Name: rapid, seamless generation of recombinant poxviruses using host range and visual selection
Uploaded: 2020-05-24T14:30:00
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इस परियोजना को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एआई114851) द्वारा एसआर को वित्त पोषित किया गया था।

1. पुनर्संयोजन वेक्टर पैदा करना
<ol><li>चयन कैसेट उत्पन्न करने के लिए डिजाइन प्राइमर। कई ऑनलाइन प्राइमर डिजाइन टूल ्स का उपयोग करके, डीएनए अणुओं के आइसोथर्मल एंजाइमैटिक असेंबली को सुविधाजनक बनाने के लिए प...

<ol>
	<li>Brochier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+eradication+of+rabies+using+recombinant+vaccinia-rabies+vaccine.">Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine.</a> Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).</li><li>Pastoret, P. P., Brochier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+use+of+a+vaccinia-rabies+recombinant+oral+vaccine+for+the+control+of+wildlife+rabies;+a+link+between+Jenner+and+Pasteur.">The development and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur.</a> Epidemiology and Infection. 116 (3), 235-240 (1996).</li><li>Chan, W. M., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+Poxviruses.">Oncolytic Poxviruses.</a> Annual review of virology. 1 (1), 119-141 (2014).</li><li>Nguyen, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus-mediated+expression+of+human+erythropoietin+in+tumors+enhances+virotherapy+and+alleviates+cancer-related+anemia+in+mice.">Vaccinia virus-mediated expression of human erythropoietin in tumors enhances virotherapy and alleviates cancer-related anemia in mice.</a> Molecular Therapy. 21 (11), 2054-2062 (2013).</li><li>Frentzen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-VEGF+single-chain+antibody+GLAF-1+encoded+by+oncolytic+vaccinia+virus+significantly+enhances+antitumor+therapy.">Anti-VEGF single-chain antibody GLAF-1 encoded by oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12915-12920 (2009).</li><li>Pastoret, P. P., Vanderplasschen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxviruses+as+vaccine+vectors.">Poxviruses as vaccine vectors.</a> Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 26 (5-6), 343-355 (2003).</li><li>COLLIER, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+a+stable+smallpox+vaccine.">The development of a stable smallpox vaccine.</a> The Journal of Hygiene. 53 (1), 76-101 (1955).</li><li>Weir, J. P., Bajsz&#225;r, G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+the+vaccinia+virus+thymidine+kinase+gene+by+marker+rescue+and+by+cell-free+translation+of+selected+mRNA.">Mapping of the vaccinia virus thymidine kinase gene by marker rescue and by cell-free translation of selected mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (4), 1210-1214 (1982).</li><li>Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus:+a+selectable+eukaryotic+cloning+and+expression+vector.">Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (23), 7415-7419 (1982).</li><li>Nakano, E., Panicali, D., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+vaccinia+virus:+demonstration+of+marker+rescue.">Molecular genetics of vaccinia virus: demonstration of marker rescue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (5), 1593-1596 (1982).</li><li>Falkner, F. G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dominant+selection+of+recombinant+vaccinia+viruses.">Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses.</a> Journal of Virology. 64 (6), 3108-3111 (1990).</li><li>Staib, C., Drexler, I., Ohlmann, M., Wintersperger, S., Erfle, V., Sutter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Host+Range+Selection+for+Genetic+Engineering+of+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara.">Transient Host Range Selection for Genetic Engineering of Modified Vaccinia Virus Ankara.</a> BioTechniques. 28 (6), 1137-1148 (2000).</li><li>Staib, C., Drexler, I., Sutter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+Isolation+of+Recombinant+MVA.">Construction and Isolation of Recombinant MVA.</a> Vaccinia Virus and Poxvirology. , 77-99 (2004).</li><li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marker+gene+swapping+facilitates+recombinant+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara+production+by+host-range+selection.">Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection.</a> Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).</li><li>Pfaller, C. K., Li, Z., George, C. X., Samuel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+PKR+and+RNA+adenosine+deaminase+ADAR1:+New+roles+for+old+players+as+modulators+of+the+interferon+response.">Protein kinase PKR and RNA adenosine deaminase ADAR1: New roles for old players as modulators of the interferon response.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (5), 573-582 (2011).</li><li>Bevilacqua, P. C., George, C. X., Samuel, C. E., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+the+protein+kinase+PKR+to+RNAs+with+secondary+structure+defects:+Role+of+the+tandem+A+-+G+mismatch+and+noncontigous+helixes.">Binding of the protein kinase PKR to RNAs with secondary structure defects: Role of the tandem A - G mismatch and noncontigous helixes.</a> Biochemistry. 37 (18), 6303-6316 (1998).</li><li>Krishnamoorthy, T., Pavitt, G. D., Zhang, F., Dever, T. E., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+Binding+of+the+Phosphorylated+Subunit+of+Initiation+Factor+2+(eIF2)+to+the+Regulatory+Subunits+of+Guanine+Nucleotide+Exchange+Factor+eIF2B+Is+Required+for+Inhibition+of+Translation+Initiation.">Tight Binding of the Phosphorylated Subunit of Initiation Factor 2 (eIF2) to the Regulatory Subunits of Guanine Nucleotide Exchange Factor eIF2B Is Required for Inhibition of Translation Initiation.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (15), 5018-5030 (2001).</li><li>Rothenburg, S., Georgiadis, M. M., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+eIF2&#945;+kinases:+Adapting+translational+control+to+diverse+stresses.">Evolution of eIF2&#945; kinases: Adapting translational control to diverse stresses.</a> Evolution of the Protein Synthesis Machinery and Its Regulation. , 235-260 (2016).</li><li>Bratke, K. A., McLysaght, A., Rothenburg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+host+range+genes+in+poxvirus+genomes.">A survey of host range genes in poxvirus genomes.</a> Infection, Genetics and Evolution. 14, 406-425 (2013).</li><li>Chang, H. W., Watson, J. C., Jacobs, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E3L+gene+of+vaccinia+virus+encodes+an+inhibitor+of+the+interferon-induced,+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase.">The E3L gene of vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (11), 4825-4829 (1992).</li><li>Romano, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+PKR+by+vaccinia+virus+E3:+role+of+complex+formation+and+the+E3+N-terminal+domain.">Inhibition of double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR by vaccinia virus E3: role of complex formation and the E3 N-terminal domain.</a> Molecular and Cellular Biology. 18 (12), 7304-7316 (1998).</li><li>Beattie, E., Tartaglia, J., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus-encoded+eIF-2+alpha+homolog+abrogates+the+antiviral+effect+of+interferon.">Vaccinia virus-encoded eIF-2 alpha homolog abrogates the antiviral effect of interferon.</a> Virology. 183 (1), 419-422 (1991).</li><li>Park, C., Peng, C., Brennan, G., Rothenburg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+inhibition+of+antiviral+protein+kinase+R+by+capripoxviruses+and+vaccinia+virus.">Species-specific inhibition of antiviral protein kinase R by capripoxviruses and vaccinia virus.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1438 (1), 18-29 (2019).</li><li>Rothenburg, S., Brennan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-Specific+Host-Virus+Interactions:+Implications+for+Viral+Host+Range+and+Virulence.">Species-Specific Host-Virus Interactions: Implications for Viral Host Range and Virulence.</a> Trends in Microbiology. , (2019).</li><li>Chakrabarti, S., Sisler, J. R., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compact,+synthetic,+vaccinia+virus+early/late+promoter+for+protein+expression.">Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression.</a> BioTechniques. 23 (6), 1094-1097 (1997).</li><li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli:+Transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution+(recombinant+DNA).">One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution (recombinant DNA).</a> Biochemistry. 86, 2172-2175 (1989).</li><li>Chung, C. T., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+storage+of+competent+Escherichia+coli+cells.">Preparation and storage of competent Escherichia coli cells.</a> Methods in Enzymology. 218, 621-627 (1993).</li><li>Rahman, M. M., Liu, J., Chan, W. M., Rothenburg, S., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myxoma+Virus+Protein+M029+Is+a+Dual+Function+Immunomodulator+that+Inhibits+PKR+and+Also+Conscripts+RHA/DHX9+to+Promote+Expanded+Host+Tropism+and+Viral+Replication.">Myxoma Virus Protein M029 Is a Dual Function Immunomodulator that Inhibits PKR and Also Conscripts RHA/DHX9 to Promote Expanded Host Tropism and Viral Replication.</a> PLOS Pathogens. 9 (7), 1003465 (2013).</li><li>Evans, D. H., Stuart, D., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+genetic+recombination+among+cotransfected+plasmid+DNAs+in+poxvirus-infected+mammalian+cells.">High levels of genetic recombination among cotransfected plasmid DNAs in poxvirus-infected mammalian cells.</a> Journal of Virology. 62 (2), 367-375 (1988).</li><li>Ball, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+homologous+recombination+in+vaccinia+virus+DNA.">High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA.</a> Journal of Virology. 61 (6), 1788-1795 (1987).</li><li>Spyropoulos, D. D., Roberts, B. E., Panicali, D. L., Cohen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineation+of+the+viral+products+of+recombination+in+vaccinia+virus-infected+cells.">Delineation of the viral products of recombination in vaccinia virus-infected cells.</a> Journal of Virology. 62 (3), 1046-1054 (1988).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dominant+host-range+selection+using+Chinese+hamster+ovary+cells+to+generate+marker-free+recombinant+viral+vectors+from+vaccinia+virus.">Transient dominant host-range selection using Chinese hamster ovary cells to generate marker-free recombinant viral vectors from vaccinia virus.</a> BioTechniques. 62 (4), 183-187 (2017).</li></ol>

यहां हम अंतिम पुनः संयोजन वायरस में विदेशी डीएनए को बनाए रखने के बिना पुनः संयोजन vaccinia वायरस उत्पन्न करने के लिए एक क्षणिक मार्कर चयन रणनीति ३२ की एक भिन्नता पेश करते हैं । हमारी रणनीति एंटीबाय?...

वैक्सिनिया वायरस (VACV) प्रकृति से मानव रोगजनक, वेरिओला वायरस (VARV) के पहले सफल उन्मूलन के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी । कभी वैरिओला वायरस के संहार के बाद से, VACV सहित पॉक्सवायरस मानव और पशु चिकित्सा दोनों के लिए उपयोगी चिकित्सीय वायरस होना जारी रखा है । उदाहरण के लिए, एक VACV आधारित रेबीज वायरस वैक्सीन यूरोप1 और संयुक्त राज्य अमेरिका2में सिल्वेटिक रेबीज के संचरण को रोकने में बहुत प्रभावी रहा है । हाल ही में, ट्यूमर रोधी अणुओं (जैसे, एकल श्रृंखला एंटीबॉडी या मानव एरिथ्रोपोइटिन) की एक किस्म व्यक्त करने वाले पुनः संयोजन पॉक्सवायरस ने ऑन्कोलिटिकएजेंटों 3,,4,,5के रूप में सफलता को प्रोत्साहित करते हुए देखा है। VACV विशेष रूप से एक वेक्टर के रूप में आकर्षक है क्योंकि यह आनुवंशिक हेरफेर के लिए आसानी से उत्तरदायी है, एक व्यापक मेजबान रेंज के पास है, और यह विभिन्न परिस्थितियों में स्थिर है, जिससे क्षेत्र6,,7में आसान परिवहन और वैक्सीन व्यवहार्यता की अनुमति है। जबकि प्रयोगशाला प्रयोगों और वैक्सीन उत्पादन के लिए पुनर्संयोजन VACV उत्पन्न करने के लिए कई तकनीकों को विकसित किया गया है, इन वायरसों को उत्पन्न करने के लिए वर्तमान रणनीतियों की उल्लेखनीय सीमाएं हैं।
VACV की उपयोगिता के कारण, पुनर्संयोजन वायरस उत्पन्न करने के लिए कई रणनीतियों का विकास किया गया है। पहली रणनीति ट्रांसजीन और एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन जैसे एक चयन मार्कर जीन सहित एक कैसेट शुरू करने के लिए के रूपमें के रूप में मेल न को रोजगार । कैसेट वायरल जीनोम में एक विशिष्ट साइट के लिए जीन निर्देशन दो ~ 500 न्यूक्लियोटाइड्स (nt) या बड़े हथियारों से घिरा हुआ है, जिसे तब डबल क्रॉसओवर घटनाओं8,,9,,10द्वारा एकीकृत किया जाता है। यह रणनीति तेजी से और कुशल है; हालांकि, इसके परिणामस्वरूप मार्कर जीन के रूप में अतिरिक्त आनुवंशिक सामग्री होती है जो अप्रत्याशित प्रभाव पैदा कर सकती है। इसके अलावा, ट्रांसजीन की संख्या के लिए एक व्यावहारिक ऊपरी सीमा है जिसे उपलब्ध अद्वितीय चुनिंदा मार्कर की संख्या से सीमित किया जा सकता है। क्षणिक प्रमुख चयन (टीडीएस) रणनीतियों ने "स्कारलेस" रिकॉम्बिनेंट वायरस11की पीढ़ी को सुविधाजनक बनाकर इस मुद्दे को संबोधित किया है। इस रणनीति का उपयोग करके, एक म्यूटेंट VACV जीन और एक चुनिंदा मार्कर जीन युक्त प्लाज्मिड वायरल जीनोम में एकीकृत कर रहे हैं, लेकिन अतिरिक्त flanking VACV डीएनए के बिना । इस दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप एक ही क्रॉसओवर इवेंट द्वारा एकीकरण के परिणामस्वरूप पूरे प्लाज्मिड और VACV जीन के दोहराव का क्षणिक एकीकरण होता है। यह मध्यवर्ती तब तक स्थिर है जब तक इसे चयन दबाव में बनाए रखा जाता है, इस निर्माण को संवर्धन की अनुमति देता है । जब चयन हटा दिया जाता है, तो VACV दोहराव एक दूसरी क्रॉसओवर घटना को सक्षम बनाता है जिसके परिणामस्वरूप प्लाज्मिड को हटाया जाता है और लगभग 50:50 अनुपात में जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) या पुनः संयोजन वायरस का गठन होता है। जबकि टीडीएस विदेशी डीएनए की स्थिर शुरूआत की आवश्यकता के बिना पुनः संयोजन वायरस उत्पन्न करता है, कई वायरस क्लोन अनुक्रमण विश्लेषण, एक संभावित समय लेने वाली और महंगा कदम द्वारा अपेक्षित उत्परिवर्तन के लिए जांच की जानी चाहिए ।
यहां, हम इनमें से प्रत्येक दृष्टिकोण के सर्वोत्तम पहलुओं के संयोजन के लिए एक दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं, जो प्रतिकृति अक्षम संशोधित वास्तुक अंकारा12,,13,,14के लिए वर्णित दृष्टिकोण के समान है। यह रणनीति दृश्य और मेजबान रेंज चयन को जोड़ती है ताकि डबल क्रॉसओवर घटनाओं द्वारा पुनः संयोजन वायरस को तेजी से उत्पन्न किया जा सके, और बाद में समरूप पुनर्संयोजन द्वारा चयनित मार्कर जीन को खत्म किया जा सके। यह दृष्टिकोण टीडीएस दृष्टिकोणों की "स्कारलेस" प्रकृति के साथ, समरूप पुनर्संयोजन द्वारा मध्यस्थता किए गए म्यूटेंट की तेजी से पीढ़ी की अनुमति देता है, जबकि जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती वायरस को अलग करने के लिए बाद में स्क्रीनिंग चरण की आवश्यकता नहीं होती है। हमारी विधि एंटीबायोटिक चयन के स्थान पर मेजबान रेंज चयन का भी उपयोग करती है, सेल लाइन में रासायनिक रूप से प्रेरित फेनोटाइपिक परिवर्तनों के जोखिम को दूर करती है। इस दृष्टिकोण के लिए, हमने रिकॉम्बिनेंट VACV उत्पन्न करने के लिए चुनिंदा एजेंट के रूप में मेजबान एंटीवायरल प्रोटीन किनेज आर (पीकेआर) का उपयोग करने के लिए चुना है। पीकेआर को अधिकांश सेलप्रकार15में निष्क्रिय मोनोमर के रूप में व्यक्त किया जाता है। एन-टर्मिनल डीएसआरएनए-बाध्यकारी डोमेन में डबल-फंसे आरएनए (डीएसआरएनए) को बाध्यकारी करने पर, पीकेआर डिमेराइज़ करता है और16ऑटोफॉस्फेरीटेड है। पीकेआर का यह सक्रिय रूप यूकेरियोटिक दीक्षा कारक 2 (ईआईएफ2) के अल्फा उपइकाई को फॉस्फोरस करता है, अंततः रिबोसोम में सर्जक मेथिओनिल-टीआरएनए के वितरण को बाधित करता है, जिससे इंट्रासेलर अनुवाद को रोका जा सके और मोटे तौर पर कई वायरस परिवारों की प्रतिकृति को बाधित किया जा सके17,,18।
पीकेआर की व्यापक और शक्तिशाली एंटीवायरल गतिविधि के जवाब में, कई वायरस पीकेआर सक्रियण को रोकने के लिए कम से कम एक रणनीति विकसित की है। अधिकांश पॉक्सवायरस दो पीकेआर विरोधी व्यक्त करते हैं, जो VACV में E3L और K3L जीन द्वारा एन्कोड किए गए हैं, जो दो अलग-अलग तंत्र19के माध्यम से पीकेआर का विरोध करते हैं। ई 3 डबल-फंसे आरएनए20,,21को बाध्यकारी बनाकर पीकेआर होमोडिमराइजेशन को रोकता है, जबकि के3 सीधे सक्रिय पीकेआर के लिए बाध्य करके एक छद्म सब्सट्रेट अवरोधक के रूप में कार्य करता है और इस तरह इसके सब्सट्रेट eIF2α22के साथ बातचीत को बाधित करता है । महत्वपूर्ण बात, इन दो पीकेआर विरोधी जरूरी सभी प्रजातियों से पीकेआर बाधा नहीं है । उदाहरण के लिए, भेड़ पॉक्स वायरस से K3 समरूपता ने पीकेआर को भेड़ों से दृढ़ता से बाधित किया, जबकि भेड़ पॉक्स E3 होमोलॉग में काफी पीकेआर अवरोध23,,24नहीं दिखा। इस अध्ययन में, हम ई3एल और के3एल (VC-R4) के लिए हटाए गए VACV पुनर्संयोजन उत्पन्न करने के लिए फ्लोरेस चयन के साथ संयुक्त पीकेआर-मध्यस्थता चयनात्मक दबाव का उपयोग करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं, जो विभिन्न प्रजातियों से प्राप्त पीकेआर सक्षम कोशिकाओं में दोहराने नहीं कर सकता है। यह पुनः संयोजन वायरस देशी E3L प्रमोटर के नियंत्रण में जीन व्यक्त करने वाले पुनः संयोजन वायरस की तेजी से पीढ़ी के लिए एक उत्कृष्ट पृष्ठभूमि प्रदान करता है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2X-Q5 Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492L</td>
			<td>High-fidelity polymerase used in PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11593027</td>
			<td>Bacterial selective agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cell Scrapers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>08-100-242</td>
			<td>Cell scraper to harvest infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto 2 Cell imaging system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMAFD2000</td>
			<td>Fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube, GFP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AMEP4651</td>
			<td>GFP Cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube, RFP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AMEP4652</td>
			<td>RFP Cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenJet</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100489</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) Broth</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10855021</td>
			<td>Bacterial growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch DNA gel extraction kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1020L</td>
			<td>Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch Plasmid Miniprep kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1010L</td>
			<td>Miniprep kit ussed to purify plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q500 Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q500-110</td>
			<td>Sonicator for virus lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RK13 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-37</td>
			<td>Rabbit kidney cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Multiwell Cell Culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>Cell culture plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, seamless generation of recombinant poxviruses using host range and visual selection

वैक्सिनिया वायरस (VACV) प्रकृति से चेचक के कारक एजेंट वेरिओला वायरस (VARV) को समाप्त करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी। एक टीके के रूप में अपने पहले उपयोग के बाद से, VACV चिकित्सकीय टीक्टर के लिए एक वेक्टर के रूप में और एक कोकोलिटिक वायरस के रूप में विकसित किया गया है । ये एप्लिकेशन विभिन्न प्रकार के चिकित्सीय अनुप्रयोगों के साथ पुनः संयोजन वायरस उत्पन्न करने के लिए एक उत्कृष्ट मंच के रूप में VACV के आसानी से हेरफेर जीनोम और व्यापक मेजबान रेंज का लाभ उठाते हैं। मार्कर चयन विधियों और क्षणिक प्रमुख चयन सहित पुनर्संयोजन VACV उत्पन्न करने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं। यहां, हम एक मेजबान रेंज चयन विधि का शोधन प्रस्तुत करते हैं जिसमें रिकॉम्बिनेंट वायरस की दृश्य पहचान होती है। हमारी विधि मेजबान एंटीवायरल प्रोटीन किनेज आर (पीकेआर) द्वारा उत्पन्न चयनात्मक दबाव का लाभ उठाती है, जिसमें एक फ्लोरोसेंट फ्यूजन जीन के साथ मिलकर एमचेरी-टैग E3L, दो VACV पीकेआर विरोधियों में से एक व्यक्त किया जाता है। ब्याज के जीन और mCherry-E3L संलयन सहित कैसेट, VACV जीनोम से प्राप्त दृश्यों से घिरा हुआ है । ब्याज के जीन और mCherry-E3L के बीच एक छोटा क्षेत्र है जो चयन के बाद एमचेरी-ई3एल जीन के सहरूप पुनर्संयोजन और हानि को बढ़ावा देने के लिए 3 'बांह के पहले ~ 150 न्यूक्लियोटाइड्स के समान है। हम प्रदर्शित करते हैं कि यह विधि विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों में विभिन्न प्रकार के कोशिका प्रकारों में कुशल, निर्बाध उत्पादन की अनुमति देती है, बिना उत्परिवर्ती वायरस के लिए दवा चयन या व्यापक स्क्रीनिंग की आवश्यकता होती है।

हमने के3एल (vP872) के लिए पहले से हटाए गए वायरस में ईजीएफपी के साथ E3L की जगह लेते हुए, पीकेआर विरोधी E3L और K3L दोनों की कमी वाले VACV उत्पन्न करने के लिए चित्रा 1 में चित्रा 1 में आरेखित प्रक्रिया का उपयोग कि...

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Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

यह मेजबान-रेंज चयन और पुनः संयोजन वायरस की दृश्य पहचान का उपयोग करके "स्कारलेस" पुनर्संयोजन वैक्सिनिया वायरस उत्पन्न करने की एक विधि है।

मेजबान रेंज और दृश्य चयन का उपयोग करके पुनः संयोजन पॉक्सवायरस की रैपिड, निर्बाध पीढ़ी

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a ...

हमारी विधि विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों में पुनर्संयोजन वैसिना वायरस की कुशल और निर्बाध पीढ़ी के लिए मेजबान रेंज चयन और फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग करती है। यह तकनीक क्षणिक प्रमुख चयन की डरावनी प्रकृति के साथ मुताबिक़ पुनर्संयोजन की गति को जोड़ती है। इसके अलावा, हम रासायनिक रूप से प्रेरित परिवर्तनों की संभावना को खत्म करने के लिए रेंज चयन की मेजबानी करते हैं।इस विधि का उपयोग टीकों को उत्पन्न करने के लिए विदेशी जीनों को व्यक्त करने के लिए वैक्सिनिया वायरस या अन्य पॉक्सवायरस को संशोधित करने के लिए भी किया जा सकता है। यदि आप केवल फ्लोरेसेंस चयन के साथ इस प्रोटोकॉल का प्रदर्शन कर रहे हैं, तो आपको यह सुनिश्चित करना होगा कि आप पीकेआर चयनात्मक दबाव के बिना अपेक्षाकृत दुर्लभ पुनर्संयोजन का पता लगाने के लिए पर्याप्त वायरस की स्क्रीनिंग कर रहे हैं। यह विधि फ्लोरोसेंट मार्कर के लाभ और हानि पर निर्भर करती है ताकि उन वायरसों का सफलतापूर्वक चयन किया जा सके जिन्होंने पुनर्संयोजन कैसेट का अधिग्रहण किया है और उन वायरसों का पता लगाने के लिए जिन्होंने डरावने पुनः संयोजन किए हैं।एक रिकॉम्बिनेशन वेक्टर उत्पन्न करने के लिए, पहले DNase मुक्त पानी के 17 माइक्रोलीटर, प्रत्येक प्राइमर के 1.2 माइक्रोलीटर, 5x पीसीआर रिएक्शन बफर के पांच माइक्रोलीटर, टेम्पलेट डीएनए, और डीएनए पॉलीमरेज के 0.5 माइक्रोलीटर को प्रति एम्प्लिकॉन एक पीसीआर ट्यूब में जोड़ें। 50 माइक्रोलीटर के लिए प्रत्येक ट्यूब में अंतिम मात्रा लाने के लिए अतिरिक्त DNase मुफ्त पानी जोड़ें। और ट्यूबों को थर्मोसाइकिलर में रखें।संकेत के अनुसार तीन-चरण पीसीआर प्रोटोकॉल के 25 राउंड का उपयोग करने से पहले डीएनए को 30 सेकंड के लिए ९८ डिग्री सेल्सियस पर पिघलाएं । 1% एगर उठे जेल पर प्रवर्धन उत्पादों की कल्पना करने के लिए, प्रत्येक डीएनए उत्पाद के 10 माइक्रोलीटर और प्रत्येक अच्छी तरह से बफर लोड करने के 2 माइक्रोलीटर जोड़ें। आठ वोल्ट प्रति सेंटीमीटर पर एक घंटे के लिए जेल चलाएं।रन के अंत में, प्रत्येक एम्प्लिकॉन को शुद्ध करने के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार डीएनए जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करें। कॉलम से एम्प्लिकलन को 50 माइक्रोलीटर के साथ डीएनएसई मुक्त पानी और तत्काल अपकेंद्रित्र के साथ एल्यूट करें। एक क्लोनिंग वेक्टर को रैखिक करने के लिए, पहले वेक्टर का एक माइक्रोग्राम, DNase मुक्त पानी के 17 माइक्रोलीटर, प्रतिक्रिया बफर के 2 माइक्रोलीटर, और एक घंटे के लिए एक ट्यूब के लिए EcoRI के 1 माइक्रोलीटर ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन जोड़ें ।इनक्यूबेशन के अंत में, DNase मुक्त पानी के रैखिक वेक्टर 10 माइक्रोलीटर के 0.2 पिकोमोल जोड़ें, और डीएनए असेंबली मास्टर के 10 माइक्रोलीटर प्रत्येक अलग एम्प्लिकॉन में मिलाएं। एक घंटे तक 50 डिग्री सेल्सियस पर नमूने। इनक्यूबेशन के अंत में, मानक प्रोटोकॉल के अनुसार इकट्ठे उत्पाद के दो माइक्रोलीटर के साथ रासायनिक रूप से सक्षम ई. कोलाई को बदलें।प्लेट एलबी एगर उठे प्लेटों पर परिवर्तित कोशिकाओं के 100 माइक्रोलीटर एम्पिसिलिन के 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ पूरक होते हैं। रात भर ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के बाद, लुरिया शोरबा में टीका के लिए अच्छी तरह से अलग कालोनियों का चयन करें ३७ डिग्री सेल्सियस और प्रति मिनट प्रति मिनट २२५ क्रांतियों पर प्रति रात एम्पीसिलिन के १०० माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ पूरक । अगली सुबह, प्लाज्मिड को अलग करने के लिए प्लाज्मिड मिनीप्रेप किट का उपयोग करें।और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर डीएनए की एकाग्रता और शुद्धता की जांच करें। पुनः मिलाकर वायरस उत्पादन के लिए, एक छह-अच्छी प्लेट में एक के संक्रमण की बहुलता पर पुनः मिलाकर वायरस के साथ उपयुक्त कोशिकाओं के एक शांत मोनोलेयर को संक्रमित करें। और संक्रमित कोशिकाओं को एक घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर इनक्यूबेट ।इनक्यूबेशन के अंत में, प्रत्येक में सुपरनेट को ताजा डीएमईएम के साथ बदलें और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ट्रांसफैक्शन रिएजेंट का उपयोग करें। प्रत्येक अच्छी तरह से ब्याज के पुनर्संयोजन वेक्टर के तीन माइक्रोग्राम जोड़ें। अतिरिक्त 48 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में प्लेट रखें।प्रत्येक ट्रांसफेक्शन स्थिति से कोशिकाओं को व्यक्तिगत 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में पूल करने से पहले। फिर 50% आयाम पर 15 सेकंड के लिए परिणामस्वरूप lysates को सोनिक करने से पहले पूल्ड कोशिकाओं को तीन बार फ्रीज-गल लें। इसके बाद, क्रमिक रूप से 10 गुना सोनिकेटेड लिसेट को पतला करें, जो 10 से पहले 10 से 10 तक ताजा डीएमईएम में छठी एकाग्रता के लिए काटा जाता है और प्रोटीन किनेज़ आर सक्षम सेल लाइन के व्यक्तिगत ढुलमुल कुओं में प्रत्येक कमजोर पड़ने का एक मिलीलीटर जोड़ता है।कोशिकाओं को कोशिका संस्कृति इनक्यूबेटर में एक घंटे के लिए ताजा माध्यम के साथ supernatants की जगह और सेल संस्कृति इनक्यूबेटर के लिए कोशिकाओं को वापस रखने से पहले रखें । 24 से 48 घंटे के बाद फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी से रीकॉम्बिनेंट वायरस की पहचान करें। रीकॉम्बिनेंट वायरस से सजीले टुकड़े mCherry-E3L संलयन जीन के एकीकरण के कारण लाल फ्लोरेसेंस व्यक्त करते हैं ।पट्टिका जंगली प्रकार RK13 कोशिकाओं पर तीन बार recombinant वायरस शुद्ध। पट्टिका शुद्धिकरण के तीन दौर के बाद, पट्टिका के सीरियल कमजोर होने के साथ RK13 + E3L + K3L कोशिकाओं को संक्रमित करें। ढह वायरस की पहचान करने के लिए, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा एक उपयुक्त इमेजिंग जीएफपी और आरएफपी फिल्टर क्यूब्स से लैस प्रणाली का उपयोग कर ।फिर पट्टिका हरे रंग की केवल कुलपति-R4, या बेरंग E3L RK13 + E3L + K3L कोशिकाओं पर तीन बार सजीले टुकड़े शुद्ध । यह सुनिश्चित करना कि कोई सजीले टुकड़े लाल फ्लोरोस करें। एक रंगहीन पट्टिका की पहचान करने की संभावनाओं को बढ़ाने के लिए कम से कम 100 पट्टिका बनाने इकाइयों के साथ कोशिकाओं को संक्रमित करें।दुर्लभ मामलों में, संक्रमण के कई दौर की आवश्यकता हो सकती है। प्रोटीन किनेज आर सक्षम आरके13 कोशिकाओं में लाल फ्लोरोसेंट सजीले टुकड़े mCherry-E3L की वायरल अभिव्यक्ति का संकेत हैं। और RK13 + E3L + K3L कोशिकाओं में केवल eGFP व्यक्त रंगहीन सजीले टुकड़े या सजीले टुकड़े mCherry-E3L चयन मार्कर के पतन की पुष्टि करते हैं ।recombinant वायरस कुलपति-R4, जो दोनों प्रोटीन kinase आर विरोधी का अभाव प्रोटीन kinase आर सक्षम RK13 कोशिकाओं में दोहराने नहीं कर सकते, जबकि स्पष्ट वायरस VP872, जो E3L व्यक्त करता है प्रतिकृति सक्षम है । पुष्टि करने के लिए कि RK13 कोशिकाओं में दोहराने में असमर्थता केवल E3L के नुकसान के कारण थी, बढ़ाया GFP कुलपति-R4 वायरस में E3L के साथ प्रतिस्थापित किया गया था । यह एक ही चयन प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक प्रासंगिक वायरस उत्पन्न किया।दिलचस्प बात यह है कि इस वायरस को बनाते समय, रीचेरी-E3L चयन मार्कर के पतन के अनुरूप बेरंग सजीले टुकड़े की पहचान RK13 + E3L + K3L कोशिकाओं में चयन से पहले की गई थी जो आम तौर पर डरावने पुनर्संयोजन का चयन करने के लिए आवश्यक हैं। क्योंकि mCherry-E3L पुनर्संयोजन कैसेट और E3L जीन कुलपति-R4 में डाला जा रहा है के बीच विस्तारित अनुक्रम पहचान की संभावना है । औसतन 12.6% संतान विरनों ने संक्रमित प्लाज्मिड के साथ पुनर्संयोजन किया, जो पहले की रिपोर्ट की गई आवृत्तियों के समान था।यहां, कुल सजीले टुकड़े RK13 + E3L + K3L कोशिकाओं के सापेक्ष बेरंग सजीले टुकड़े की आवृत्ति दिखाया गया है, प्रदर्शन है कि पतन की दर और mCherry-E3L चयन मार्कर की हानि लगभग १.८% आवृत्ति पर हुई । पीकेआर सक्षम कोशिकाओं का उपयोग करके पहले चरण में यह सुनिश्चित करता है कि निहित पुनर्संयोजन वायरस वाले सभी सजीले टुकड़े। पीकेआर की कमी कोशिकाओं का उपयोग करके दूसरे चरण में पतन mCherry-E3L लोकस के साथ पुनर्संयोजन वायरस का पता लगाने में सक्षम बनाता है।यह दृष्टिकोण हमें तेजी से बहिर्जात जीन युक्त वायरस उत्पन्न करने की अनुमति देता है, उदाहरण के लिए, वैक्सीन उत्पादन के लिए विभिन्न वायरल पीकेआर विरोधी की अभिव्यक्ति प्रदान करते हैं। विभिन्न मेजबानों से पीकेआर के साथ प्रजातियों-विशिष्ट बातचीत के विश्लेषण को सुविधाजनक बनाने के लिए।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

पुनः संयोजक इन्फ्लुएंजा वायरस के डीएनए प्लाज्मिड से पीढ़ी

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

होस्ट में शामिल कारक के लिए आरएनएआई स्क्रीनिंग चेचक वायरस संक्रमण का उपयोग ड्रोसोफिला कक्ष

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

चिपकने वाला टेप आधारित नमूनाकरण और प्रतिदीप्ति का संयोजन बगल में</emरैपिड पता लगाने के लिए> संकरण साल्मोनेला ताजा उपज पर

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

एफडीए को मंजूरी दी वेरो कोशिकाओं में टीके के विकास के लिए संयोजक arenavirus की पीढ़ी

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

फेज-प्रदर्शित सिंथेटिक एंटीबॉडी पुस्तकालयों से स्केलेबल उच्च Throughput चुनाव

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

अमर छाँटे बी कोशिकाओं से पुनः संयोजक मानव आईजीजी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का सृजन

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

का विश्लेषण<em&gt; यर्सीनिया enterocolitica</emमेजबान कोशिकाओं में&gt; प्रेरक translocation बीटा-लैक्टामेज़ प्रेरक Fusions का उपयोग

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomyces विकासात्मक म्यूटेंट का दृश्य एवं सूक्ष्म मूल्यांकन

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

सेलुलर और जैविक स्तर के मेजबान प्रतिक्रियाओं के लिए जांच करने के लिए एक जीवाणु रोगज़नक़ का उपयोग करना

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

पीढ़ी, प्रवर्धन, और पुनः संयोजक श्वसन Syncytial वायरस के टाइट्रेट

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...