Name: rapid, seamless generation of recombinant poxviruses using host range and visual selection
Uploaded: 2020-05-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection at JoVE.com

Dit project werd gefinancierd door de National Institutes of Health (AI114851) aan SR.

1. Het genereren van de recombinatievector
<ol><li>Ontwerp primers om de selectiecassette te genereren. Ontwerp elk individueel amplicon met overlappende sequenties met naburige versterkers en de vector om isothermale enzymatische assemblage van DNA-moleculen te vergemakkelijken, ook wel Gibson-assemblage genoemd, met behulp van een van de verschillende online primerontwerptools. OPMERKING: Dit protocol kan ook worden voltooid met behulp van traditionele beperking endonuclease-gebaseerde klonen methoden. Ontwerp in ...

<ol>
	<li>Brochier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+eradication+of+rabies+using+recombinant+vaccinia-rabies+vaccine.">Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine.</a> Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).</li><li>Pastoret, P. P., Brochier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+use+of+a+vaccinia-rabies+recombinant+oral+vaccine+for+the+control+of+wildlife+rabies;+a+link+between+Jenner+and+Pasteur.">The development and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur.</a> Epidemiology and Infection. 116 (3), 235-240 (1996).</li><li>Chan, W. M., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+Poxviruses.">Oncolytic Poxviruses.</a> Annual review of virology. 1 (1), 119-141 (2014).</li><li>Nguyen, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus-mediated+expression+of+human+erythropoietin+in+tumors+enhances+virotherapy+and+alleviates+cancer-related+anemia+in+mice.">Vaccinia virus-mediated expression of human erythropoietin in tumors enhances virotherapy and alleviates cancer-related anemia in mice.</a> Molecular Therapy. 21 (11), 2054-2062 (2013).</li><li>Frentzen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-VEGF+single-chain+antibody+GLAF-1+encoded+by+oncolytic+vaccinia+virus+significantly+enhances+antitumor+therapy.">Anti-VEGF single-chain antibody GLAF-1 encoded by oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12915-12920 (2009).</li><li>Pastoret, P. P., Vanderplasschen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxviruses+as+vaccine+vectors.">Poxviruses as vaccine vectors.</a> Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 26 (5-6), 343-355 (2003).</li><li>COLLIER, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+a+stable+smallpox+vaccine.">The development of a stable smallpox vaccine.</a> The Journal of Hygiene. 53 (1), 76-101 (1955).</li><li>Weir, J. P., Bajsz&#225;r, G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+the+vaccinia+virus+thymidine+kinase+gene+by+marker+rescue+and+by+cell-free+translation+of+selected+mRNA.">Mapping of the vaccinia virus thymidine kinase gene by marker rescue and by cell-free translation of selected mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (4), 1210-1214 (1982).</li><li>Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus:+a+selectable+eukaryotic+cloning+and+expression+vector.">Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (23), 7415-7419 (1982).</li><li>Nakano, E., Panicali, D., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+vaccinia+virus:+demonstration+of+marker+rescue.">Molecular genetics of vaccinia virus: demonstration of marker rescue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (5), 1593-1596 (1982).</li><li>Falkner, F. G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dominant+selection+of+recombinant+vaccinia+viruses.">Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses.</a> Journal of Virology. 64 (6), 3108-3111 (1990).</li><li>Staib, C., Drexler, I., Ohlmann, M., Wintersperger, S., Erfle, V., Sutter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Host+Range+Selection+for+Genetic+Engineering+of+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara.">Transient Host Range Selection for Genetic Engineering of Modified Vaccinia Virus Ankara.</a> BioTechniques. 28 (6), 1137-1148 (2000).</li><li>Staib, C., Drexler, I., Sutter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+Isolation+of+Recombinant+MVA.">Construction and Isolation of Recombinant MVA.</a> Vaccinia Virus and Poxvirology. , 77-99 (2004).</li><li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marker+gene+swapping+facilitates+recombinant+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara+production+by+host-range+selection.">Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection.</a> Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).</li><li>Pfaller, C. K., Li, Z., George, C. X., Samuel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+PKR+and+RNA+adenosine+deaminase+ADAR1:+New+roles+for+old+players+as+modulators+of+the+interferon+response.">Protein kinase PKR and RNA adenosine deaminase ADAR1: New roles for old players as modulators of the interferon response.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (5), 573-582 (2011).</li><li>Bevilacqua, P. C., George, C. X., Samuel, C. E., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+the+protein+kinase+PKR+to+RNAs+with+secondary+structure+defects:+Role+of+the+tandem+A+-+G+mismatch+and+noncontigous+helixes.">Binding of the protein kinase PKR to RNAs with secondary structure defects: Role of the tandem A - G mismatch and noncontigous helixes.</a> Biochemistry. 37 (18), 6303-6316 (1998).</li><li>Krishnamoorthy, T., Pavitt, G. D., Zhang, F., Dever, T. E., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+Binding+of+the+Phosphorylated+Subunit+of+Initiation+Factor+2+(eIF2)+to+the+Regulatory+Subunits+of+Guanine+Nucleotide+Exchange+Factor+eIF2B+Is+Required+for+Inhibition+of+Translation+Initiation.">Tight Binding of the Phosphorylated Subunit of Initiation Factor 2 (eIF2) to the Regulatory Subunits of Guanine Nucleotide Exchange Factor eIF2B Is Required for Inhibition of Translation Initiation.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (15), 5018-5030 (2001).</li><li>Rothenburg, S., Georgiadis, M. M., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+eIF2&#945;+kinases:+Adapting+translational+control+to+diverse+stresses.">Evolution of eIF2&#945; kinases: Adapting translational control to diverse stresses.</a> Evolution of the Protein Synthesis Machinery and Its Regulation. , 235-260 (2016).</li><li>Bratke, K. A., McLysaght, A., Rothenburg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+host+range+genes+in+poxvirus+genomes.">A survey of host range genes in poxvirus genomes.</a> Infection, Genetics and Evolution. 14, 406-425 (2013).</li><li>Chang, H. W., Watson, J. C., Jacobs, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E3L+gene+of+vaccinia+virus+encodes+an+inhibitor+of+the+interferon-induced,+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase.">The E3L gene of vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (11), 4825-4829 (1992).</li><li>Romano, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+PKR+by+vaccinia+virus+E3:+role+of+complex+formation+and+the+E3+N-terminal+domain.">Inhibition of double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR by vaccinia virus E3: role of complex formation and the E3 N-terminal domain.</a> Molecular and Cellular Biology. 18 (12), 7304-7316 (1998).</li><li>Beattie, E., Tartaglia, J., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus-encoded+eIF-2+alpha+homolog+abrogates+the+antiviral+effect+of+interferon.">Vaccinia virus-encoded eIF-2 alpha homolog abrogates the antiviral effect of interferon.</a> Virology. 183 (1), 419-422 (1991).</li><li>Park, C., Peng, C., Brennan, G., Rothenburg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+inhibition+of+antiviral+protein+kinase+R+by+capripoxviruses+and+vaccinia+virus.">Species-specific inhibition of antiviral protein kinase R by capripoxviruses and vaccinia virus.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1438 (1), 18-29 (2019).</li><li>Rothenburg, S., Brennan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-Specific+Host-Virus+Interactions:+Implications+for+Viral+Host+Range+and+Virulence.">Species-Specific Host-Virus Interactions: Implications for Viral Host Range and Virulence.</a> Trends in Microbiology. , (2019).</li><li>Chakrabarti, S., Sisler, J. R., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compact,+synthetic,+vaccinia+virus+early/late+promoter+for+protein+expression.">Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression.</a> BioTechniques. 23 (6), 1094-1097 (1997).</li><li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli:+Transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution+(recombinant+DNA).">One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution (recombinant DNA).</a> Biochemistry. 86, 2172-2175 (1989).</li><li>Chung, C. T., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+storage+of+competent+Escherichia+coli+cells.">Preparation and storage of competent Escherichia coli cells.</a> Methods in Enzymology. 218, 621-627 (1993).</li><li>Rahman, M. M., Liu, J., Chan, W. M., Rothenburg, S., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myxoma+Virus+Protein+M029+Is+a+Dual+Function+Immunomodulator+that+Inhibits+PKR+and+Also+Conscripts+RHA/DHX9+to+Promote+Expanded+Host+Tropism+and+Viral+Replication.">Myxoma Virus Protein M029 Is a Dual Function Immunomodulator that Inhibits PKR and Also Conscripts RHA/DHX9 to Promote Expanded Host Tropism and Viral Replication.</a> PLOS Pathogens. 9 (7), 1003465 (2013).</li><li>Evans, D. H., Stuart, D., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+genetic+recombination+among+cotransfected+plasmid+DNAs+in+poxvirus-infected+mammalian+cells.">High levels of genetic recombination among cotransfected plasmid DNAs in poxvirus-infected mammalian cells.</a> Journal of Virology. 62 (2), 367-375 (1988).</li><li>Ball, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+homologous+recombination+in+vaccinia+virus+DNA.">High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA.</a> Journal of Virology. 61 (6), 1788-1795 (1987).</li><li>Spyropoulos, D. D., Roberts, B. E., Panicali, D. L., Cohen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineation+of+the+viral+products+of+recombination+in+vaccinia+virus-infected+cells.">Delineation of the viral products of recombination in vaccinia virus-infected cells.</a> Journal of Virology. 62 (3), 1046-1054 (1988).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dominant+host-range+selection+using+Chinese+hamster+ovary+cells+to+generate+marker-free+recombinant+viral+vectors+from+vaccinia+virus.">Transient dominant host-range selection using Chinese hamster ovary cells to generate marker-free recombinant viral vectors from vaccinia virus.</a> BioTechniques. 62 (4), 183-187 (2017).</li></ol>

Hier presenteren we een variatie van een voorbijgaande marker selectie strategie 32 om recombinant vaccinia virussen te genereren zonder het behoud van vreemd DNA in de uiteindelijke recombinant virus. Onze strategie maakt gebruik van selectieve druk bemiddeld door de gastheer antivirale eiwit PKR in plaats van andere vormen van selectieve druk, zoals antibiotica. Het gebruik van gastheer antivirale genen elimineert de mogelijkheid van chemisch geïnduceerde fenotypische veranderingen in de cellen...

Vaccinia virus (VACV) was instrumenteel voor de eerste succesvolle uitroeiing van een menselijke ziekteverwekker, variola virus (VARV), uit de natuur. Sinds de uitroeiing van het variolavirus zijn poxvirussen, waaronder VACV, nog steeds nuttige therapeutische virussen voor zowel de menselijke als de diergeneeskunde. Zo is een vaccin tegen rabiës door VACV zeer effectief geweest bij het voorkomen van overdracht van sylvatische rabiës in Europa1 en de Verenigde Staten2. Meer recent hebben recombinante poxvirussen die een verscheidenheid aan anti-tumormoleculen uitdrukken (bijvoorbeeld single-chain antilichamen of menselijke erythropoietine) bemoedigend succes gezien als oncolytische middelen3,4,5. VACV is bijzonder aantrekkelijk als vector omdat het gemakkelijk vatbaar is voor genetische manipulatie, beschikt over een breed scala aan gastheer, en het is stabiel onder een verscheidenheid van voorwaarden, waardoor gemakkelijk transport en vaccin levensvatbaarheid in het veld6,7. Terwijl meerdere technieken zijn ontwikkeld om recombinant VACV genereren voor laboratoriumexperimenten en vaccin generatie, huidige strategieën om deze virussen te genereren hebben opmerkelijke beperkingen.
Vanwege het nut van VACV zijn er meerdere strategieën ontwikkeld om recombinante virussen te genereren. De eerste strategie maakt gebruik van homologe recombinatie om een cassette met het transgene en een selecteerbaar markergen zoals een antibioticaresistentiegen te introduceren. De cassette wordt geflankeerd door twee ~ 500 nucleotiden (nt) of grotere armen die het gen naar een specifieke plaats in het virale genoom leiden, die vervolgens stabiel wordt geïntegreerd door dubbele crossover gebeurtenissen8,9,10. Deze strategie is snel en efficiënt; het resulteert echter in extra genetisch materiaal in de vorm van het markergen dat onverwachte effecten kan veroorzaken. Bovendien is er een praktische bovengrens aan het aantal transgenen dat kan worden ingevoerd beperkt door het aantal unieke selecteerbare markers beschikbaar. Voorbijgaande dominante selectie (TDS) strategieën hebben dit probleem aangepakt door het vergemakkelijken van de generatie van "littekenloze" recombinant virussen11. Met behulp van deze strategie worden een plasmide met een gemuteerd VACV-gen en een selecteerbaar markergen geïntegreerd in het virale genoom, maar zonder extra flankerend VACV-DNA. Deze aanpak resulteert in een tijdelijke integratie van het gehele plasmideen en duplicatie van het VACV-gen als gevolg van integratie door één cross-overgebeurtenis. Dit tussenproduct is stabiel zolang het onder selectiedruk wordt gehandhaafd, waardoor verrijking van deze constructie mogelijk is. Wanneer de selectie wordt verwijderd, maakt de VACV-duplicatie een tweede crossover-gebeurtenis mogelijk die resulteert in het verwijderen van het plasmilaatpunt en de daaropvolgende vorming van het wilde type (wt) of recombinantvirus in een verhouding van ongeveer 50:50. Terwijl TDS recombinante virussen genereert zonder de stabiele introductie van vreemd DNA, moeten meerdere virusklonen worden gescreend op de verwachte mutatie door sequencing analyse, een potentieel tijdrovende en kostbare stap.
Hier presenteren we een benadering voor het genereren van recombinante pokkenvirussen die de beste aspecten van elk van deze benaderingen combineren, vergelijkbaar met een benadering die is beschreven voor de replicatie incompetente gemodificeerde vaccinia Ankara12,13,14. Deze strategie combineert visuele en gastheer bereik selectie om snel recombinante virussen te genereren door dubbele crossover gebeurtenissen, en vervolgens elimineren van de selecteerbare marker gen door homologe recombinatie. Deze aanpak maakt de snelle generatie mutanten bemiddeld door homologe recombinatie, met de "littekenloze" aard van TDS benaderingen, terwijl niet vereist een latere screening stap om wilde type en mutant virussen te onderscheiden. Onze methode maakt ook gebruik van gastheer bereik selectie in plaats van antibiotica selectie, waardoor het risico van chemisch geïnduceerde fenotypische veranderingen in de cellijn. Voor deze aanpak hebben we ervoor gekozen om de gastheer antivirale eiwit kinase R (PKR) te gebruiken als het selectieve middel om recombinant VACV te genereren. PKR wordt uitgedrukt als een inactieve monomeer in de meeste celtypen15. Na het binden van dubbelstrengs RNA (dsRNA) bij de N-terminal dsRNA-bindende domeinen, dimerizes PKR en wordt autophosphorylated16. Deze actieve vorm van PKR-fosforylaatse de alfa-subeenheid van de eukaryotische initiatiefactor 2 (eIF2) remt uiteindelijk de levering van initiator methionyl-tRNA aan het rinoom, waardoor intracellulaire vertaling wordt voorkomen en de replicatie van veel virusfamilies17,18in grote lijnen wordt geremd .
In reactie op de brede en krachtige antivirale activiteit van PKR, veel virussen hebben ontwikkeld ten minste een strategie om PKR activering te voorkomen. De meeste poxvirussen drukken twee PKR antagonisten uit, gecodeerd door de E3L en K3L genen in VACV, die PKR door twee verschillende mechanismen antagonize19. E3 voorkomt PKR homodimerisatie door binding van dubbelstrengs RNA20,21, terwijl K3 fungeert als een pseudosubstraatremmer door direct te binden aan geactiveerde PKR en daarmee de interactie met het substraat eIF2α22te remmen . Belangrijk is dat deze twee PKR-antagonisten pkr niet noodzakelijkerwijs van alle soorten remmen. Zo remde de K3 homolog van het schapenpokkenvirus PKR sterk van schapen, terwijl de schapenpokken E3 homolog geen aanzienlijke PKR-remming23,24. In deze studie presenteren we een methode om PKR-gemedieerde selectieve druk te gebruiken in combinatie met fluorescentieselectie om een VACV-recombinant te genereren die is verwijderd voor E3L en K3L (VC-R4), die niet kunnen repliceren in PKR-competente cellen afkomstig van verschillende soorten. Dit recombinant virus biedt een uitstekende achtergrond voor snelle generatie van recombinante virussen uitdrukken genen onder controle van de inheemse E3L promotor.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2X-Q5 Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492L</td>
			<td>High-fidelity polymerase used in PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11593027</td>
			<td>Bacterial selective agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cell Scrapers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>08-100-242</td>
			<td>Cell scraper to harvest infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto 2 Cell imaging system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMAFD2000</td>
			<td>Fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube, GFP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AMEP4651</td>
			<td>GFP Cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube, RFP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AMEP4652</td>
			<td>RFP Cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenJet</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100489</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) Broth</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10855021</td>
			<td>Bacterial growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch DNA gel extraction kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1020L</td>
			<td>Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch Plasmid Miniprep kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1010L</td>
			<td>Miniprep kit ussed to purify plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q500 Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q500-110</td>
			<td>Sonicator for virus lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RK13 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-37</td>
			<td>Rabbit kidney cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Multiwell Cell Culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>Cell culture plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, seamless generation of recombinant poxviruses using host range and visual selection

Vaccinia virus (VACV) was instrumenteel in de uitroeiing van variola virus (VARV), de veroorzaker van pokken, uit de natuur. Sinds het eerste gebruik als vaccin is VACV ontwikkeld als vector voor therapeutische vaccins en als oncolytisch virus. Deze toepassingen maken gebruik van VACV's gemakkelijk gemanipuleerde genoom en brede host bereik als een uitstekend platform om recombinante virussen te genereren met een verscheidenheid aan therapeutische toepassingen. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om recombinant VACV te genereren, waaronder markerselectiemethoden en tijdelijke dominante selectie. Hier presenteren we een verfijning van een selectiemethode voor het hostbereik in combinatie met visuele identificatie van recombinante virussen. Onze methode maakt gebruik van selectieve druk gegenereerd door de gastheer antivirale eiwit kinase R (PKR) in combinatie met een fluorescerend fusie-gen uitdrukken mCherry-tagged E3L, een van de twee VACV PKR antagonisten. De cassette, inclusief het gen van belang en de mCherry-E3L fusie wordt geflankeerd door sequenties afgeleid van het VACV genoom. Tussen het gen van belang en mCherry-E3L is een kleiner gebied dat identiek is aan de eerste ~ 150 nucleotiden van de 3 'arm, ter bevordering van homologe recombinatie en verlies van de mCherry-E3L gen na selectie. We tonen aan dat deze methode een efficiënte, naadloze generatie rVACV mogelijk maakt in verschillende celtypen zonder dat er medicijnselectie of uitgebreide screening op gemuteerde virussen nodig is.

We gebruikten de procedure in figuur 1 om een VACV te genereren zonder zowel PKR-antagonisten E3L als K3L, door E3L te vervangen door EGFP in een virus dat al is verwijderd voor K3L (vP872). Figuur 2 toont rode fluorescerende plaques in PKR bevoegde RK13 cellen indicatief voor virale expressie van mCherry-E3L, evenals EGFP uitgedrukt in RK13 +E3L+K3L cellen die het verlies van E3L en ineenstorting van de mCherry-E3L selectie marker bevestigen. <strong class="xfi...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection at JoVE.com

Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

Dit is een methode om "scarless" recombinant vaccinia virussen te genereren met behulp van host-range selectie en visuele identificatie van recombinante virussen.

Snelle, naadloze generatie recombinante poxvirussen met behulp van Host Range en Visuele Selectie

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a ...

Onze methode maakt gebruik van host range selectie en fluorescerende markers voor de efficiënte en naadloze generatie van recombinant vaccina virus in een verscheidenheid van celtypes. Deze techniek combineert de snelheid van homologe recombinatie met de scarless aard van voorbijgaande dominante selectie. Daarnaast hosten we assortimentselectie om de mogelijkheid van chemisch geïnduceerde veranderingen te elimineren.Deze methode kan ook worden gebruikt om het vacciniavirus of andere pokkenvirussen te wijzigen om vreemde genen uit te drukken, bijvoorbeeld om vaccins te genereren. Als u dit protocol alleen uitvoert met fluorescentieselectie, moet u ervoor zorgen dat u voldoende virussen screent om een relatief zeldzame recombinants te detecteren zonder PKR-selectieve druk. Deze methode is gebaseerd op de winst en het verlies van fluorescerende markers om met succes virussen te selecteren die de recombinatiecassettes hebben verworven en om virussen te detecteren die scarless opnieuw hebben gecombineerd.Om een recombinatievector te genereren, voegt u eerst 17 microliter DNase-vrij water, 1,2 microliter van elke primer, vijf microliters van 5x PCR-reactiebuffer, sjabloon-DNA en 0,5 microliter DNA-polymerase toe aan één PCR-buis per amplicon. Voeg extra DNase gratis water toe om het uiteindelijke volume in elke buis op 50 microliter te brengen. En plaats de buizen in een thermocycler.Smelt het DNA op 98 graden Celsius gedurende 30 seconden voor het gebruik van 25 rondes van een drie-stappen PCR protocol zoals aangegeven. Om de versterkingsproducten op een 1%agarose gel te visualiseren, voeg 10 microliters van elk DNA-product en 2 microliter laadbuffer aan elke put toe. Voer de gel voor een uur op acht volt per centimeter.Gebruik aan het einde van de run een DNA-gelextractiekit volgens het protocol van de fabrikant om elke amplicon te stollen. Elute de amfionen uit de kolom met 50 microliters van DNase vrij water en onmiddellijke centrifugatie. Om een kloonvector te lineariseren, voegt u eerst een microgram van de vector, 17 microliters DNase-vrij water, 2 microliter reactiebuffer en 1 microliter EcoRI toe aan een buis voor een incubatie van een uur bij 37 graden Celsius.Voeg aan het einde van de incubatie 0,2 picomoles van de gelinealiseerde vector 10 microliter DNase vrij water en 10 microliters van DNA-assemblagemastermix toe aan elke geïsoleerde amplicon. Incubeermonsters op 50 graden Celsius gedurende een uur. Transform aan het einde van de incubatie chemisch competente E.coli met twee microliter van het geassembleerde product volgens standaardprotocollen.Plaat 100 microliter van getransformeerde cellen op LB agarose platen aangevuld met 100 microgram per milliliter ampicilline. Na nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius, selecteer goed geïsoleerde kolonies voor inenting in Luria bouillon aangevuld met 100 microgram per milliliter ampicilline 's nachts bij 37 graden Celsius en 225 omwentelingen per minuut. De volgende ochtend, gebruik maken van een plasmid miniprep kit om de plasmiden te isoleren.En controleer de concentratie en zuiverheid van het DNA op een spectrofotometer. Voor recombinant virus generatie, infecteren een confluent monolayer van geschikte cellen met het virus te worden gecombineerd bij een veelheid van infectie van een in een zes-put plaat. En de geïnfecteerde cellen in te broeden op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende een uur.Vervang aan het einde van de incubatie het supernatant in elke put door verse DMEM en gebruik een commercieel verkrijgbaar transfectiereagensagemiddel volgens het protocol van de fabrikant. Voeg een drie microgram van de recombinatie vector van belang aan elke put. Plaats de plaat 48 uur extra in de couveuse.Voor het bundelen van de cellen van elke transfectie voorwaarde in individuele 1,5 milliliter buizen. Vries vervolgens de gepoolde cellen drie keer in voordat de resulterende lysates gedurende 15 seconden bij een 50%amplitude worden gesavreerd. Vervolgens verdunn het gesoniceerde lysaat in serie 10 tot de eerste tot de zesde concentratie in verse DMEM en voeg het één milliliter van elke verdunning toe aan individuele samenvloeiende putten van een eiwitkinase R-competente cellijn.Plaats de cellen in de celcultuur incubator voor een uur voor het vervangen van de supernatants met vers medium en de terugkeer van de cellen naar de cel cultuur incubator. Na 24 tot 48 uur, identificeren van de recombinant virussen door fluorescentie microscopie. Plaques van recombinant virussen drukken rode fluorescentie uit als gevolg van integratie van het fusiegen mCherry-E3L.Plaque zuiveren de recombinant virussen drie keer op wilde type RK13 cellen. Na drie rondes van plaque zuivering, infecteren RK13+E3L +K3L cellen met seriële verdunningen van de plaque lysaat. Om de ingestorte virussen te identificeren, door fluorescentie microscopie met behulp van een geschikte imaging systeem uitgerust met GFP en RFP filter kubussen.Dan plaque zuiveren groen-only VC-R4, of kleurloze E3L plaques drie keer op RK13 + E3L + K3L cellen. Ervoor zorgen dat er geen plaques rood fluoresceren. Infecteer de cellen met ten minste 100 plaquevormende eenheden om uw kansen op het identificeren van een kleurloze plaque te verhogen.In zeldzame gevallen kunnen meerdere infectieronden nodig zijn. Rode fluorescerende plaques in eiwitkinase R competente RK13 cellen zijn indicatief voor virale expressie van mCherry-E3L. En kleurloze plaques of plaques die alleen eGFP uitdrukken in RK13+E3L+K3L-cellen bevestigen de ineenstorting van de mCherry-E3L-selectiemarker.Het recombinant virus VC-R4, dat zowel eiwitkinase R antagonisten mist kan niet repliceren in eiwit kinase R bevoegde RK13 cellen, terwijl het schijnbare virus VP872, die E3L uitdrukt is replicatie bevoegd. Om te bevestigen dat dit onvermogen om te repliceren in RK13-cellen alleen te wijten was aan het verlies van E3L, werd verbeterde GFP vervangen door E3L in het VC-R4-virus. Het genereerde een relevant virus met behulp van hetzelfde selectieprotocol.Interessant, terwijl het maken van dit virus, kleurloze plaques in overeenstemming met de ineenstorting van de mCherry-E3L selectie marker werden geïdentificeerd voorafgaand aan de selectie in RK13 + E3L + K3L cellen die over het algemeen nodig zijn om littekenloze recombinaties te selecteren. Waarschijnlijk vanwege de uitgebreide sequentie-identiteit tussen de mCherry-E3L recombinatiecassette en het E3L-gen dat in VC-R4 wordt ingebracht. Gemiddeld 12,6% van de nakomelingen virionen onderging recombinatie met de transfected plasmid, vergelijkbaar met eerder gemelde frequenties.Hier wordt de frequentie van kleurloze plaques ten opzichte van de totale plaques RK13+E3L+K3L-cellen weergegeven, waaruit blijkt dat de instortingssnelheid en het verlies van de mCherry-E3L-selectiemarker zich met een frequentie van ongeveer 1,8% hebben voorgedaan. In de eerste fase met behulp van PKR bevoegde cellen zorgt ervoor dat alle plaques met opgenomen recombinant virus. In de tweede fase met behulp van PKR gebrekkige cellen maakt de detectie van recombinant virus met een ineenstorting mCherry-E3L locus.Deze aanpak stelt ons in staat om snel virussen te genereren die exogene genen bevatten, bijvoorbeeld voor vaccinproductie die de expressie van verschillende virale PKR-antagonisten bieden. om de analyse van soortenspecifieke interacties met PKR van verschillende gastheren te vergemakkelijken.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Generatie van recombinant griepvirus uit plasmide-DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening voor Host factoren die betrokken zijn in Vaccinia Virus infectie met behulp van Drosophila Cellen

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combinatie van Adhesive-tape-gebaseerde Sampling en fluorescentie In situ Hybridisatie voor snelle detectie van Salmonella Op Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Generatie van recombinant arenavirus for Vaccine Development in FDA-goedgekeurde Vero cellen

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

Schaalbare High Throughput Selectie Van faagweergegeven Synthetische Antibody Bibliotheken

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Generering van recombinant humaan IgG Monoclonal Antibodies uit Onsterfelijk gesorteerde B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analyse van<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector Translocatie in gastheercellen met behulp van beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visuele en microscopische evaluatie van Streptomyces Developmental mutanten

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Met behulp van een bacteriële ziekteverwekker sonde voor Cellulair en Organismic niveau Host Reacties

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Generatie, versterking en titratie van recombinante respiratoir syncytieel virussen

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...