Name: rapid, seamless generation of recombinant poxviruses using host range and visual selection
Uploaded: 2020-05-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection at JoVE.com

이 프로젝트는 SR에 국립 보건원 (AI114851)에 의해 투자되었다.

1. 재조합 벡터 생성
<ol><li>선택 카세트를 생성하도록 프라이머를 디자인합니다. 여러 온라인 프라이머 설계 도구를 사용하여 Gibson 어셈블리라고도 하는 DNA 분자의 등온 효소 어셈블리를 용이하게 하기 위해 인접한 앰플리카 및 벡터와 겹치는 서열로 각 개별 앰플리클을 설계합니다. 참고: 이 프로토콜은 기존의 제한 endonuclease 기반 복제 방법을 사용하여 완료할 수도 있습니다. 이 경우 겹치는...

<ol>
	<li>Brochier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+eradication+of+rabies+using+recombinant+vaccinia-rabies+vaccine.">Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine.</a> Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).</li><li>Pastoret, P. P., Brochier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+use+of+a+vaccinia-rabies+recombinant+oral+vaccine+for+the+control+of+wildlife+rabies;+a+link+between+Jenner+and+Pasteur.">The development and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur.</a> Epidemiology and Infection. 116 (3), 235-240 (1996).</li><li>Chan, W. M., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+Poxviruses.">Oncolytic Poxviruses.</a> Annual review of virology. 1 (1), 119-141 (2014).</li><li>Nguyen, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus-mediated+expression+of+human+erythropoietin+in+tumors+enhances+virotherapy+and+alleviates+cancer-related+anemia+in+mice.">Vaccinia virus-mediated expression of human erythropoietin in tumors enhances virotherapy and alleviates cancer-related anemia in mice.</a> Molecular Therapy. 21 (11), 2054-2062 (2013).</li><li>Frentzen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-VEGF+single-chain+antibody+GLAF-1+encoded+by+oncolytic+vaccinia+virus+significantly+enhances+antitumor+therapy.">Anti-VEGF single-chain antibody GLAF-1 encoded by oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12915-12920 (2009).</li><li>Pastoret, P. P., Vanderplasschen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxviruses+as+vaccine+vectors.">Poxviruses as vaccine vectors.</a> Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 26 (5-6), 343-355 (2003).</li><li>COLLIER, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+a+stable+smallpox+vaccine.">The development of a stable smallpox vaccine.</a> The Journal of Hygiene. 53 (1), 76-101 (1955).</li><li>Weir, J. P., Bajsz&#225;r, G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+the+vaccinia+virus+thymidine+kinase+gene+by+marker+rescue+and+by+cell-free+translation+of+selected+mRNA.">Mapping of the vaccinia virus thymidine kinase gene by marker rescue and by cell-free translation of selected mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (4), 1210-1214 (1982).</li><li>Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus:+a+selectable+eukaryotic+cloning+and+expression+vector.">Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (23), 7415-7419 (1982).</li><li>Nakano, E., Panicali, D., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+vaccinia+virus:+demonstration+of+marker+rescue.">Molecular genetics of vaccinia virus: demonstration of marker rescue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (5), 1593-1596 (1982).</li><li>Falkner, F. G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dominant+selection+of+recombinant+vaccinia+viruses.">Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses.</a> Journal of Virology. 64 (6), 3108-3111 (1990).</li><li>Staib, C., Drexler, I., Ohlmann, M., Wintersperger, S., Erfle, V., Sutter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Host+Range+Selection+for+Genetic+Engineering+of+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara.">Transient Host Range Selection for Genetic Engineering of Modified Vaccinia Virus Ankara.</a> BioTechniques. 28 (6), 1137-1148 (2000).</li><li>Staib, C., Drexler, I., Sutter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+Isolation+of+Recombinant+MVA.">Construction and Isolation of Recombinant MVA.</a> Vaccinia Virus and Poxvirology. , 77-99 (2004).</li><li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marker+gene+swapping+facilitates+recombinant+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara+production+by+host-range+selection.">Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection.</a> Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).</li><li>Pfaller, C. K., Li, Z., George, C. X., Samuel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+PKR+and+RNA+adenosine+deaminase+ADAR1:+New+roles+for+old+players+as+modulators+of+the+interferon+response.">Protein kinase PKR and RNA adenosine deaminase ADAR1: New roles for old players as modulators of the interferon response.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (5), 573-582 (2011).</li><li>Bevilacqua, P. C., George, C. X., Samuel, C. E., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+the+protein+kinase+PKR+to+RNAs+with+secondary+structure+defects:+Role+of+the+tandem+A+-+G+mismatch+and+noncontigous+helixes.">Binding of the protein kinase PKR to RNAs with secondary structure defects: Role of the tandem A - G mismatch and noncontigous helixes.</a> Biochemistry. 37 (18), 6303-6316 (1998).</li><li>Krishnamoorthy, T., Pavitt, G. D., Zhang, F., Dever, T. E., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+Binding+of+the+Phosphorylated+Subunit+of+Initiation+Factor+2+(eIF2)+to+the+Regulatory+Subunits+of+Guanine+Nucleotide+Exchange+Factor+eIF2B+Is+Required+for+Inhibition+of+Translation+Initiation.">Tight Binding of the Phosphorylated Subunit of Initiation Factor 2 (eIF2) to the Regulatory Subunits of Guanine Nucleotide Exchange Factor eIF2B Is Required for Inhibition of Translation Initiation.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (15), 5018-5030 (2001).</li><li>Rothenburg, S., Georgiadis, M. M., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+eIF2&#945;+kinases:+Adapting+translational+control+to+diverse+stresses.">Evolution of eIF2&#945; kinases: Adapting translational control to diverse stresses.</a> Evolution of the Protein Synthesis Machinery and Its Regulation. , 235-260 (2016).</li><li>Bratke, K. A., McLysaght, A., Rothenburg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+host+range+genes+in+poxvirus+genomes.">A survey of host range genes in poxvirus genomes.</a> Infection, Genetics and Evolution. 14, 406-425 (2013).</li><li>Chang, H. W., Watson, J. C., Jacobs, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E3L+gene+of+vaccinia+virus+encodes+an+inhibitor+of+the+interferon-induced,+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase.">The E3L gene of vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (11), 4825-4829 (1992).</li><li>Romano, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+PKR+by+vaccinia+virus+E3:+role+of+complex+formation+and+the+E3+N-terminal+domain.">Inhibition of double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR by vaccinia virus E3: role of complex formation and the E3 N-terminal domain.</a> Molecular and Cellular Biology. 18 (12), 7304-7316 (1998).</li><li>Beattie, E., Tartaglia, J., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus-encoded+eIF-2+alpha+homolog+abrogates+the+antiviral+effect+of+interferon.">Vaccinia virus-encoded eIF-2 alpha homolog abrogates the antiviral effect of interferon.</a> Virology. 183 (1), 419-422 (1991).</li><li>Park, C., Peng, C., Brennan, G., Rothenburg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+inhibition+of+antiviral+protein+kinase+R+by+capripoxviruses+and+vaccinia+virus.">Species-specific inhibition of antiviral protein kinase R by capripoxviruses and vaccinia virus.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1438 (1), 18-29 (2019).</li><li>Rothenburg, S., Brennan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-Specific+Host-Virus+Interactions:+Implications+for+Viral+Host+Range+and+Virulence.">Species-Specific Host-Virus Interactions: Implications for Viral Host Range and Virulence.</a> Trends in Microbiology. , (2019).</li><li>Chakrabarti, S., Sisler, J. R., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compact,+synthetic,+vaccinia+virus+early/late+promoter+for+protein+expression.">Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression.</a> BioTechniques. 23 (6), 1094-1097 (1997).</li><li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli:+Transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution+(recombinant+DNA).">One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution (recombinant DNA).</a> Biochemistry. 86, 2172-2175 (1989).</li><li>Chung, C. T., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+storage+of+competent+Escherichia+coli+cells.">Preparation and storage of competent Escherichia coli cells.</a> Methods in Enzymology. 218, 621-627 (1993).</li><li>Rahman, M. M., Liu, J., Chan, W. M., Rothenburg, S., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myxoma+Virus+Protein+M029+Is+a+Dual+Function+Immunomodulator+that+Inhibits+PKR+and+Also+Conscripts+RHA/DHX9+to+Promote+Expanded+Host+Tropism+and+Viral+Replication.">Myxoma Virus Protein M029 Is a Dual Function Immunomodulator that Inhibits PKR and Also Conscripts RHA/DHX9 to Promote Expanded Host Tropism and Viral Replication.</a> PLOS Pathogens. 9 (7), 1003465 (2013).</li><li>Evans, D. H., Stuart, D., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+genetic+recombination+among+cotransfected+plasmid+DNAs+in+poxvirus-infected+mammalian+cells.">High levels of genetic recombination among cotransfected plasmid DNAs in poxvirus-infected mammalian cells.</a> Journal of Virology. 62 (2), 367-375 (1988).</li><li>Ball, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+homologous+recombination+in+vaccinia+virus+DNA.">High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA.</a> Journal of Virology. 61 (6), 1788-1795 (1987).</li><li>Spyropoulos, D. D., Roberts, B. E., Panicali, D. L., Cohen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineation+of+the+viral+products+of+recombination+in+vaccinia+virus-infected+cells.">Delineation of the viral products of recombination in vaccinia virus-infected cells.</a> Journal of Virology. 62 (3), 1046-1054 (1988).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dominant+host-range+selection+using+Chinese+hamster+ovary+cells+to+generate+marker-free+recombinant+viral+vectors+from+vaccinia+virus.">Transient dominant host-range selection using Chinese hamster ovary cells to generate marker-free recombinant viral vectors from vaccinia virus.</a> BioTechniques. 62 (4), 183-187 (2017).</li></ol>

여기서 우리는 최종 재조합 바이러스에서 외래 DNA를 유지하지 않고 재조합 백시니아 바이러스를 생성하기 위한 과도 마커 선택 전략(32)의 변이를 제시한다. 우리의 전략은 항생제와 같은 선택적 압력의 그밖 양식 보다는 오히려 호스트 항바이러스 단백질 PKR에 의해 중재된 선택적인 압력을 이용합니다. 숙주 항 바이러스 유전자의 사용은 세포에 화학적으로 유도 된 현상형 변화...

백시니아 바이러스 (VACV)는 자연에서 인간 병원균, 바리올라 바이러스 (VARV)의 첫 번째 성공적인 박멸을위한 도구였다. 바리올라 바이러스의 박멸 이후, VACV를 포함한 백스바이러스는 인간 및 동물 의학 모두에 유용한 치료 바이러스로 계속 되어 왔습니다. 예를 들어, VACV 기반 광견병 바이러스 백신은 유럽1 및 미국2에서실바틱 광견병의 전염을 방지하는 데 매우 효과적이었다. 보다 최근에는 다양한 항종양 분자(예를 들어, 단일 사슬 항체 또는 인간 에리스로포이에틴)를 발현하는 재조합 백혈바이러스가 종양용해제3,,4,,5로서의욕적인 성공을 보이고 있다. VACV는 유전자 조작에 용이하게 순종할 수 있고, 광범위한 숙주 범위를 보유하며, 다양한 조건하에서 안정되어, 현장에서 의 수송 및 백신 생존이 용이하기 때문에 벡터로서 특히 매력적이다6,,7. 실험실 실험 및 백신 생성을 위한 재조합 VACV를 생성하기 위하여 다중 기술이 개발된 동안, 이 바이러스를 생성하는 현재 전략은 주목할 만한 한계가 있습니다.
VACV의 유용성 으로 인해 재조합 바이러스를 생성하는 여러 전략이 개발되었습니다. 첫번째 전략은 항생 저항 유전자와 같은 이식유전자 및 선택 가능한 마커 유전자를 포함하는 카세트를 소개하기 위하여 상동 재조합을 이용합니다. 카세트는 2~500개의 뉴클레오티드(nt) 또는 더 큰 암에 의해 측면이 바이러스 게놈내의 특정 부위로 유전자를 지시하고, 이어서 이중 크로스오버 이벤트8,,9,,10에의해 안정적으로 통합된다. 이 전략은 빠르고 효율적입니다. 그러나, 그것은 예기치 않은 효력을 생성할 수 있는 마커 유전자의 양식에 있는 추가 유전 물자 초래합니다. 더욱이, 유효한 고유 선택 가능한 마커의 수에 의해 제한될 수 있는 트랜스게네의 수에 대한 실질적인 상한이 있다. 과도 지배적 인 선택 (TDS) 전략은 "무모"재조합 바이러스의 생성을 촉진하여이 문제를해결11. 이 전략을 사용하여, 돌연변이 VACV 유전자 및 선택 가능한 마커 유전자를 포함하는 플라스미드는 바이러스 게놈으로 통합되지만, 추가적인 측면 VACV DNA는 없이 통합된다. 이러한 접근법은 단일 크로스오버 이벤트에 의한 통합의 결과로 VACV 유전자의 전체 플라스미드 및 복제의 과도 적분을 초래한다. 이 중간은 선택 압력하에서 유지되는 한 안정적이며, 이 구제의 농축을 허용합니다. 선택이 제거되면, VACV 중복은 약 50:50 비율로 야생 형 (wt) 또는 재조합 바이러스 중 하나의 플라스미드 및 후속 형성의 제거를 초래하는 두 번째 크로스 오버 이벤트를 가능하게한다. TDS는 외국 DNA의 안정한 소개를 요구하지 않고 재조합 바이러스를 생성하는 동안, 다중 바이러스 클론은 시퀀싱 분석에 의해 예상되는 돌연변이를 위해 가려져야 합니다, 잠재적으로 시간 소모적이고 비용이 많이 드는 단계.
여기서, 우리는 이러한 접근법의 각각의 가장 좋은 측면을 결합한 재조합 백스바이러스를 생성하는 접근법을 제시하며, 이는 복제가 무능한 변형백시니아 앙카라12,,13,,14에대해 기재된 접근법과 유사하다. 이 전략은 이중 크로스오버 이벤트에 의해 재조합 바이러스를 신속하게 생성하고, 이어서 상동 재조합에 의해 선택 가능한 마커 유전자를 제거하기 위해 시각 및 숙주 범위 선택을 결합한다. 이 접근법은 야생 유형과 돌연변이 바이러스를 구별하기 위한 후속 스크리닝 단계를 요구하지 않는 동안 TDS 접근법의 "무불한" 특성과 함께 상동 재조합에 의해 매개된 돌연변이체의 신속한 생성을 허용합니다. 우리의 방법은 또한 세포주에서 화학적으로 유도된 현상형 변경의 리스크를 제거하는 항생제 선택 대신에 호스트 범위 선택을 이용합니다. 이러한 접근법을 위해, 우리는 숙주 항바이러스 단백질 키나제 R(PKR)을 재조합 VACV를 생성하는 선택적 제제로서 사용하기로 선택하였다. PKR은 대부분의 세포 유형15에서비활성 단량체로 발현된다. N-말단 dsRNA 결합 도메인에서 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 결합하면 PKR은 이화되고16을자가 포설화된다. 이러한 활성 형태의 PKR 인산화는 진핵 개시 인자 2(eIF2)의 알파 소부를 궁극적으로 리보솜으로 의 이니시에이터 메티오닐-tRNA의 전달을 억제하고, 세포내 번역을 방지하고 많은 바이러스 군모의 복제를 광범위하게 억제한다17,,18.
PKR의 광범위하고 강력한 항바이러스 활성에 반응하여, 많은 바이러스는 PKR 활성화를 방지하기 위한 적어도 하나의 전략을 발전시키고 있다. 대부분의 백혈바이러스는 2개의 PKR 길항제를 발현하고, VACV에 있는 E3L 및 K3L 유전자에 의해 인코딩되고, 이는 2개의 명백한 기계장치19를통해 PKR을 적대합니다. E3는 이중 가닥 RNA20,,21,K3가 활성화된 PKR에 직접 결합하여 가성 기질 억제제로서 작용하여 PKR 을 결합하여 PKR 을 결합하여 PKR 을 상호작용을 방지하고 이에 의해 eIF2α22를억제한다. 중요한 것은, 이 두 PKR 길항제가 모든 종으로부터 PKR을 반드시 억제하는 것은 아니다. 예를 들어, 양두 바이러스로부터의 K3 호몰로그는 양으로부터 PKR을 강하게 억제한 반면, 양두 E3 상동체는 상당한 PKR 억제를 나타내지않았다(23,,24). 본 연구에서, 우리는 다양한 종에서 유래한 PKR 유능한 세포에서 복제할 수 없는 E3L 및 K3L(VC-R4)에 대해 삭제된 VACV 재조합을 생성하기 위해 형광 선택과 결합된 PKR 매개 선택적 압력을 사용하는 방법을 제시한다. 이러한 재조합 바이러스는 네이티브 E3L 프로모터의 제어 하에 유전자를 발현하는 재조합 바이러스의 신속한 생성을 위한 훌륭한 배경을 제공한다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2X-Q5 Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492L</td>
			<td>High-fidelity polymerase used in PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11593027</td>
			<td>Bacterial selective agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cell Scrapers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>08-100-242</td>
			<td>Cell scraper to harvest infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto 2 Cell imaging system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMAFD2000</td>
			<td>Fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube, GFP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AMEP4651</td>
			<td>GFP Cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube, RFP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AMEP4652</td>
			<td>RFP Cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenJet</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100489</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) Broth</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10855021</td>
			<td>Bacterial growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch DNA gel extraction kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1020L</td>
			<td>Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch Plasmid Miniprep kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1010L</td>
			<td>Miniprep kit ussed to purify plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q500 Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q500-110</td>
			<td>Sonicator for virus lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RK13 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-37</td>
			<td>Rabbit kidney cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Multiwell Cell Culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>Cell culture plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, seamless generation of recombinant poxviruses using host range and visual selection

백시니아 바이러스 (VACV)는 자연에서 천연두의 원인 인 바리올라 바이러스 (VARV)를 근절하는 데 중요한 역할을했습니다. 백신으로 처음 사용된 이후, VACV는 치료 백신및 온용해 바이러스의 벡터로 개발되었습니다. 이러한 응용 분야는 VACV의 쉽게 조작할 수 있는 게놈 및 광범위한 숙주 범위를 다양한 치료 응용 분야와 함께 재조합 바이러스를 생성하는 뛰어난 플랫폼으로 활용합니다. 마커 선택 방법 및 과도 지배적 선택을 포함하여 재조합 VACV를 생성하기 위해 여러 가지 방법이 개발되었습니다. 여기서, 재조합 바이러스의 시각적 식별과 결합된 숙주 범위 선택 방법의 구체화를 제시한다. 우리의 방법은 mCherry 태그E3L를 발현하는 형광 융합 유전자와 결합된 숙주 항바이러스 단백질 키나제 R(PKR)에 의해 생성된 선택적 압력을 활용하며, 두 개의 VACV PKR 길항제 중 하나이다. 관심 있는 유전자 및 mCherry-E3L 융합을 포함하는 카세트는 VACV 게놈으로부터 유래된 서열에 의해 측면화된다. 관심 유전자와 mCherry-E3L 사이에는 3' 암의 제1~150뉴클레오티드와 동일한 더 작은 영역이며, 선택 후 mCherry-E3L 유전자의 상동성 재조합 및 손실을 촉진한다. 당사는 이 방법이 돌연변이 바이러스에 대한 약물 선택 또는 광범위한 스크리닝을 요구하지 않고 다양한 세포 유형에서 효율적이고 원활한 rVACV 생성을 허용한다는 것을 입증합니다.

그림 1에서 다이어그램으로 된 절차를 사용하여 이미 K3L(vP872)에 대해 삭제된 바이러스에서 E3L을 EGFP로 대체하여 PKR 길항제 E3L및 K3L이 결여된 VACV를 생성했습니다. 도 2는 MCherry-E3L의 바이러스 발현을 나타내는 PKR 유능한 RK13 세포에서 적색 형광 플라크뿐만 아니라 RK13+E3L+K3L 세포에서 발현된 EGFP를 나타내며, mCherry-E3L 선택 마커의 붕괴 및 E3L의 붕괴를 확?...

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Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

이는 재조합 바이러스의 호스트 범위 선택 및 시각적 식별을 사용하여 "무소" 재조합 백시니아 바이러스를 생성하는 방법이다.

호스트 범위 및 시각적 선택을 사용하여 신속하고 원활한 재조합 Poxviruses 생성

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a ...

우리의 방법은 다양한 세포 유형에서 재조합 vaccina 바이러스의 효율적이고 원활한 생성을 위해 호스트 범위 선택 및 형광 마커를 사용합니다. 이 기술은 동종 재조합의 속도와 일시적인 지배적 선택의 흉터 특성을 결합합니다. 또한, 화학적으로 유발된 변화의 가능성을 제거하기 위해 범위 선택을 주최합니다.이 방법은 또한 백신을 생성하기 위하여 외국 유전자를 표현하기 위하여 vaccinia 바이러스 또는 그밖 poxviruses를 수정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 형광 선택으로만 이 프로토콜을 수행하는 경우 PKR 선택적 압력 없이 비교적 희귀한 재조합을 감지하기에 충분한 바이러스를 선별해야 합니다. 이 방법은 형광 마커의 이득과 손실에 의존하여 재조합 카세트를 성공적으로 획득 한 바이러스를 선택하고 흉터가 재결합 된 바이러스를 감지합니다.재조합 벡터를 생성하려면 먼저 DNase 무료 물 17 마이크로리터, 각 프라이머의 1.2 마이크로리터, 5배 PCR 반응 버퍼 5개 마이크로리터, 템플릿 DNA 및 0.5 마이크로리터의 DNA 폴리머라아제를 앰플리콘당 하나의 PCR 튜브에 추가합니다. DNase 무료 물을 추가하여 각 튜브의 최종 볼륨을 50 마이크로리터로 가져옵니다. 그리고 튜브를 열순환기로 배치합니다.표시된 대로 3단계 PCR 프로토콜의 25라운드를 사용하기 전에 30초 동안 98도의 섭씨에서 DNA를 녹입니다. 증폭 제품을 1%의 아가로즈 젤에 시각화하려면 각 DNA 제품의 마이크로리터 10개와 각 웰에 적재 버퍼 2개를 추가합니다. 젤을 8볼트퍼센트에서 1시간 동안 실행합니다.실행의 끝에서, 각 앰플리턴을 정화 하는 젤 제조 업체의 프로토콜에 따라 DNA 젤 추출 키트를 사용 하 여. DNase 무료 물과 즉각적인 원심 분리의 50 마이크로 리터와 열에서 앰프를 엘테. 복제 벡터를 선형화하려면 먼저 벡터 1마이크로그램, DNase 프리 워터 17 마이크로리터, 반응 버퍼 2편, 에코리 마이크로리터 1개를 37도에서 1시간 동안 튜브에 첨가한다.인큐베이션의 끝에서, DNase 자유물의 선형화된 벡터 10 마이크로리터의 0.2 피코몰을 추가하고, 각 분리된 앰플리콘에 DNA 어셈블리 마스터 믹스10마이크로리터를 첨가한다. 샘플을 섭씨 50도에서 1시간 동안 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 표준 프로토콜에 따라 조립 된 제품의 두 마이크로 리터와 화학적으로 유능한 대장균을 변환합니다.암피실린 밀리리터당 100 마이크로그램으로 보충된 LB 아가로즈 플레이트에 변형된 세포의 100마이크로리터를 플레이트. 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 잠복한 후, 루리아 국물에 접종을 위해 잘 고립된 식민지를 선택하여 밤새 37도에서 암피실린 밀리리터당 100 마이크로그램과 분당 225개의 회전을 보충합니다. 다음 아침, 플라스미드 미니프렙 키트를 사용하여 플라스미드를 분리합니다.그리고 분광계에서 DNA의 농도와 순도를 확인한다. 재조합 바이러스 생성의 경우, 6웰 플레이트에서 하나의 감염의 복합성에서 재결합할 바이러스와 적합한 세포의 컨런트 단층을 감염시. 그리고 감염된 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 1시간 동안 배양합니다.인큐베이션이 끝나면 각 우물의 상체를 신선한 DMEM으로 교체하고 제조업체의 프로토콜에 따라 시판되는 트랜스퍼션 시약을 사용하십시오. 각 웰에 관심의 재조합 벡터의 세 마이크로그램을 추가합니다. 접시를 인큐베이터에 추가로 48시간 동안 배치합니다.각 형질 전환 조건에서 개별 1.5 밀리리터 튜브로 세포를 풀링하기 전에. 그런 다음 풀링된 세포를 세 번 동결한 후 50%진폭에서 15초 동안 생성된 용액을 초음파 처리합니다. 다음으로, 10배 연속적으로 10배의 초음파 처리된 용액을 희석시키고, 10에서 10에서 6번째 농도로 신선한 DMEM으로 수확하고 단백질 키나아제 R 유능한 세포주의 개별 응수 웰에 각 희석의 1밀리리터를 첨가한다.세포 배양 인큐베이터에 세포를 1시간 동안 배치한 후 초자연체를 신선한 배지로 대체하고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 되돌린다. 24~48시간 후, 형광 현미경검사법에 의한 재조합 바이러스를 식별한다. 재조합 바이러스로부터의 플라크는 mCherry-E3L 융합 유전자의 통합으로 인해 적색 형광을 발현한다.플라크는 야생 형 RK13 세포에 재조합 바이러스를 세 번 정화합니다. 3라운드의 플라크 정화 후, RK13+E3L+K3L 세포를 플라크 용하의 직렬 희석으로 감염시 보세요. 붕괴된 바이러스를 식별하기 위해 GFP 및 RFP 필터 큐브가 장착된 적절한 이미징 시스템을 사용하여 형광 현미경 검사법에 의해.그런 다음 플라크는 RK13+E3L+K3L 셀에서 녹색 전용 VC-R4 또는 무색 E3L 플라크를 세 번 정화합니다. 플라크가 빨간색으로 형광되지 않도록 합니다. 적어도 100 플라크 형성 단위로 세포를 감염하여 무색 플라크를 식별할 확률을 높입니다.드문 경우에, 감염의 다중 라운드가 필요할 수 있습니다. 단백질 키나아제 R 유능한 RK13 세포의 적색 형광 플라크는 mCherry-E3L의 바이러스 성 발현을 나타낸다. 그리고 RK13+E3L+K3L 셀에서 eGFP만 을 발현하는 무색 플라크 또는 플라크는 mCherry-E3L 선택 마커의 붕괴를 확인한다.단백질 키나아제 R 길항제가 모두 결여된 재조합 바이러스 VC-R4는 단백질 키나아제 R 유능한 RK13 세포에서 복제할 수 없으며, E3L을 표현하는 명백한 바이러스 VP872는 복제능력이 있다. RK13 세포에서 복제할 수 없는 이 무능력이 E3L의 손실 때문이었는것을 확인하기 위해, 향상된 GFP는 VC-R4 바이러스에서 E3L로 대체되었다. 동일한 선택 프로토콜을 사용하여 관련 바이러스를 생성했습니다.흥미롭게도, 이 바이러스를 만드는 동안, mCherry-E3L 선택 마커의 붕괴와 일치하는 무색 플라크는 일반적으로 흉터 재조합제를 선택하는 데 필요한 RK13+E3L+K3L 셀에서 선택하기 전에 확인되었다. mCherry-E3L 재조합 카세트와 VC-R4로 삽입되는 E3L 유전자 사이의 확장된 서열 정체성 때문일 가능성이 있다. 평균 12.6%의 자손 처녀가 이전에 보고된 주파수와 유사한 전감염된 플라스미드와 재조합을 겪었습니다.여기서, 총 플라크RK13+E3L+K3L 셀에 비해 무색 플라크의 빈도가 표시되어, mCherry-E3L 선택 마커의 붕괴 속도와 손실이 약 1.8%의 주파수에서 발생하였다. PKR 유능한 세포를 사용하여 첫 번째 단계에서 포함 된 재조합 바이러스를 가진 모든 플라크를 보장합니다. PKR 결핍 세포를 이용한 제2단계에서는 붕괴mCherry-E3L 궤적을 이용한 재조합 바이러스의 검출을 가능하게 한다.이러한 접근법을 통해 외인성 유전자를 함유한 바이러스를 신속하게 생성할 수 있으며, 예를 들어 백신 생산이 상이한 바이러스 PKR 길항제의 발현을 제공한다. 다양한 호스트로부터 PKR과의 종별 상호 작용의 분석을 용이하게한다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 생성

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

연구

면역학 및 감염병학

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

에 관련된 호스트 요인에 대한 RNAi 심사 우두</em사용하기> 바이러스 감염 Drosophila 전지

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서</em의 신속한 감지를 위해> 하이브 리다이 제이션 살모넬라균 신선한 농산물에 대한

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

FDA 승인 베로 세포 백신 개발을위한 재조합 Arenavirus의 생성

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

파지 - 표시 합성 항체 라이브러리의 확장 성 높은 처리량 선택

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

정렬 된 불멸화 된 B 세포로부터 재조합 인간 IgG 단일 클론 항체의 생성

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

분석<em&gt; 예 르시 니아의 enterocolitica</em숙주 세포 내로&gt; 이펙터 전좌 베타 - 락타 마제 이펙터의 용해 사용

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomyces 발달 돌연변이의 영상 및 현미경 평가

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

셀룰러 및 Organismic 수준 호스트 응답 세균성 병원 체 프로브를 사용 하 여

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

생성, 증폭 및 재조합 호흡 Syncytial 바이러스의 적정

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...