Name: rapid, seamless generation of recombinant poxviruses using host range and visual selection
Uploaded: 2020-05-24T14:30:00
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Dieses Projekt wurde von den National Institutes of Health (AI114851) an SR finanziert.

1. Generieren des Rekombinationsvektors
<ol><li>Design-Primer, um die Auswahlkassette zu generieren. Entwerfen Sie jedes einzelne Amplikon mit überlappenden Sequenzen mit benachbarten Amplikonen und dem Vektor, um die isotherme enzymatische Montage von DNA-Molekülen, auch Gibson-Montage genannt, mit einem von mehreren Online-Primer-Design-Tools zu erleichtern. HINWEIS: Dieses Protokoll kann auch mit herkömmlichen, auf Einschränkungen endonukleasebasierten Klonierungsmethoden abgeschlossen werden. In diesem Fall ...

<ol>
	<li>Brochier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+eradication+of+rabies+using+recombinant+vaccinia-rabies+vaccine.">Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine.</a> Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).</li><li>Pastoret, P. P., Brochier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+use+of+a+vaccinia-rabies+recombinant+oral+vaccine+for+the+control+of+wildlife+rabies;+a+link+between+Jenner+and+Pasteur.">The development and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur.</a> Epidemiology and Infection. 116 (3), 235-240 (1996).</li><li>Chan, W. M., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+Poxviruses.">Oncolytic Poxviruses.</a> Annual review of virology. 1 (1), 119-141 (2014).</li><li>Nguyen, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus-mediated+expression+of+human+erythropoietin+in+tumors+enhances+virotherapy+and+alleviates+cancer-related+anemia+in+mice.">Vaccinia virus-mediated expression of human erythropoietin in tumors enhances virotherapy and alleviates cancer-related anemia in mice.</a> Molecular Therapy. 21 (11), 2054-2062 (2013).</li><li>Frentzen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-VEGF+single-chain+antibody+GLAF-1+encoded+by+oncolytic+vaccinia+virus+significantly+enhances+antitumor+therapy.">Anti-VEGF single-chain antibody GLAF-1 encoded by oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12915-12920 (2009).</li><li>Pastoret, P. P., Vanderplasschen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxviruses+as+vaccine+vectors.">Poxviruses as vaccine vectors.</a> Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 26 (5-6), 343-355 (2003).</li><li>COLLIER, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+a+stable+smallpox+vaccine.">The development of a stable smallpox vaccine.</a> The Journal of Hygiene. 53 (1), 76-101 (1955).</li><li>Weir, J. P., Bajsz&#225;r, G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+the+vaccinia+virus+thymidine+kinase+gene+by+marker+rescue+and+by+cell-free+translation+of+selected+mRNA.">Mapping of the vaccinia virus thymidine kinase gene by marker rescue and by cell-free translation of selected mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (4), 1210-1214 (1982).</li><li>Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus:+a+selectable+eukaryotic+cloning+and+expression+vector.">Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (23), 7415-7419 (1982).</li><li>Nakano, E., Panicali, D., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+vaccinia+virus:+demonstration+of+marker+rescue.">Molecular genetics of vaccinia virus: demonstration of marker rescue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (5), 1593-1596 (1982).</li><li>Falkner, F. G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dominant+selection+of+recombinant+vaccinia+viruses.">Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses.</a> Journal of Virology. 64 (6), 3108-3111 (1990).</li><li>Staib, C., Drexler, I., Ohlmann, M., Wintersperger, S., Erfle, V., Sutter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Host+Range+Selection+for+Genetic+Engineering+of+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara.">Transient Host Range Selection for Genetic Engineering of Modified Vaccinia Virus Ankara.</a> BioTechniques. 28 (6), 1137-1148 (2000).</li><li>Staib, C., Drexler, I., Sutter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+Isolation+of+Recombinant+MVA.">Construction and Isolation of Recombinant MVA.</a> Vaccinia Virus and Poxvirology. , 77-99 (2004).</li><li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marker+gene+swapping+facilitates+recombinant+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara+production+by+host-range+selection.">Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection.</a> Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).</li><li>Pfaller, C. K., Li, Z., George, C. X., Samuel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+PKR+and+RNA+adenosine+deaminase+ADAR1:+New+roles+for+old+players+as+modulators+of+the+interferon+response.">Protein kinase PKR and RNA adenosine deaminase ADAR1: New roles for old players as modulators of the interferon response.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (5), 573-582 (2011).</li><li>Bevilacqua, P. C., George, C. X., Samuel, C. E., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+the+protein+kinase+PKR+to+RNAs+with+secondary+structure+defects:+Role+of+the+tandem+A+-+G+mismatch+and+noncontigous+helixes.">Binding of the protein kinase PKR to RNAs with secondary structure defects: Role of the tandem A - G mismatch and noncontigous helixes.</a> Biochemistry. 37 (18), 6303-6316 (1998).</li><li>Krishnamoorthy, T., Pavitt, G. D., Zhang, F., Dever, T. E., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+Binding+of+the+Phosphorylated+Subunit+of+Initiation+Factor+2+(eIF2)+to+the+Regulatory+Subunits+of+Guanine+Nucleotide+Exchange+Factor+eIF2B+Is+Required+for+Inhibition+of+Translation+Initiation.">Tight Binding of the Phosphorylated Subunit of Initiation Factor 2 (eIF2) to the Regulatory Subunits of Guanine Nucleotide Exchange Factor eIF2B Is Required for Inhibition of Translation Initiation.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (15), 5018-5030 (2001).</li><li>Rothenburg, S., Georgiadis, M. M., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+eIF2&#945;+kinases:+Adapting+translational+control+to+diverse+stresses.">Evolution of eIF2&#945; kinases: Adapting translational control to diverse stresses.</a> Evolution of the Protein Synthesis Machinery and Its Regulation. , 235-260 (2016).</li><li>Bratke, K. A., McLysaght, A., Rothenburg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+host+range+genes+in+poxvirus+genomes.">A survey of host range genes in poxvirus genomes.</a> Infection, Genetics and Evolution. 14, 406-425 (2013).</li><li>Chang, H. W., Watson, J. C., Jacobs, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E3L+gene+of+vaccinia+virus+encodes+an+inhibitor+of+the+interferon-induced,+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase.">The E3L gene of vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (11), 4825-4829 (1992).</li><li>Romano, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+PKR+by+vaccinia+virus+E3:+role+of+complex+formation+and+the+E3+N-terminal+domain.">Inhibition of double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR by vaccinia virus E3: role of complex formation and the E3 N-terminal domain.</a> Molecular and Cellular Biology. 18 (12), 7304-7316 (1998).</li><li>Beattie, E., Tartaglia, J., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus-encoded+eIF-2+alpha+homolog+abrogates+the+antiviral+effect+of+interferon.">Vaccinia virus-encoded eIF-2 alpha homolog abrogates the antiviral effect of interferon.</a> Virology. 183 (1), 419-422 (1991).</li><li>Park, C., Peng, C., Brennan, G., Rothenburg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+inhibition+of+antiviral+protein+kinase+R+by+capripoxviruses+and+vaccinia+virus.">Species-specific inhibition of antiviral protein kinase R by capripoxviruses and vaccinia virus.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1438 (1), 18-29 (2019).</li><li>Rothenburg, S., Brennan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-Specific+Host-Virus+Interactions:+Implications+for+Viral+Host+Range+and+Virulence.">Species-Specific Host-Virus Interactions: Implications for Viral Host Range and Virulence.</a> Trends in Microbiology. , (2019).</li><li>Chakrabarti, S., Sisler, J. R., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compact,+synthetic,+vaccinia+virus+early/late+promoter+for+protein+expression.">Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression.</a> BioTechniques. 23 (6), 1094-1097 (1997).</li><li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli:+Transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution+(recombinant+DNA).">One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution (recombinant DNA).</a> Biochemistry. 86, 2172-2175 (1989).</li><li>Chung, C. T., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+storage+of+competent+Escherichia+coli+cells.">Preparation and storage of competent Escherichia coli cells.</a> Methods in Enzymology. 218, 621-627 (1993).</li><li>Rahman, M. M., Liu, J., Chan, W. M., Rothenburg, S., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myxoma+Virus+Protein+M029+Is+a+Dual+Function+Immunomodulator+that+Inhibits+PKR+and+Also+Conscripts+RHA/DHX9+to+Promote+Expanded+Host+Tropism+and+Viral+Replication.">Myxoma Virus Protein M029 Is a Dual Function Immunomodulator that Inhibits PKR and Also Conscripts RHA/DHX9 to Promote Expanded Host Tropism and Viral Replication.</a> PLOS Pathogens. 9 (7), 1003465 (2013).</li><li>Evans, D. H., Stuart, D., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+genetic+recombination+among+cotransfected+plasmid+DNAs+in+poxvirus-infected+mammalian+cells.">High levels of genetic recombination among cotransfected plasmid DNAs in poxvirus-infected mammalian cells.</a> Journal of Virology. 62 (2), 367-375 (1988).</li><li>Ball, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+homologous+recombination+in+vaccinia+virus+DNA.">High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA.</a> Journal of Virology. 61 (6), 1788-1795 (1987).</li><li>Spyropoulos, D. D., Roberts, B. E., Panicali, D. L., Cohen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineation+of+the+viral+products+of+recombination+in+vaccinia+virus-infected+cells.">Delineation of the viral products of recombination in vaccinia virus-infected cells.</a> Journal of Virology. 62 (3), 1046-1054 (1988).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dominant+host-range+selection+using+Chinese+hamster+ovary+cells+to+generate+marker-free+recombinant+viral+vectors+from+vaccinia+virus.">Transient dominant host-range selection using Chinese hamster ovary cells to generate marker-free recombinant viral vectors from vaccinia virus.</a> BioTechniques. 62 (4), 183-187 (2017).</li></ol>

Hier stellen wir eine Variation einer transienten Markerauswahlstrategie 32 vor, um rekombinante Impfstoffviren zu erzeugen, ohne fremde DNA im endgültigen rekombinanten Virus zu speichern. Unsere Strategie verwendet selektiven Druck, der vom antiviralen Protein PKR des Wirts vermittelt wird, anstatt andere Formen des selektiven Drucks wie Antibiotika. Die Verwendung von antiviralen Wirtsgenen eliminiert die Möglichkeit chemisch induzierter phäkotypischer Veränderungen in den Zellen oder ein e...

Das Vaccinia-Virus (VACV) war entscheidend für die erste erfolgreiche Tilgung eines menschlichen Erregers, des Variolavirus (VARV), aus der Natur. Seit der Ausrottung des Variola-Virus sind Poxviren einschließlich VACV weiterhin nützliche therapeutische Viren für die Human- und Tiermedizin. Beispielsweise hat ein VACV-basierter Tollwutvirus-Impfstoff die Übertragung von sylvatischer Tollwut in Europa1 und den Vereinigten Staaten sehr wirksam verhindert2. In jüngerer Zeit haben rekombinante Poxviren, die eine Vielzahl von Anti-Tumor-Molekülen (z. B. einkettige Antikörper oder menschliches Erythropoietin) exzieren, ermutigende Erfolge als onkolytische Wirkstoffegesehen 3,4,5. VACV ist als Vektor besonders attraktiv, da es leicht für genetische Manipulationen geeignet ist, ein breites Wirtsspektrum besitzt und unter einer Vielzahl von Bedingungen stabil ist, was einen einfachen Transport und eine mögliche Lebensfähigkeit des Impfstoffs im Feld6,7ermöglicht. Während mehrere Techniken entwickelt wurden, um rekombinante VACV für Laborexperimente und Impfstoffgenerierung zu erzeugen, haben aktuelle Strategien zur Generierung dieser Viren bemerkenswerte Einschränkungen.
Aufgrund des Nutzens von VACV wurden mehrere Strategien zur Erzeugung rekombinanter Viren entwickelt. Die erste Strategie verwendet homologe Rekombination, um eine Kassette mit dem Transgen und einem wählbaren Markergen wie einem Antibiotikaresistenzgen einzuführen. Die Kassette wird flankiert von zwei Nukleotiden (nt) oder größeren Armen, die das Gen an einen bestimmten Ort im viralen Genom leiten, der dann stabil durch Doppel-Crossover-Ereignisse8,9,10integriert wird. Diese Strategie ist schnell und effizient; Es führt jedoch zu zusätzlichem genetischem Material in Form des Markergens, das unerwartete Effekte hervorrufen kann. Darüber hinaus gibt es eine praktische Obergrenze für die Anzahl der Transgene, die durch die Anzahl der verfügbaren eindeutigen wählbaren Marker begrenzt eingeführt werden können. Transient dominante Selektionsstrategien (TDS) haben dieses Problem angegangen, indem sie die Erzeugung von "scarless" rekombinanten Viren erleichtert haben11. Mit dieser Strategie werden ein Plasmid, das ein mutiertes VACV-Gen und ein wählbares Markergen enthält, in das virale Genom integriert, jedoch ohne zusätzliche flankierende VACV-DNA. Dieser Ansatz führt zu einer transienten Integration des gesamten Plasmids und zur Duplizierung des VACV-Gens als Folge der Integration durch ein einziges Crossover-Ereignis. Dieses Zwischenprodukt ist stabil, solange es unter Selektionsdruck aufrechterhalten wird, was eine Anreicherung dieses Konstrukts ermöglicht. Wenn die Auswahl entfernt wird, ermöglicht die VACV-Duplikation ein zweites Crossover-Ereignis, das zur Entfernung des Plasmids und der anschließenden Bildung des Wildtyps (Wt) oder des rekombinanten Virus im Verhältnis von ungefähr 50:50 führt. Während TDS rekombinante Viren erzeugt, ohne dass die stämmige Einführung fremder DNA erforderlich ist, müssen mehrere Virusklone durch Sequenzierungsanalyse auf die erwartete Mutation untersucht werden, ein potenziell zeitaufwändiger und kostspieliger Schritt.
Hier stellen wir einen Ansatz zur Erzeugung rekombinanter Poxviren vor, der die besten Aspekte jedes dieser Ansätze kombiniert, ähnlich einem Ansatz, der für die Replikation inkompetent modifizierte Impfung Ankara12,13,14beschrieben wurde. Diese Strategie kombiniert visuelle und Host-Bereichs-Auswahl, um schnell rekombinante Viren durch Doppel-Crossover-Ereignisse zu erzeugen, und anschließend das wählbare Markergen durch homologe Rekombination zu beseitigen. Dieser Ansatz ermöglicht die schnelle Generierung von Mutanten, die durch homologe Rekombination vermittelt werden, mit der "scarless" Natur von TDS-Ansätzen, ohne einen nachfolgenden Screening-Schritt zu erfordern, um Wildtyp- und mutierte Viren zu unterscheiden. Unsere Methode verwendet auch die Auswahl des Wirtsbereichs anstelle der Antibiotikaauswahl, wodurch das Risiko chemisch induzierter phänotypischer Veränderungen in der Zelllinie eliminiert wird. Für diesen Ansatz haben wir uns entschieden, den Wirt antivirale Proteinkinase R (PKR) als selektives Mittel zur Erzeugung rekombinanter VACV zu verwenden. PKR wird in den meisten Zelltypen als inaktives Monomer ausgedrückt15. Bei Bindung von doppelsträngiger RNA (dsRNA) an den N-terminalen dsRNA-bindenden Domänen dimerisiert PKR und wird16autophosphoryliert. Diese aktive Form von PKR phosphoryliert die Alpha-Untereinheit des eukaryotischen Initiationsfaktors 2 (eIF2), was letztlich die Abgabe von Initiator Methionyl-tRNA an das Ribosom hemmt, wodurch die intrazelluläre Translation verhindert und die Replikation vieler Virusfamilien weitgehend hemmt17,18.
Als Reaktion auf die breite und starke antivirale Aktivität von PKR haben viele Viren mindestens eine Strategie entwickelt, um die PKR-Aktivierung zu verhindern. Die meisten Poxviren exprimieren zwei PKR-Antagonisten, die von den E3L- und K3L-Genen in VACV kodiert werden und PKR durch zwei unterschiedliche Mechanismen antagonisieren19. E3 verhindert die PKR-Homodimerisierung durch Bindung doppelsträngiger RNA20,21, während K3 als Pseudosubstratinhibitor wirkt, indem es direkt an aktivierte PKR bindet und dadurch die Wechselwirkung mit seinem Substrat eIF2-22hemmt. Wichtig ist, dass diese beiden PKR-Antagonisten PKR nicht unbedingt von allen Arten hemmen. Zum Beispiel hemmte der K3-Homolog des Schafpockenvirus PKR stark von Schafen, während der Schafpocken-E3-Homolog keine nennenswerte PKR-Hemmung zeigte23,24. In dieser Studie stellen wir eine Methode zur Verwendung von PKR-vermitteltem selektiven Druck in Kombination mit Fluoreszenzauswahl vor, um ein VACV-Rekombinant zu erzeugen, das für E3L und K3L (VC-R4) gelöscht wurde und sich in PKR-fähigen Zellen, die von verschiedenen Arten stammen, nicht replizieren kann. Dieses rekombinante Virus bietet einen ausgezeichneten Hintergrund für die schnelle Generierung rekombinanter Viren, die Gene unter Kontrolle des nativen E3L-Promotors exezieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2X-Q5 Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492L</td>
			<td>High-fidelity polymerase used in PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11593027</td>
			<td>Bacterial selective agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cell Scrapers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>08-100-242</td>
			<td>Cell scraper to harvest infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto 2 Cell imaging system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMAFD2000</td>
			<td>Fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube, GFP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AMEP4651</td>
			<td>GFP Cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube, RFP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AMEP4652</td>
			<td>RFP Cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenJet</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100489</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) Broth</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10855021</td>
			<td>Bacterial growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch DNA gel extraction kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1020L</td>
			<td>Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch Plasmid Miniprep kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1010L</td>
			<td>Miniprep kit ussed to purify plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q500 Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q500-110</td>
			<td>Sonicator for virus lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RK13 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-37</td>
			<td>Rabbit kidney cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Multiwell Cell Culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>Cell culture plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, seamless generation of recombinant poxviruses using host range and visual selection

Das Vaccinia-Virus (VACV) war maßgeblich an der Ausrottung des Variolavirus (VARV), des Erregers der Pocken, aus der Natur beteiligt. Seit seiner ersten Verwendung als Impfstoff wurde VACV als Vektor für therapeutische Impfstoffe und als onkolytisches Virus entwickelt. Diese Anwendungen nutzen das leicht zu manipulierende Genom und das breite Host-Sortiment von VACV als hervorragende Plattform, um rekombinante Viren mit einer Vielzahl von therapeutischen Anwendungen zu erzeugen. Mehrere Methoden wurden entwickelt, um rekombinante VACV zu erzeugen, einschließlich Markerauswahlmethoden und transient dominante Selektion. Hier stellen wir eine Verfeinerung einer Hostrange-Auswahlmethode in Verbindung mit der visuellen Identifizierung rekombinanter Viren vor. Unsere Methode nutzt den selektiven Druck, der von der antiviralen Proteinkinase R (PKR) des Wirts erzeugt wird, gekoppelt mit einem fluoreszierenden Fusionsgen, das mCherry-tagged E3L, einen von zwei VACV PKR-Antagonisten, exzessiiert. Die Kassette, einschließlich des Gens von Interesse und der mCherry-E3L Fusion, wird von Sequenzen flankiert, die aus dem VACV-Genom abgeleitet sind. Zwischen dem Gen von Interesse und mCherry-E3L ist eine kleinere Region, die identisch mit den ersten 150 Nukleotiden des 3' Arms ist, um homologe Rekombination und Verlust des mCherry-E3L-Gens nach der Selektion zu fördern. Wir zeigen, dass diese Methode eine effiziente, nahtlose Erzeugung von rVACV in einer Vielzahl von Zelltypen ermöglicht, ohne dass eine Arzneimittelauswahl oder ein umfangreiches Screening auf mutierte Viren erforderlich ist.

Wir verwendeten das in Abbildung 1 dargestellte Verfahren, um einen VACV zu erzeugen, der sowohl die PKR-Antagonisten E3L als auch K3L fehlte, indem wir E3L durch EGFP in einem Virus ersetzten, das bereits für K3L (vP872) gelöscht wurde. Abbildung 2 zeigt rote fluoreszierende Plaques in PKR-kompetenten RK13-Zellen, die auf eine virale Expression von mCherry-E3L hinweisen, sowie EGFP, ausgedrückt in RK13+E3L+K3L-Zellen, die den Verlust von E3L und den Zusammen...

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Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

Dies ist eine Methode, um "scarinant" rekombinante Vaknie-Viren mit Host-Range-Auswahl und visuelle Identifizierung von rekombinanten Viren zu generieren.

Schnelle, nahtlose Generierung von rekombinanten Poxviren mit Host Range und visueller Auswahl

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a ...

Unsere Methode verwendet Hostbereichsauswahl und Fluoreszenzmarker für die effiziente und nahtlose Generierung von rekombinanten Impfstoffen in einer Vielzahl von Zelltypen. Diese Technik kombiniert die Geschwindigkeit der homologen Rekombination mit der narbenlosen Natur der transienten dominanten Selektion. Darüber hinaus hosten wir eine Sortimentsauswahl, um die Möglichkeit chemisch induzierter Veränderungen auszuschließen.Diese Methode kann auch verwendet werden, um Impfvirus oder andere Poxviren zu modifizieren, um fremde Gene auszudrücken, zum Beispiel, um Impfstoffe zu erzeugen. Wenn Sie dieses Protokoll nur mit Fluoreszenzauswahl durchführen, müssen Sie sicherstellen, dass Sie genügend Viren screenings, um relativ seltene Rekombinanten ohne selektiven PKR-Druck zu erkennen. Diese Methode beruht auf dem Gewinn und Verlust von Fluoreszenzmarkern, um erfolgreich Viren auszuwählen, die die Rekombinationskassetten erworben haben, und um Viren zu erkennen, die narbenlos neu kombiniert wurden.Um einen Rekombinationsvektor zu erzeugen, fügen Sie zunächst 17 Mikroliter DNase freies Wasser, 1,2 Mikroliter pro Primer, fünf Mikroliter 5x PCR-Reaktionspuffer, Vorlagen-DNA und 0,5 Mikroliter DNA-Polymerase zu einem PCR-Röhrchen pro Amplikon hinzu. Fügen Sie zusätzliches DNase-freies Wasser hinzu, um das Endvolumen in jedem Rohr auf 50 Mikroliter zu bringen. Und legen Sie die Rohre in einen Thermocycler.Schmelzen Sie die DNA bei 98 Grad Celsius für 30 Sekunden, bevor Sie 25 Runden eines dreistufigen PCR-Protokolls verwenden, wie angegeben. Um die Amplifikationsprodukte auf einem 1%Agarose-Gel zu visualisieren, fügen Sie 10 Mikroliter jedes DNA-Produkts und 2 Mikroliter Ladepuffer zu jedem Brunnen hinzu. Führen Sie das Gel für eine Stunde bei acht Volt pro Zentimeter.Verwenden Sie am Ende des Laufs ein DNA-Gel-Extraktionskit gemäß dem Herstellerprotokoll, um jedes Amplicon zu reinigen. Elute die Amplicons aus der Säule mit 50 Mikroliter DNase freies Wasser und sofortige Zentrifugation. Um einen Klonvektor linearisieren, fügen Sie zunächst ein Mikrogramm des Vektors, 17 Mikroliter DNase freies Wasser, 2 Mikroliter Reaktionspuffer und 1 Mikroliter EcoRI zu einem Rohr für eine eine Stunde Inkubation bei 37 Grad Celsius hinzu.Am Ende der Inkubation 0,2 Picomole des linearisierten Vektors 10 Mikroliter DNase freies Wasser und 10 Mikroliter DNA-Montagemaster-Mischung zu jedem isolierten Amplicon hinzufügen. Inkubieren Sie Proben bei 50 Grad Celsius für eine Stunde. Am Ende der Inkubation chemisch kompetente E.coli mit zwei Mikrolitern des montierten Produkts nach Standardprotokollen transformieren.Platte 100 Mikroliter transformierte Zellen auf LB-Agarose-Platten ergänzt mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin. Nach der nächtlichen Inkubation bei 37 Grad Celsius wählen Sie gut isolierte Kolonien zur Impfung in Luria-Brühe, ergänzt mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin über Nacht bei 37 Grad Celsius und 225 Umdrehungen pro Minute. Verwenden Sie am nächsten Morgen ein Plasmid-Miniprep-Kit, um die Plasmide zu isolieren.Und überprüfen Sie die Konzentration und Reinheit der DNA auf einem Spektralphotometer. Für die rekombinante Virusgenerierung, infizieren Sie eine konfluente Monoschicht geeigneter Zellen mit dem Virus, das bei einer Vielzahl von Infektionen von einer in einer Sechs-Well-Platte rekombiniert werden soll. Und die infizierten Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für eine Stunde inkubieren.Ersetzen Sie am Ende der Inkubation den Überstand in jedem Brunnen durch frisches DMEM und verwenden Sie ein handelsübliches Transfektionsreagenz nach dem Herstellerprotokoll. Fügen Sie jedem Brunnen drei Mikrogramm des Rekombinationsvektors hinzu. Legen Sie die Platte für weitere 48 Stunden in den Inkubator.Vor der Bündelung der Zellen aus jedem Transfektionszustand in einzelne 1,5 Milliliter-Röhren. Dann frieren Sie die gepoolten Zellen dreimal ein, bevor Sie die resultierenden Lysate 15 Sekunden lang bei einer Amplitude von 50 % beschallen. Als nächstes wird das beschallte Lysat, das von 10 bis 10 bis zur sechsten Konzentration in frischem DMEM geerntet wird, seriell 10-fach verdünnt und einen Milliliter jeder Verdünnung in einzelne Konfluentbrunnen einer Proteinkinase R-fähigen Zelllinie hinzugefügt.Platzieren Sie die Zellen für eine Stunde im Zellkultur-Inkubator, bevor Sie die Überstande durch ein frisches Medium ersetzen und die Zellen in den Zellkultur-Inkubator zurückführen. Identifizieren Sie nach 24 bis 48 Stunden die rekombinanten Viren durch Fluoreszenzmikroskopie. Plaques von rekombinanten Viren drücken aufgrund der Integration des mCherry-E3L-Fusionsgens rote Fluoreszenz aus.Plaque reinigen die rekombinanten Viren dreimal auf wildTyp RK13 Zellen. Nach drei Runden Plaquereinigung RK13+E3L+K3L-Zellen mit seriellen Verdünnungen des Plaquelysats infizieren. Um die zusammengebrochenen Viren zu identifizieren, durch Fluoreszenzmikroskopie mit einem geeigneten Bildgebungssystem, das mit GFP- und RFP-Filterwürfeln ausgestattet ist.Dann Plaque reinigen grün-nur VC-R4, oder farblose E3L Plaques dreimal auf RK13 + E3L + K3L Zellen. Sicherstellen, dass keine Plaques rot fluoreszieren. Infizieren Sie die Zellen mit mindestens 100 Plaque bildenden Einheiten, um Ihre Chancen zu erhöhen, eine farblose Plaque zu identifizieren.In seltenen Fällen können mehrere Infektionsrunden erforderlich sein. Rote fluoreszierende Plaques in Proteinkinase R-kompetenten RK13-Zellen deuten auf eine virale Expression von mCherry-E3L hin. Und farblose Plaques oder Plaques, die nur eGFP in RK13+E3L+K3L-Zellen exdrücken, bestätigen den Zusammenbruch des mCherry-E3L-Auswahlmarkers.Das rekombinante Virus VC-R4, dem beide Proteinkinase-R-Antagonisten fehlen, kann sich nicht in Proteinkinase R-kompetenten RK13-Zellen replizieren, während das scheinbare Virus VP872, das E3L ausdrückt, für die Replikation zuständig ist. Um zu bestätigen, dass diese Unfähigkeit, sich in RK13-Zellen zu replizieren, nur auf den Verlust von E3L zurückzuführen war, wurde das erweiterte GFP durch E3L im VC-R4-Virus ersetzt. Es generierte einen relevanten Virus mit dem gleichen Auswahlprotokoll.Interessanterweise wurden bei der Herstellung dieses Virus farblose Plaques, die mit dem Kollaps des mCherry-E3L-Auswahlmarkers konsistent sind, vor der Auswahl in RK13+E3L+K3L-Zellen identifiziert, die in der Regel zur Auswahl von narbenlosen Rekombinanten erforderlich sind. Wahrscheinlich aufgrund der erweiterten Sequenzidentität zwischen der mCherry-E3L-Rekombinationskassette und dem E3L-Gen, das in VC-R4 eingeführt wird. Im Durchschnitt wurden 12,6 % der Nachkommenvirionen mit dem transfizierten Plasmid rekombiniert, ähnlich wie zuvor gemeldete Frequenzen.Hier wird die Häufigkeit farbloser Plaques relativ zu den gesamten Plaques RK13+E3L+K3L-Zellen gezeigt, was zeigt, dass die Kollapsrate und der Verlust des mCherry-E3L-Auswahlmarkers mit einer Häufigkeit von etwa 1,8% aufgetreten sind. In der ersten Phase mit PKR kompetente Zellen sorgt dafür, dass alle Plaques mit enthalten enziellten rekombinanten Virus. In der zweiten Stufe mit PKR-Mangelzellen ermöglicht die Detektion von rekombinanten Viren mit einem Kollaps mCherry-E3L Locus.Dieser Ansatz ermöglicht es uns, schnell Viren zu erzeugen, die exogene Gene enthalten, zum Beispiel für die Impfstoffproduktion bieten die Expression von verschiedenen viralen PKR-Antagonisten. die Analyse artspezifischer Wechselwirkungen mit PKR von verschiedenen Wirten zu erleichtern.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Erzeugung von rekombinanten Influenza Virus von Plasmid-DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Forschung

Immunologie und Infektion

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening für Host beteiligten Faktoren in Vaccinia Virus-Infektion mit Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Kombination von Klebstoff-tape-basierten Sampling und Fluoreszenz In situ Hybridisierung zum schnellen Nachweis von Salmonellen On Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

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The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

Skalierbare High Throughput Auswahl aus Phagen-Antikörperbibliotheken angezeigt Synthetische

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

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Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

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Analyse von<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effektor Translokation in Wirtszellen unter Verwendung Beta-Lactamase-Effektor-Fusionen

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Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

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The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...