev finansieret af National Institutes of Health (AI114851) til SR.

1. Generering af rekombinationsvektoren
<ol><li>Design primere til at generere udvælgelsen kassette. Design hver enkelt amplicon med overlappende sekvenser med tilstødende amplicons og vektoren for at lette isotermisk enzymatisk samling af DNA-molekyler, også kaldet Gibson forsamling, ved hjælp af en af flere online primer design værktøjer. BEMÆRK: Denne protokol kan også udfyldes ved hjælp af traditionelle begrænsning endonuclease-baserede kloning metoder. I så fald skal primere udformes med de relevante...

<ol>
	<li>Brochier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+eradication+of+rabies+using+recombinant+vaccinia-rabies+vaccine.">Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine.</a> Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).</li><li>Pastoret, P. P., Brochier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+use+of+a+vaccinia-rabies+recombinant+oral+vaccine+for+the+control+of+wildlife+rabies;+a+link+between+Jenner+and+Pasteur.">The development and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur.</a> Epidemiology and Infection. 116 (3), 235-240 (1996).</li><li>Chan, W. M., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+Poxviruses.">Oncolytic Poxviruses.</a> Annual review of virology. 1 (1), 119-141 (2014).</li><li>Nguyen, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus-mediated+expression+of+human+erythropoietin+in+tumors+enhances+virotherapy+and+alleviates+cancer-related+anemia+in+mice.">Vaccinia virus-mediated expression of human erythropoietin in tumors enhances virotherapy and alleviates cancer-related anemia in mice.</a> Molecular Therapy. 21 (11), 2054-2062 (2013).</li><li>Frentzen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-VEGF+single-chain+antibody+GLAF-1+encoded+by+oncolytic+vaccinia+virus+significantly+enhances+antitumor+therapy.">Anti-VEGF single-chain antibody GLAF-1 encoded by oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12915-12920 (2009).</li><li>Pastoret, P. P., Vanderplasschen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxviruses+as+vaccine+vectors.">Poxviruses as vaccine vectors.</a> Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 26 (5-6), 343-355 (2003).</li><li>COLLIER, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+a+stable+smallpox+vaccine.">The development of a stable smallpox vaccine.</a> The Journal of Hygiene. 53 (1), 76-101 (1955).</li><li>Weir, J. P., Bajsz&#225;r, G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+the+vaccinia+virus+thymidine+kinase+gene+by+marker+rescue+and+by+cell-free+translation+of+selected+mRNA.">Mapping of the vaccinia virus thymidine kinase gene by marker rescue and by cell-free translation of selected mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (4), 1210-1214 (1982).</li><li>Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus:+a+selectable+eukaryotic+cloning+and+expression+vector.">Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (23), 7415-7419 (1982).</li><li>Nakano, E., Panicali, D., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+vaccinia+virus:+demonstration+of+marker+rescue.">Molecular genetics of vaccinia virus: demonstration of marker rescue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (5), 1593-1596 (1982).</li><li>Falkner, F. G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dominant+selection+of+recombinant+vaccinia+viruses.">Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses.</a> Journal of Virology. 64 (6), 3108-3111 (1990).</li><li>Staib, C., Drexler, I., Ohlmann, M., Wintersperger, S., Erfle, V., Sutter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Host+Range+Selection+for+Genetic+Engineering+of+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara.">Transient Host Range Selection for Genetic Engineering of Modified Vaccinia Virus Ankara.</a> BioTechniques. 28 (6), 1137-1148 (2000).</li><li>Staib, C., Drexler, I., Sutter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+Isolation+of+Recombinant+MVA.">Construction and Isolation of Recombinant MVA.</a> Vaccinia Virus and Poxvirology. , 77-99 (2004).</li><li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marker+gene+swapping+facilitates+recombinant+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara+production+by+host-range+selection.">Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection.</a> Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).</li><li>Pfaller, C. K., Li, Z., George, C. X., Samuel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+PKR+and+RNA+adenosine+deaminase+ADAR1:+New+roles+for+old+players+as+modulators+of+the+interferon+response.">Protein kinase PKR and RNA adenosine deaminase ADAR1: New roles for old players as modulators of the interferon response.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (5), 573-582 (2011).</li><li>Bevilacqua, P. C., George, C. X., Samuel, C. E., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+the+protein+kinase+PKR+to+RNAs+with+secondary+structure+defects:+Role+of+the+tandem+A+-+G+mismatch+and+noncontigous+helixes.">Binding of the protein kinase PKR to RNAs with secondary structure defects: Role of the tandem A - G mismatch and noncontigous helixes.</a> Biochemistry. 37 (18), 6303-6316 (1998).</li><li>Krishnamoorthy, T., Pavitt, G. D., Zhang, F., Dever, T. E., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+Binding+of+the+Phosphorylated+Subunit+of+Initiation+Factor+2+(eIF2)+to+the+Regulatory+Subunits+of+Guanine+Nucleotide+Exchange+Factor+eIF2B+Is+Required+for+Inhibition+of+Translation+Initiation.">Tight Binding of the Phosphorylated Subunit of Initiation Factor 2 (eIF2) to the Regulatory Subunits of Guanine Nucleotide Exchange Factor eIF2B Is Required for Inhibition of Translation Initiation.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (15), 5018-5030 (2001).</li><li>Rothenburg, S., Georgiadis, M. M., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+eIF2&#945;+kinases:+Adapting+translational+control+to+diverse+stresses.">Evolution of eIF2&#945; kinases: Adapting translational control to diverse stresses.</a> Evolution of the Protein Synthesis Machinery and Its Regulation. , 235-260 (2016).</li><li>Bratke, K. A., McLysaght, A., Rothenburg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+host+range+genes+in+poxvirus+genomes.">A survey of host range genes in poxvirus genomes.</a> Infection, Genetics and Evolution. 14, 406-425 (2013).</li><li>Chang, H. W., Watson, J. C., Jacobs, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E3L+gene+of+vaccinia+virus+encodes+an+inhibitor+of+the+interferon-induced,+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase.">The E3L gene of vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (11), 4825-4829 (1992).</li><li>Romano, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+PKR+by+vaccinia+virus+E3:+role+of+complex+formation+and+the+E3+N-terminal+domain.">Inhibition of double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR by vaccinia virus E3: role of complex formation and the E3 N-terminal domain.</a> Molecular and Cellular Biology. 18 (12), 7304-7316 (1998).</li><li>Beattie, E., Tartaglia, J., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus-encoded+eIF-2+alpha+homolog+abrogates+the+antiviral+effect+of+interferon.">Vaccinia virus-encoded eIF-2 alpha homolog abrogates the antiviral effect of interferon.</a> Virology. 183 (1), 419-422 (1991).</li><li>Park, C., Peng, C., Brennan, G., Rothenburg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+inhibition+of+antiviral+protein+kinase+R+by+capripoxviruses+and+vaccinia+virus.">Species-specific inhibition of antiviral protein kinase R by capripoxviruses and vaccinia virus.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1438 (1), 18-29 (2019).</li><li>Rothenburg, S., Brennan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-Specific+Host-Virus+Interactions:+Implications+for+Viral+Host+Range+and+Virulence.">Species-Specific Host-Virus Interactions: Implications for Viral Host Range and Virulence.</a> Trends in Microbiology. , (2019).</li><li>Chakrabarti, S., Sisler, J. R., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compact,+synthetic,+vaccinia+virus+early/late+promoter+for+protein+expression.">Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression.</a> BioTechniques. 23 (6), 1094-1097 (1997).</li><li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli:+Transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution+(recombinant+DNA).">One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution (recombinant DNA).</a> Biochemistry. 86, 2172-2175 (1989).</li><li>Chung, C. T., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+storage+of+competent+Escherichia+coli+cells.">Preparation and storage of competent Escherichia coli cells.</a> Methods in Enzymology. 218, 621-627 (1993).</li><li>Rahman, M. M., Liu, J., Chan, W. M., Rothenburg, S., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myxoma+Virus+Protein+M029+Is+a+Dual+Function+Immunomodulator+that+Inhibits+PKR+and+Also+Conscripts+RHA/DHX9+to+Promote+Expanded+Host+Tropism+and+Viral+Replication.">Myxoma Virus Protein M029 Is a Dual Function Immunomodulator that Inhibits PKR and Also Conscripts RHA/DHX9 to Promote Expanded Host Tropism and Viral Replication.</a> PLOS Pathogens. 9 (7), 1003465 (2013).</li><li>Evans, D. H., Stuart, D., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+genetic+recombination+among+cotransfected+plasmid+DNAs+in+poxvirus-infected+mammalian+cells.">High levels of genetic recombination among cotransfected plasmid DNAs in poxvirus-infected mammalian cells.</a> Journal of Virology. 62 (2), 367-375 (1988).</li><li>Ball, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+homologous+recombination+in+vaccinia+virus+DNA.">High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA.</a> Journal of Virology. 61 (6), 1788-1795 (1987).</li><li>Spyropoulos, D. D., Roberts, B. E., Panicali, D. L., Cohen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineation+of+the+viral+products+of+recombination+in+vaccinia+virus-infected+cells.">Delineation of the viral products of recombination in vaccinia virus-infected cells.</a> Journal of Virology. 62 (3), 1046-1054 (1988).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dominant+host-range+selection+using+Chinese+hamster+ovary+cells+to+generate+marker-free+recombinant+viral+vectors+from+vaccinia+virus.">Transient dominant host-range selection using Chinese hamster ovary cells to generate marker-free recombinant viral vectors from vaccinia virus.</a> BioTechniques. 62 (4), 183-187 (2017).</li></ol>

Her præsenterer vi en variation af en forbigående markør udvælgelsesstrategi 32 til at generere rekombinant vaccinia virus uden at bevare udenlandsk DNA i den endelige rekombinant virus. Vores strategi bruger selektivt pres medieret af værten antivirale protein PKR snarere end andre former for selektivt pres såsom antibiotika. Brugen af vært antivirale gener eliminerer muligheden for kemisk inducerede fænotypiske ændringer i cellerne, eller øget risiko for mutation på grund af udvælgel...

Vacciniavirus (VACV) var medvirkende til den første vellykkede udryddelse af et humant patogen, variolavirus (VARV), fra naturen. Lige siden udryddelsen af variolavirus har poxvirus, herunder VACV, fortsat nyttige terapeutiske vira til både human- og dyremedicin. F.eks. har en VACV-baseret rabiesvirusvaccine været meget effektiv til at forhindre overførsel af sylvatisk rabies i Europa1 og USA2. For nylig, rekombinant poxvirus udtrykke en række anti-tumor molekyler (f.eks enkeltkædede antistoffer eller menneskelige erythropoietin) har set opmuntrende succes som oncolytic agenter3,4,5. VACV er særligt attraktiv som vektor, fordi det er let modtagelige for genetisk manipulation, har en bred vært rækkevidde, og det er stabilt under en række betingelser, så nem transport og vaccine levedygtighed i marken6,7. Mens flere teknikker er blevet udviklet til at generere rekombinant VACV til laboratorieforsøg og vaccine generation, nuværende strategier til at generere disse vira har bemærkelsesværdige begrænsninger.
På grund af nytten af VACV, flere strategier til at generere rekombinant virus er blevet udviklet. Den første strategi anvender homolog rekombination for at indføre en kassette, herunder transgene og et valgbart markørgen som f.eks. Kassetten er flankeret af to ~ 500 nukleotider (nt) eller større arme dirigere genet til et bestemt sted i det virale genom, som derefter stabilt integreret af dobbelt crossover begivenheder8,9,10. Denne strategi er hurtig og effektiv. det resulterer dog i ekstra genetisk materiale i form af markørgenet, som kan give uventede virkninger. Desuden er der en praktisk øvre grænse for antallet af transgener, der kan indføres begrænset af antallet af unikke valgbare markører til rådighed. Forbigående dominerende udvælgelsesstrategier (TDS) har behandlet dette problem ved at lette genereringen af "arløse" rekombinantvirus11. Ved hjælp af denne strategi integreres en plasmid indeholdende et mutant VACV-gen og et valgbart markørgen i det virale genom, men uden yderligere flankerende VACV DNA. Denne fremgangsmåde resulterer i forbigående integration af hele plasmid og duplikering af VACV-genet som følge af integration ved en enkelt crossover-hændelse. Dette mellemprodukt er stabilt, så længe det holdes under markeringstryk, hvilket gør det muligt at berige denne konstruktion. Når udvælgelsen fjernes, giver VACV-duplikeringen en anden crossover-hændelse, der resulterer i fjernelse af plasmider og efterfølgende dannelse af enten vildtypen (wt) eller rekombinant virus i et omtrentligt 50:50-forhold. Mens TDS genererer rekombinant virus uden at kræve en stabil indførelse af udenlandsk DNA, flere virus kloner skal screenes for den forventede mutation ved sekventering analyse, et potentielt tidskrævende og dyrt skridt.
Her præsenterer vi en tilgang til at generere rekombinant poxviruses kombinere de bedste aspekter af hver af disse tilgange, svarende til en tilgang, der er blevet beskrevet for replikation inkompetente modificeret vaccinia Ankara12,13,14. Denne strategi kombinerer visuel og værtsområde udvælgelse til hurtigt at generere rekombinant virus ved dobbelt crossover begivenheder, og efterfølgende fjerne den valgbare markør genet ved homolog rekombination. Denne tilgang gør det muligt for den hurtige generation af mutanter medieret af homolog rekombination, med den "arløse" karakter af TDS tilgange, uden at kræve en efterfølgende screening skridt til at skelne vilde type og mutant virus. Vores metode bruger også værtsområde udvælgelse i stedet for antibiotika udvælgelse, fjerne risikoen for kemisk induceret fænotypiske ændringer i cellelinjen. Til denne tilgang har vi valgt at bruge værten antiviralprotein kinase R (PKR) som selektiv agent til at generere rekombinant VACV. PKR udtrykkes som et inaktivt monomer i de fleste celletyper15. Ved binding af dobbeltstrenget RNA (dsRNA) på N-terminal dsRNA-bindingsdomæner, dæmper PKR og16er autophosphat16 . Denne aktive form af PKR fosforylater alfaunderenheden af den eukaryote initieringsfaktor 2 (eIF2), hvilket i sidste ende hæmmer leveringen af initiatormethionyl-tRNA til ribosomet, hvilket forhindrer intracellulær oversættelse og hæmmer i det store og hele replikationen af mange virusfamilier17,18.
Som reaktion på den brede og potente antivirale aktivitet af PKR, mange vira har udviklet mindst én strategi for at forhindre PKR aktivering. De fleste poxvira udtrykke to PKR antagonister, kodet af E3L og K3L gener i VACV, som antagonisere PKR gennem to forskellige mekanismer19. E3 forhindrer PKR homodimerisering ved at binde dobbeltstrenget RNA20,21, mens K3 fungerer som pseudosubstrathæmmer ved at binde direkte til aktiveret PKR og dermed hæmme samspillet med dets substrat eIF2α22. Det er vigtigt, at disse to PKR-antagonister ikke nødvendigvis hæmmer PKR fra alle arter. F.eks. hæmmede K3-homologen fra fårepoxvirus stærkt PKR fra får, mens fårpox E3-homologen ikke viste betydelig PKR-hæmning23,24. I denne undersøgelse præsenterer vi en metode til at bruge PKR-medieret selektivt tryk kombineret med fluorescensudvælgelse til at generere et VACV rekombinant, der er slettet for E3L og K3L (VC-R4), som ikke kan replikere i PKR kompetente celler fra forskellige arter. Denne rekombinant virus giver en fremragende baggrund for hurtig generation af rekombinant virus udtrykke gener under kontrol af den indfødte E3L promotor.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2X-Q5 Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492L</td>
			<td>High-fidelity polymerase used in PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11593027</td>
			<td>Bacterial selective agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cell Scrapers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>08-100-242</td>
			<td>Cell scraper to harvest infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto 2 Cell imaging system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMAFD2000</td>
			<td>Fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube, GFP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AMEP4651</td>
			<td>GFP Cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube, RFP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AMEP4652</td>
			<td>RFP Cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenJet</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100489</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) Broth</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10855021</td>
			<td>Bacterial growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch DNA gel extraction kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1020L</td>
			<td>Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch Plasmid Miniprep kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1010L</td>
			<td>Miniprep kit ussed to purify plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q500 Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q500-110</td>
			<td>Sonicator for virus lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RK13 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-37</td>
			<td>Rabbit kidney cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Multiwell Cell Culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>Cell culture plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, seamless generation of recombinant poxviruses using host range and visual selection

Vaccinia virus (VACV) var medvirkende til at udrydde variola virus (VARV), det agens af kopper, fra naturen. Siden den første anvendelse som vaccine er VACV udviklet som vektor for terapeutiske vacciner og som onkolytisk virus. Disse applikationer udnytter VACV's let manipulerede genom og brede værtsområde som en fremragende platform til at generere rekombinant virus med en række terapeutiske anvendelser. Der er udviklet flere metoder til at generere rekombinant VACV, herunder markørudvælgelsesmetoder og forbigående dominerende udvælgelse. Her præsenterer vi en forfinelse af en værtsområde udvælgelsesmetode kombineret med visuel identifikation af rekombinant virus. Vores metode udnytter selektivt tryk genereret af værten antiviralprotein kinase R (PKR) kombineret med en fluorescerende fusion gen udtrykker mCherry-tagged E3L, en af to VACV PKR antagonister. Kassetten, herunder det pågældende gen og mCherry-E3L-fusionnen, er flankeret af sekvenser, der er afledt af VACV-genomet. Mellem det gen af interesse og mCherry-E3L er en mindre region, der er identisk med de første ~ 150 nukleotider af 3 'arm, at fremme homolog rekombination og tab af mCherry-E3L genet efter udvælgelse. Vi viser, at denne metode muliggør effektiv, problemfri generering af rVACV i en række forskellige celletyper uden at kræve udvælgelse af lægemidler eller omfattende screening for mutantvirus.

Vi brugte procedurediagrammet i figur 1 til at generere en VACV, der mangler både PKR-antagonister E3L og K3L, ved at erstatte E3L med EGFP i en virus, der allerede er slettet for K3L (vP872). Figur 2 viser røde fluorescerende plaques i PKR kompetente RK13 celler, der indikerer viralt udtryk for mCherry-E3L, samt EGFP udtrykt i RK13+E3L+K3L celler, der bekræfter tabet af E3L og kollaps af valget af mCherry-E3L-markør. Figur 3 be...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection at JoVE.com

Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

Dette er en metode til at generere "arløse" rekombinant vaccinia virus ved hjælp af værtsområde udvælgelse og visuel identifikation af rekombinant virus.

Hurtig, problemfri generation af rekombinant poxvirus ved hjælp af værtsområde og visuel markering

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a ...

Vores metode bruger værtssortiment og fluorescerende markører til effektiv og problemfri generering af rekombinant vaccinavirus i en række forskellige celletyper. Denne teknik kombinerer hastigheden af homolog rekombination med den arløse karakter af forbigående dominerende udvælgelse. Derudover er vi vært for udvalgsvalg for at eliminere muligheden for kemisk inducerede ændringer.Denne metode kan også bruges til at ændre vaccinia virus eller andre poxvirus til at udtrykke udenlandske gener, for eksempel, at generere vacciner. Hvis du kun udfører denne protokol med fluorescensvalg, skal du sikre dig, at du screener nok virus til at opdage relativt sjældne rekombinanter uden PKR-selektivt tryk. Denne metode er afhængig af gevinst og tab af fluorescerende markører for at kunne vælge virus, der har erhvervet rekombinationskassetter og til at opdage virus, der har scarless rekombineret.For at generere en rekombinationsvektor skal du først tilføje 17 mikroliter DNase frit vand, 1,2 mikroliter af hver primer, fem mikroliter 5x PCR-reaktionsbuffer, skabelon-DNA og 0,5 mikroliter DNA-polymerase til et PCR-rør pr. amplicon. Tilføj ekstra DNase frit vand for at bringe det endelige volumen i hvert rør til 50 mikroliter. Og læg rørene i en termocyr.Smelt DNA'et ved 98 grader Celsius i 30 sekunder, før du bruger 25 runder af en tre-trins PCR-protokol som angivet. For at visualisere forstærkningsprodukterne på en 1% agarosegel, tilsættes 10 mikroliter af hvert DNA-produkt og 2 mikroliter læssebuffer til hver brønd. Kør gelen i en time ved otte volt per centimeter.Ved afslutningen af løbet skal du bruge et DNA-gelekstraktionssæt i henhold til producentens protokol til at rense hver forstærker. Eluter ampliconerne fra kolonnen med 50 mikroliter DNase frit vand og øjeblikkelig centrifugering. For at linearisere en kloningsvektor skal du først tilføje et mikrogram af vektoren, 17 mikroliter DNase frit vand, 2 mikroliter reaktionsbuffer og 1 mikroliter EcoRI til et rør i en time inkubation ved 37 grader Celsius.Ved slutningen af inkubationen tilsættes 0,2 picomoles af de lineariserede vektor 10 mikroliter af DNase frit vand og 10 mikroliter AF DNA-samlingsmasterblanding til hver isoleret amplicon. Inkuber prøver ved 50 grader Celsius i en time. Ved inkubationens afslutning omdannes kemisk kompetent E.coli med to mikroliter af det samlede produkt i henhold til standardprotokollerne.Plade 100 mikroliter af transformerede celler på LB agarose plader suppleret med 100 mikrogram pr. milliliter ampicillin. Efter natten inkubation ved 37 grader Celsius, vælge velisolerede kolonier til inokulering i Luria bouillon suppleret med 100 mikrogram pr. milliliter ampicillin natten over ved 37 grader Celsius og 225 omdrejninger i minuttet. Den næste morgen, bruge en plasmid miniprep kit til at isolere plasmider.Og kontrollere koncentrationen og renheden af DNA på et spektrofotometer. For rekombinant virusgenerering skal et sammenløbsmonstræber af egnede celler med virus, der skal kombineres ved en mangfoldighed af infektion på en i en seks-brønd plade. Og inkubere de inficerede celler ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i en time.Ved inkubationens afslutning erstattes supernatanten i hver brønd med frisk DMEM og ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt transinfektions reagens i henhold til fabrikantens protokol. Tilføj en tre mikrogram af rekombination vektor af interesse til hver brønd. Anbring pladen i inkubatoren i yderligere 48 timer.Før du samler cellerne fra hver transfektionstilstand i individuelle 1,5 milliliterrør. Derefter fryse-tø de samlede celler tre gange før sonikering den resulterende lysates i 15 sekunder ved en 50% amplitude. Dernæst serielt 10-fold fortyndet sonikeret lysat, høstet fra en 10 til 10 til den sjette koncentration i frisk DMEM og tilsæt en milliliter af hver fortynding til individuelle sammenløb brønde af et protein kinase R kompetent cellelinje.Placer cellerne i cellekulturskuvøsen i en time, før supernatanterne udskiftes med frisk medium og returnerer cellerne til cellekulturkubvøsen. Efter 24 til 48 timer identificeres de rekombinant virus ved fluorescensmikroskopi. Plaques fra rekombinant virus udtrykker rød fluorescens på grund af integration af mCherry-E3L fusionsgenet.Plaque rense rekombinant virus tre gange på vilde type RK13 celler. Efter tre runder af plak rensning, inficere RK13 + E3L + K3L celler med serielle fortyndinger af plak lysatet. For at identificere de kollapsede vira ved fluorescensmikroskopi ved hjælp af et passende billedsystem udstyret med GFP- og RFP-filterkuber.Derefter plak rense grøn-only VC-R4, eller farveløs E3L plaques tre gange på RK13 + E3L + K3L celler. Sikring af, at ingen plaques fluoresce rød. Inficere cellerne med mindst 100 plaque danner enheder for at øge dine chancer for at identificere en farveløs plaque.I sjældne tilfælde, flere runder af infektion kan være påkrævet. Røde fluorescerende plaques i protein kinase R kompetente RK13 celler er tegn på viral ekspression af mCherry-E3L. Og farveløse plaques eller plaques, der kun udtrykker eGFP i RK13+E3L+K3L-celler, bekræfter sammenbruddet af mCherry-E3L-markeringsmarkøren.Den rekombinant virus VC-R4, som mangler både protein kinase R antagonister kan ikke replikere i protein kinase R kompetente RK13 celler, mens den tilsyneladende virus VP872, som udtrykker E3L er replikation kompetent. For at bekræfte, at denne manglende evne til at replikere i RK13-celler kun skyldtes tabet af E3L, blev udvidet GFP erstattet med E3L i VC-R4-virusset. Det genererede en relevant virus ved hjælp af den samme udvælgelsesprotokol.Interessant, samtidig med at denne virus, farveløse plaques i overensstemmelse med sammenbrud af mCherry-E3L udvælgelse markør blev identificeret forud for udvælgelsen i RK13 + E3L + K3L celler, der generelt er forpligtet til at vælge scarless rekombinanter. Sandsynligvis på grund af den udvidede sekvens identitet mellem mCherry-E3L rekombination kassette og E3L genet indsættes i VC-R4. I gennemsnit gennemgik 12,6 % af afkomt virion rekombination med den transficerede plasmid, svarende til tidligere rapporterede frekvenser.Her vises hyppigheden af farveløse plaques i forhold til de samlede plaques RK13+E3L+K3L celler, hvilket viser, at kollapshastigheden og tabet af mCherry-E3L-markeringsmarkøren forekom med en ca. 1,8%-frekvens. I den første fase ved hjælp af PKR kompetente celler sikrer, at alle de plaques med indeholdt rekombinant virus. I anden fase ved hjælp af PKR mangelfuld celler gør det muligt at detektion af rekombinant virus med et sammenbrud mCherry-E3L locus.Denne fremgangsmåde giver os mulighed for hurtigt at generere vira, der indeholder udefrakommende gener, for eksempel til vaccineproduktion, der giver udtryk for forskellige virale PKR-antagonister. at lette analysen af artsspecifikke interaktioner med PKR fra forskellige værter.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Fremstilling af rekombinant arenavirus for Vaccine Development i FDA-godkendte Vero celler

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

Skalerbar High Throughput Selection Fra fagpræsenterede Syntetiske antistofbiblioteker

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Fremstilling af rekombinant humant IgG monoklonale antistoffer fra Immortaliserede Sorteret B-celler

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analyse af<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector Translokation i værtsceller Brug Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visuelle og mikroskopiske evaluering af Streptomyces udviklingsmæssige mutanter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Ved hjælp af en bakteriel patogen til sonden for cellulære og organismens-niveau vært svar

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Generation, forstærkning og titrering af rekombinant respiratorisk Syncytial virus

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...