Name: rapid, seamless generation of recombinant poxviruses using host range and visual selection
Uploaded: 2020-05-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection at JoVE.com

このプロジェクトは、国立衛生研究所(AI114851)がSRに資金を提供しました。

1. 組み換えベクトルの生成
<ol><li>選択カセットを生成するプライマーを設計する。隣接するアンプリコンとベクトルと重なり合う配列を持つ個々のアンプリコンを設計し、いくつかのオンラインプライマー設計ツールのいずれかを使用して、ギブソンアセンブリとも呼ばれるDNA分子の等温酵素アセンブリを容易にします。 注: このプロトコルは、従来の制限エンドヌクレアーゼベースの?...

<ol>
	<li>Brochier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+eradication+of+rabies+using+recombinant+vaccinia-rabies+vaccine.">Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine.</a> Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).</li><li>Pastoret, P. P., Brochier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+use+of+a+vaccinia-rabies+recombinant+oral+vaccine+for+the+control+of+wildlife+rabies;+a+link+between+Jenner+and+Pasteur.">The development and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur.</a> Epidemiology and Infection. 116 (3), 235-240 (1996).</li><li>Chan, W. M., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+Poxviruses.">Oncolytic Poxviruses.</a> Annual review of virology. 1 (1), 119-141 (2014).</li><li>Nguyen, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus-mediated+expression+of+human+erythropoietin+in+tumors+enhances+virotherapy+and+alleviates+cancer-related+anemia+in+mice.">Vaccinia virus-mediated expression of human erythropoietin in tumors enhances virotherapy and alleviates cancer-related anemia in mice.</a> Molecular Therapy. 21 (11), 2054-2062 (2013).</li><li>Frentzen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-VEGF+single-chain+antibody+GLAF-1+encoded+by+oncolytic+vaccinia+virus+significantly+enhances+antitumor+therapy.">Anti-VEGF single-chain antibody GLAF-1 encoded by oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12915-12920 (2009).</li><li>Pastoret, P. P., Vanderplasschen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxviruses+as+vaccine+vectors.">Poxviruses as vaccine vectors.</a> Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 26 (5-6), 343-355 (2003).</li><li>COLLIER, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+a+stable+smallpox+vaccine.">The development of a stable smallpox vaccine.</a> The Journal of Hygiene. 53 (1), 76-101 (1955).</li><li>Weir, J. P., Bajsz&#225;r, G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+the+vaccinia+virus+thymidine+kinase+gene+by+marker+rescue+and+by+cell-free+translation+of+selected+mRNA.">Mapping of the vaccinia virus thymidine kinase gene by marker rescue and by cell-free translation of selected mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (4), 1210-1214 (1982).</li><li>Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus:+a+selectable+eukaryotic+cloning+and+expression+vector.">Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (23), 7415-7419 (1982).</li><li>Nakano, E., Panicali, D., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+vaccinia+virus:+demonstration+of+marker+rescue.">Molecular genetics of vaccinia virus: demonstration of marker rescue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (5), 1593-1596 (1982).</li><li>Falkner, F. G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dominant+selection+of+recombinant+vaccinia+viruses.">Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses.</a> Journal of Virology. 64 (6), 3108-3111 (1990).</li><li>Staib, C., Drexler, I., Ohlmann, M., Wintersperger, S., Erfle, V., Sutter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Host+Range+Selection+for+Genetic+Engineering+of+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara.">Transient Host Range Selection for Genetic Engineering of Modified Vaccinia Virus Ankara.</a> BioTechniques. 28 (6), 1137-1148 (2000).</li><li>Staib, C., Drexler, I., Sutter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+Isolation+of+Recombinant+MVA.">Construction and Isolation of Recombinant MVA.</a> Vaccinia Virus and Poxvirology. , 77-99 (2004).</li><li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marker+gene+swapping+facilitates+recombinant+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara+production+by+host-range+selection.">Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection.</a> Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).</li><li>Pfaller, C. K., Li, Z., George, C. X., Samuel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+PKR+and+RNA+adenosine+deaminase+ADAR1:+New+roles+for+old+players+as+modulators+of+the+interferon+response.">Protein kinase PKR and RNA adenosine deaminase ADAR1: New roles for old players as modulators of the interferon response.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (5), 573-582 (2011).</li><li>Bevilacqua, P. C., George, C. X., Samuel, C. E., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+the+protein+kinase+PKR+to+RNAs+with+secondary+structure+defects:+Role+of+the+tandem+A+-+G+mismatch+and+noncontigous+helixes.">Binding of the protein kinase PKR to RNAs with secondary structure defects: Role of the tandem A - G mismatch and noncontigous helixes.</a> Biochemistry. 37 (18), 6303-6316 (1998).</li><li>Krishnamoorthy, T., Pavitt, G. D., Zhang, F., Dever, T. E., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+Binding+of+the+Phosphorylated+Subunit+of+Initiation+Factor+2+(eIF2)+to+the+Regulatory+Subunits+of+Guanine+Nucleotide+Exchange+Factor+eIF2B+Is+Required+for+Inhibition+of+Translation+Initiation.">Tight Binding of the Phosphorylated Subunit of Initiation Factor 2 (eIF2) to the Regulatory Subunits of Guanine Nucleotide Exchange Factor eIF2B Is Required for Inhibition of Translation Initiation.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (15), 5018-5030 (2001).</li><li>Rothenburg, S., Georgiadis, M. M., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+eIF2&#945;+kinases:+Adapting+translational+control+to+diverse+stresses.">Evolution of eIF2&#945; kinases: Adapting translational control to diverse stresses.</a> Evolution of the Protein Synthesis Machinery and Its Regulation. , 235-260 (2016).</li><li>Bratke, K. A., McLysaght, A., Rothenburg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+host+range+genes+in+poxvirus+genomes.">A survey of host range genes in poxvirus genomes.</a> Infection, Genetics and Evolution. 14, 406-425 (2013).</li><li>Chang, H. W., Watson, J. C., Jacobs, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E3L+gene+of+vaccinia+virus+encodes+an+inhibitor+of+the+interferon-induced,+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase.">The E3L gene of vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (11), 4825-4829 (1992).</li><li>Romano, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+PKR+by+vaccinia+virus+E3:+role+of+complex+formation+and+the+E3+N-terminal+domain.">Inhibition of double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR by vaccinia virus E3: role of complex formation and the E3 N-terminal domain.</a> Molecular and Cellular Biology. 18 (12), 7304-7316 (1998).</li><li>Beattie, E., Tartaglia, J., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus-encoded+eIF-2+alpha+homolog+abrogates+the+antiviral+effect+of+interferon.">Vaccinia virus-encoded eIF-2 alpha homolog abrogates the antiviral effect of interferon.</a> Virology. 183 (1), 419-422 (1991).</li><li>Park, C., Peng, C., Brennan, G., Rothenburg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+inhibition+of+antiviral+protein+kinase+R+by+capripoxviruses+and+vaccinia+virus.">Species-specific inhibition of antiviral protein kinase R by capripoxviruses and vaccinia virus.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1438 (1), 18-29 (2019).</li><li>Rothenburg, S., Brennan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-Specific+Host-Virus+Interactions:+Implications+for+Viral+Host+Range+and+Virulence.">Species-Specific Host-Virus Interactions: Implications for Viral Host Range and Virulence.</a> Trends in Microbiology. , (2019).</li><li>Chakrabarti, S., Sisler, J. R., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compact,+synthetic,+vaccinia+virus+early/late+promoter+for+protein+expression.">Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression.</a> BioTechniques. 23 (6), 1094-1097 (1997).</li><li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli:+Transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution+(recombinant+DNA).">One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution (recombinant DNA).</a> Biochemistry. 86, 2172-2175 (1989).</li><li>Chung, C. T., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+storage+of+competent+Escherichia+coli+cells.">Preparation and storage of competent Escherichia coli cells.</a> Methods in Enzymology. 218, 621-627 (1993).</li><li>Rahman, M. M., Liu, J., Chan, W. M., Rothenburg, S., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myxoma+Virus+Protein+M029+Is+a+Dual+Function+Immunomodulator+that+Inhibits+PKR+and+Also+Conscripts+RHA/DHX9+to+Promote+Expanded+Host+Tropism+and+Viral+Replication.">Myxoma Virus Protein M029 Is a Dual Function Immunomodulator that Inhibits PKR and Also Conscripts RHA/DHX9 to Promote Expanded Host Tropism and Viral Replication.</a> PLOS Pathogens. 9 (7), 1003465 (2013).</li><li>Evans, D. H., Stuart, D., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+genetic+recombination+among+cotransfected+plasmid+DNAs+in+poxvirus-infected+mammalian+cells.">High levels of genetic recombination among cotransfected plasmid DNAs in poxvirus-infected mammalian cells.</a> Journal of Virology. 62 (2), 367-375 (1988).</li><li>Ball, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+homologous+recombination+in+vaccinia+virus+DNA.">High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA.</a> Journal of Virology. 61 (6), 1788-1795 (1987).</li><li>Spyropoulos, D. D., Roberts, B. E., Panicali, D. L., Cohen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineation+of+the+viral+products+of+recombination+in+vaccinia+virus-infected+cells.">Delineation of the viral products of recombination in vaccinia virus-infected cells.</a> Journal of Virology. 62 (3), 1046-1054 (1988).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dominant+host-range+selection+using+Chinese+hamster+ovary+cells+to+generate+marker-free+recombinant+viral+vectors+from+vaccinia+virus.">Transient dominant host-range selection using Chinese hamster ovary cells to generate marker-free recombinant viral vectors from vaccinia virus.</a> BioTechniques. 62 (4), 183-187 (2017).</li></ol>

ここでは、最終組換えウイルスに外来DNAを保持せずに組換えワクシニアウイルスを生成する過渡マーカー選択戦略32のバリエーションを提示する。我々の戦略は、抗生物質などの選択的圧力の他の形態ではなく、宿主抗ウイルスタンパク質PKRによって媒介される選択的圧力を使用する。宿主抗ウイルス遺伝子の使用は、細胞内の化学的に誘発された表型変化の可能性、また?...

ワクシニアウイルス(VACV)は、自然からヒト病原体、バリオラウイルス(VARV)の最初の成功した根絶に役立ちました。バリオラウイルスの駆除以来、VACVを含むポックスウイルスは、ヒトおよび動物医学の両方に有用な治療ウイルスであり続けています。例えば、VACVベースの狂犬病ウイルスワクチンは、欧州1及び米国2におけるシルベージ狂犬病の感染を予防するのに非常に有効であった。さらに最近では、様々な抗腫瘍分子(例えば、単鎖抗体またはヒトエリスロポエチン)を発現する組換えポックスウイルスは、腫瘍分解剤33、4、54,5として励ましの成功を見ている。VACVは、遺伝子操作に容易に適性であるためベクターとして特に魅力的であり、広い宿主範囲を有し、かつ様々な条件下で安定であり、フィールド66,77における容易な輸送およびワクチンの生存率を可能にする。実験室実験やワクチン生成のための組換えVACVを生成する複数の技術が開発されているが、これらのウイルスを生成するための現在の戦略には顕著な限界がある。
VACVの有用性により、組換えウイルスを生成する複数の戦略が開発されている。第1の戦略は、抗生物質耐性遺伝子などのトランスジーンおよび選択可能マーカー遺伝子を含むカセットを導入するために相同組換えを採用する。カセットは、2〜500ヌクレオチド(nt)以上の腕によって横にされ、遺伝子をウイルスゲノムの特定の部位に導き、その後、二重交差事象88、9、109,10によって安定的に統合される。この戦略は迅速かつ効率的です。しかし、それは予期しない効果を生み出す可能性のあるマーカー遺伝子の形で余分な遺伝物質をもたらす。さらに、利用可能なユニークな選択可能なマーカーの数によって制限される導入可能なトランス遺伝子の数に実用的な上限がある。一時的な支配的選択(TDS)戦略は、「瘢痕のない」組換えウイルス11の生成を促進することによってこの問題に対処してきた。この戦略を用いて、変異型VACV遺伝子と選択マーカー遺伝子を含むプラスミドをウイルスゲノムに統合するが、追加の隣接するVACV DNAは含まない。このアプローチは、単一のクロスオーバーイベントによる統合の結果として、プラスミド全体の一過性の統合とVACV遺伝子の重複をもたらす。この中間体は、選択圧力下で維持される限り安定であり、この構成体の濃縮を可能にする。選択が除去されると、VACVの複製は、プラスミドの除去と野生型(wt)または組換えウイルスのおよそ50:50比のいずれかで形成される第2のクロスオーバー事象を可能にする。TDSは、外来DNAの安定した導入を必要とせずに組換えウイルスを生成する一方で、複数のウイルスクローンをシーケンシング分析、潜在的に時間とコストのかかるステップによって予想される突然変異をスクリーニングする必要があります。
ここでは、これらのアプローチのそれぞれの最良の側面を組み合わせた組換えポックスウイルスを生成するアプローチを提示し、複製無能修飾ワクシニアアンカラ12、13、1413,14に対12して説明されているアプローチと同様である。この戦略は、視覚的およびホスト範囲の選択を組み合わせて、二重交差事象によって組換えウイルスを迅速に生成し、その後、相同組換えによって選択可能なマーカー遺伝子を排除する。このアプローチは、相同組換えによって媒介される突然変異体の迅速な生成を可能にし、TDSアプローチの「スカーレス」性質を有する一方で、野生型および変異型ウイルスを区別するためのその後のスクリーニングステップを必要としない。我々の方法はまた、抗生物質選択の代わりに宿主範囲選択を使用し、細胞株中の化学的に誘発されたフェノールの変化のリスクを排除する。このアプローチでは、組換えVACVを生成する選択剤として、宿主抗ウイルスタンパク質キナーゼR(PKR)を用いることを選択しました。PKRは、ほとんどの細胞タイプ15において非活性モノマーとして表される。N末端dsRNA結合ドメインで二本鎖RNA(dsRNA)を結合すると、PKRは二量体化し、自己リン酸化された16である。このPKRの活性型は、真核生物開始因子2(eIF2)のαサブユニットをリン酸化し、最終的には開始メチオニルtRNAのリボソームへの送達を阻害し、それによって細胞内翻訳を防止し、多くのウイルスファミリー17,18,18の複製を広く阻害する。
PKRの広範かつ強力な抗ウイルス活性に応答して、多くのウイルスはPKR活性化を防ぐために少なくとも1つの戦略を進化させた。ポックスウイルスの大部分は、2つのPKRアンタゴニストを発現し、VACV中のE3LおよびK3L遺伝子によってコードされ、2つの異なる機構19を介してPKRに拮抗する。E3は、二本鎖RNA20,21と結合することによりPKRホモジマー化を防ぎ、K321は活性化されたPKRに直接結合することにより擬似基質阻害剤として作用し、それによってその基質eIF2α22との相互作用を阻害する。22重要なことに、これら2種のPKRアンタゴニストは、必ずしもすべての種からPKRを阻害するわけではない。例えば、羊痘ウイルスからのK3ホモログは羊由来のPKRを強く阻害し、一方、シープポックスE3ホモログは、かなりのPKR阻害23、24,24を示さなかった。本研究では、蛍光選択と組み合わせたPKR媒介性選択的圧力を用いて、多様な種由来のPKRの有能な細胞では複製できないE3LおよびK3L(VC-R4)に対して削除されたVACV組換え体を生成する方法を提示する。この組換えウイルスは、ネイティブE3Lプロモーターの制御下で遺伝子を発現する組換えウイルスの迅速な生成のための優れた背景を提供します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2X-Q5 Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492L</td>
			<td>High-fidelity polymerase used in PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11593027</td>
			<td>Bacterial selective agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cell Scrapers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>08-100-242</td>
			<td>Cell scraper to harvest infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto 2 Cell imaging system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMAFD2000</td>
			<td>Fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube, GFP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AMEP4651</td>
			<td>GFP Cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube, RFP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AMEP4652</td>
			<td>RFP Cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenJet</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100489</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) Broth</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10855021</td>
			<td>Bacterial growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch DNA gel extraction kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1020L</td>
			<td>Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch Plasmid Miniprep kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1010L</td>
			<td>Miniprep kit ussed to purify plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q500 Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q500-110</td>
			<td>Sonicator for virus lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RK13 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-37</td>
			<td>Rabbit kidney cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Multiwell Cell Culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>Cell culture plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, seamless generation of recombinant poxviruses using host range and visual selection

ワクシニアウイルス(VACV)は天然痘の原因物質であるバリオラウイルス(VARV)を自然から根絶するのに役立った。ワクチンとして初めて使用されて以来、ワクチンのベクターとして、また、癌性ウイルスとして開発されてきました。これらのアプリケーションは、VACVの容易に操作されたゲノムおよび広い宿主範囲を優れたプラットフォームとして利用し、様々な治療用途を有する組換えウイルスを生成する。マーカー選択法や過渡性優先選択を含む組換えVACVを生成するためにいくつかの方法が開発されています。ここでは、組換えウイルスの視覚的同定と相まって、宿主範囲選択方法の改良を提示する。我々の方法は、宿主抗ウイルスタンパク質キナーゼR(PKR)によって生成される選択的圧力を、2つのVACV PKRアンタゴニストの1つであるmCherryタグ付きE3Lを発現する蛍光融合遺伝子と相まって利用する。カセットには、対象遺伝子およびmCherry-E3L融合を含む、VACVゲノムに由来する配列によって横たわっている。対象遺伝子とmCherry-E3Lとの間には、3'アームの最初の〜150ヌクレオチドと同一である小さい領域であり、選択後のmCherry-E3L遺伝子の相同組換えおよび喪失を促進する。我々は、この方法が、薬物選択や変異型ウイルスの広範なスクリーニングを必要とせずに、様々な細胞型における効率的でシームレスなrVACVの生成を可能にすることを実証する。

図1の手順を用いて、PKRアンタゴニストE3LとK3Lの両方を欠いたVACVを生成し、すでにK3Lのために削除されたウイルス中のEGFPにE3Lを置き換えることによって(vP872)。図2は、mCherry-E3Lのウイルス発現を示すPKRの有能RK13細胞における赤色蛍光プラーク、ならびに、mCherry-E3L選択マーカーのE3Lの喪失および崩壊を確認するRK13+E3L+K3L細胞で発現したEGFPを示す。<s...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection at JoVE.com

Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

これは、組み換えウイルスの宿主範囲選択および視覚的同定を用いて「瘢痕のない」組換えワクシニアウイルスを生成する方法である。

ホスト範囲と視覚選択を用いた組換えポックスウイルスの迅速かつシームレスな生成

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a ...

我々の方法は、多様な細胞タイプにおける組換えバクチーナウイルスの効率的かつシームレスな生成のために、宿主範囲選択および蛍光マーカーを使用する。この技術は、相同組換えの速度と一過性の支配的選択の瘢痕のない性質を兼ね備えています。また、化学的に誘発される変化の可能性を排除するために、範囲選択をホストしています。この方法は、ワクチンを生成するために、例えば、ワクチンを生成するために、例えば、外来遺伝子を発現させるためにワクシニアウイルスまたは他のポックスウイルスを修飾するために使用することができる。蛍光選択のみを使用してこのプロトコルを実行する場合は、PKR 選択的圧力なしで比較的まれな組換え組換え物を検出するのに十分なウイルスをスクリーニングしていることを確認する必要があります。この方法は、蛍光マーカーのゲインと損失に依存して、再結合カセットを獲得したウイルスを選択し、瘢痕のない再結合したウイルスを検出することに成功しました。組み換えベクターを生成するには、まず、17マイクロリットルのDNaseフリーウォーター、各プライマーの1.2マイクロリットル、5マイクロリットルのPCR反応バッファー、テンプレートDNA、および0.5マイクロリットルのDNAポリメラーゼをアンプリコン当たり1つのPCRチューブに加えます。DNaseフリーウォーターを追加して、各チューブの最終容積を50マイクロリットルにします。そして、チューブをサーモサイクラーに入れます。示されているように3段階PCRプロトコルの25ラウンドを使用する前に、30秒間摂氏98度でDNAを溶かします。1%アガロースゲルで増幅産物を可視化するには、各DNA製品の10マイクロリットルと各ウェルに2マイクロリットルのローディングバッファーを追加します。ゲルを1時間8ボルト/センチメートルで実行します。実行の最後に、各増幅を精製するゲル化するメーカーのプロトコルに従ってDNAゲル抽出キットを使用します。50マイクロリットルのDNaseフリーウォーターと即時遠心でカラムから切断コンを溶出します。クローニングベクターを直線化するには、まずベクトルのマイクログラム1マイクログラム、DNaseフリー水17マイクロリットル、反応バッファー2マイクロリットル、EcoRI 1マイクロリットルを37°Cで1時間インキュベーションします。インキュベーションの終わりに、DNaseフリー水の10マイクロリットルの線形化されたベクターの0.2ピコモール、および各単離された増幅子に10マイクロリットルのDNAアセンブリマスターミックスを加える。1時間摂氏50度でサンプルをインキュベートします。インキュベーションの最後に、標準的なプロトコルに従って組み立てられた製品の2マイクロリットルで化学的に有能な大腸菌を変換します。LBアガロースプレート上に100マイクロリットルの形質転換細胞をプレートし、1ミリリットル当たり100マイクログラムのアンピシリンを補った。摂氏37度で一晩培養した後、ルリアスープの接種のために十分に孤立したコロニーを選択し、1ミリリットル当たり100マイクログラムのアンピシリンを一晩37度摂氏と毎分225回転で補う。翌朝、プラスミドミニプレップキットを使用してプラスミドを分離します。そして分光光度計のDNAの濃度と純度を確認します。組換えウイルス生成の場合、6ウェルプレート内の1の感染の多重度で再結合されるウイルスに適した細胞のコンフルエント単層に感染する。そして、感染した細胞を摂氏37度、5%の二酸化炭素で1時間インキュベートする。インキュベーションの最後に、各ウェルの上澄み物を新鮮なDMEMに交換し、製造業者のプロトコルに従って市販のトランスフェクション試薬を使用します。各ウェルに目的の再結合ベクトルの3マイクログラムを追加します。プレートをインキュベーターに48時間置きます。各トランスフェクション条件から個々の1.5ミリリットルのチューブに細胞をプールする前に.その後、50%振幅で15秒間得られたライセートを超音波処理する前に、プールされた細胞を3回凍結解凍します。次に、超音波処理された溶解物を連続的に10倍希釈し、新鮮なDMEMで10〜10〜6濃度に収穫し、各希釈の1ミリリットルをプロテインキナーゼRのコンテントセルラインの個々のコンフルエントウェルに加える。上清を新鮮な培地に置き換え、細胞を細胞培養インキュベーターに戻す前に、細胞培養インキュベーターに1時間細胞を入れます。24~48時間後、蛍光顕微鏡で組換えウイルスを同定する。組換えウイルス由来のプラークは、mCherry-E3L融合遺伝子の統合により赤色蛍光を発現する。プラークは、野生型RK13細胞上で3回組換えウイルスを精製する。3回のプラーク精製の後、RK13+E3L+K3L細胞にプラーク溶菌の連続希釈液を感染させる。崩壊したウイルスを特定するために、GFPおよびRFPフィルターキューブを備えた適切な画像化システムを用いた蛍光顕微鏡観察を行う。次いで、プラークは緑色のみのVC-R4、または無色のE3LプラークをRK13+E3L+K3L細胞で3回精製する。プラークが赤く蛍光を発しない。少なくとも100のプラーク形成ユニットで細胞に感染し、無色のプラークを識別する可能性を高めます。まれに、感染の複数のラウンドが必要な場合があります。プロテインキナーゼRの有能なRK13細胞の赤色蛍光プラークは、mCherry-E3Lのウイルス発現を示す。そして、RK13+E3L+K3L細胞においてeGFPのみを発現する無色のプラークやプラークは、mCherry-E3L選択マーカーの崩壊を確認する。両方のプロテインキナーゼRアンタゴニストを欠いている組換えウイルスVC-R4は、E3Lを発現する見かけのウイルスVP872が、複製能力がある間、プロテインキナーゼRの有能なRK13細胞で複製することはできません。RK13細胞内で複製できないことがE3Lの喪失によるだけであることを確認するために、強化されたGFPは、VC-R4ウイルスにおいてE3Lに置き換えられた。同じ選択プロトコルを使用して関連するウイルスを生成した。興味深いことに、このウイルスを作っている間、一般的に瘢痕のない組換え遺伝子を選択するために必要とされるRK13+E3L+K3L細胞で選択する前に、mCherry-E3L選択マーカーの崩壊と一致する無色のプラークが同定された。mCherry-E3L組換えカセットとE3L遺伝子との間の拡張配列同一性がVC-R4に挿入されているためである可能性が高い。子孫のウイルスの平均12.6%は、以前に報告された周波数と同様に、トランスフェクトされたプラスミドとの再結合を受けた。ここでは、全プラークRK13+E3L+K3L細胞に対する無色のプラークの頻度が示されており、mCherry-E3L選択マーカーの崩壊率および損失が約1.8%の頻度で発生したことを示す。PKRの管轄細胞を使用して最初の段階では、組み換えウイルスを含むプラークのすべてを保証します。PKR欠損細胞を用いた第2段階では、mCherry-E3L遺伝子座の崩壊を伴う組換えウイルスの検出が可能となる。このアプローチは、例えば、ワクチン産生のために外因性遺伝子を含むウイルスを迅速に生成することを可能にし、異なるウイルスPKRアンタゴニストの発現を提供する。さまざまなホストからのPKRとの種特異的相互作用の分析を容易にする。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

プラスミドDNAの組換えインフルエンザウイルスの生成

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

に関与する宿主因子のためのRNAiスクリーニングワク</em使用して>ウイルス感染ショウジョウバエセル

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

粘着テープベースのサンプリングと蛍光の組み合わせその場で</emの迅速検出のための>ハイブリダイゼーションサルモネラ生鮮食品について

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

FDAの承認を受けたVero細胞におけるワクチン開発のための組換えアレナウイルスの生成

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

ファージディスプレイされた合成抗体ライブラリーから、スケーラブルな高スループットの選択

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

不死化ソートB細胞からの組換えヒトIgGモノクローナル抗体の作製

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

解析<em&gt;腸炎エルシニア</em&gt;エフェクター転β-ラクタマーゼエフェクター融合を用いて宿主細胞に

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

放線菌突然変異体のビジュアルと顕微鏡的評価

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

プローブに細菌の病原体を用いた細胞・生体レベルのホスト応答

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

世代、増幅、および組換え呼吸器合胞体ウイルスの滴定

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...