Name: rapid, seamless generation of recombinant poxviruses using host range and visual selection
Uploaded: 2020-05-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection at JoVE.com

Dette prosjektet ble finansiert av National Institutes of Health (AI114851) til SR.

1. Generere rekombinasjonsvektoren
<ol><li>Design primere for å generere utvalgskassetten. Design hver enkelt amplicon med overlappende sekvenser med nærliggende amplicons og vektoren for å lette isothermal enzymatisk montering av DNA molekyler, også kalt Gibson montering, ved hjelp av noen av flere online primer design verktøy. MERK: Denne protokollen kan også fullføres ved hjelp av tradisjonelle begrensningendonukleasebaserte kloningsmetoder. I så fall designprimerer med de riktige begrensningsstedene i st...

<ol>
	<li>Brochier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+eradication+of+rabies+using+recombinant+vaccinia-rabies+vaccine.">Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine.</a> Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).</li><li>Pastoret, P. P., Brochier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+use+of+a+vaccinia-rabies+recombinant+oral+vaccine+for+the+control+of+wildlife+rabies;+a+link+between+Jenner+and+Pasteur.">The development and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur.</a> Epidemiology and Infection. 116 (3), 235-240 (1996).</li><li>Chan, W. M., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+Poxviruses.">Oncolytic Poxviruses.</a> Annual review of virology. 1 (1), 119-141 (2014).</li><li>Nguyen, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus-mediated+expression+of+human+erythropoietin+in+tumors+enhances+virotherapy+and+alleviates+cancer-related+anemia+in+mice.">Vaccinia virus-mediated expression of human erythropoietin in tumors enhances virotherapy and alleviates cancer-related anemia in mice.</a> Molecular Therapy. 21 (11), 2054-2062 (2013).</li><li>Frentzen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-VEGF+single-chain+antibody+GLAF-1+encoded+by+oncolytic+vaccinia+virus+significantly+enhances+antitumor+therapy.">Anti-VEGF single-chain antibody GLAF-1 encoded by oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12915-12920 (2009).</li><li>Pastoret, P. P., Vanderplasschen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxviruses+as+vaccine+vectors.">Poxviruses as vaccine vectors.</a> Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 26 (5-6), 343-355 (2003).</li><li>COLLIER, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+a+stable+smallpox+vaccine.">The development of a stable smallpox vaccine.</a> The Journal of Hygiene. 53 (1), 76-101 (1955).</li><li>Weir, J. P., Bajsz&#225;r, G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+the+vaccinia+virus+thymidine+kinase+gene+by+marker+rescue+and+by+cell-free+translation+of+selected+mRNA.">Mapping of the vaccinia virus thymidine kinase gene by marker rescue and by cell-free translation of selected mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (4), 1210-1214 (1982).</li><li>Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus:+a+selectable+eukaryotic+cloning+and+expression+vector.">Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (23), 7415-7419 (1982).</li><li>Nakano, E., Panicali, D., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+vaccinia+virus:+demonstration+of+marker+rescue.">Molecular genetics of vaccinia virus: demonstration of marker rescue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (5), 1593-1596 (1982).</li><li>Falkner, F. G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dominant+selection+of+recombinant+vaccinia+viruses.">Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses.</a> Journal of Virology. 64 (6), 3108-3111 (1990).</li><li>Staib, C., Drexler, I., Ohlmann, M., Wintersperger, S., Erfle, V., Sutter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Host+Range+Selection+for+Genetic+Engineering+of+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara.">Transient Host Range Selection for Genetic Engineering of Modified Vaccinia Virus Ankara.</a> BioTechniques. 28 (6), 1137-1148 (2000).</li><li>Staib, C., Drexler, I., Sutter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+Isolation+of+Recombinant+MVA.">Construction and Isolation of Recombinant MVA.</a> Vaccinia Virus and Poxvirology. , 77-99 (2004).</li><li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marker+gene+swapping+facilitates+recombinant+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara+production+by+host-range+selection.">Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection.</a> Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).</li><li>Pfaller, C. K., Li, Z., George, C. X., Samuel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+PKR+and+RNA+adenosine+deaminase+ADAR1:+New+roles+for+old+players+as+modulators+of+the+interferon+response.">Protein kinase PKR and RNA adenosine deaminase ADAR1: New roles for old players as modulators of the interferon response.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (5), 573-582 (2011).</li><li>Bevilacqua, P. C., George, C. X., Samuel, C. E., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+the+protein+kinase+PKR+to+RNAs+with+secondary+structure+defects:+Role+of+the+tandem+A+-+G+mismatch+and+noncontigous+helixes.">Binding of the protein kinase PKR to RNAs with secondary structure defects: Role of the tandem A - G mismatch and noncontigous helixes.</a> Biochemistry. 37 (18), 6303-6316 (1998).</li><li>Krishnamoorthy, T., Pavitt, G. D., Zhang, F., Dever, T. E., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+Binding+of+the+Phosphorylated+Subunit+of+Initiation+Factor+2+(eIF2)+to+the+Regulatory+Subunits+of+Guanine+Nucleotide+Exchange+Factor+eIF2B+Is+Required+for+Inhibition+of+Translation+Initiation.">Tight Binding of the Phosphorylated Subunit of Initiation Factor 2 (eIF2) to the Regulatory Subunits of Guanine Nucleotide Exchange Factor eIF2B Is Required for Inhibition of Translation Initiation.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (15), 5018-5030 (2001).</li><li>Rothenburg, S., Georgiadis, M. M., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+eIF2&#945;+kinases:+Adapting+translational+control+to+diverse+stresses.">Evolution of eIF2&#945; kinases: Adapting translational control to diverse stresses.</a> Evolution of the Protein Synthesis Machinery and Its Regulation. , 235-260 (2016).</li><li>Bratke, K. A., McLysaght, A., Rothenburg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+host+range+genes+in+poxvirus+genomes.">A survey of host range genes in poxvirus genomes.</a> Infection, Genetics and Evolution. 14, 406-425 (2013).</li><li>Chang, H. W., Watson, J. C., Jacobs, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E3L+gene+of+vaccinia+virus+encodes+an+inhibitor+of+the+interferon-induced,+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase.">The E3L gene of vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (11), 4825-4829 (1992).</li><li>Romano, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+PKR+by+vaccinia+virus+E3:+role+of+complex+formation+and+the+E3+N-terminal+domain.">Inhibition of double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR by vaccinia virus E3: role of complex formation and the E3 N-terminal domain.</a> Molecular and Cellular Biology. 18 (12), 7304-7316 (1998).</li><li>Beattie, E., Tartaglia, J., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus-encoded+eIF-2+alpha+homolog+abrogates+the+antiviral+effect+of+interferon.">Vaccinia virus-encoded eIF-2 alpha homolog abrogates the antiviral effect of interferon.</a> Virology. 183 (1), 419-422 (1991).</li><li>Park, C., Peng, C., Brennan, G., Rothenburg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+inhibition+of+antiviral+protein+kinase+R+by+capripoxviruses+and+vaccinia+virus.">Species-specific inhibition of antiviral protein kinase R by capripoxviruses and vaccinia virus.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1438 (1), 18-29 (2019).</li><li>Rothenburg, S., Brennan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-Specific+Host-Virus+Interactions:+Implications+for+Viral+Host+Range+and+Virulence.">Species-Specific Host-Virus Interactions: Implications for Viral Host Range and Virulence.</a> Trends in Microbiology. , (2019).</li><li>Chakrabarti, S., Sisler, J. R., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compact,+synthetic,+vaccinia+virus+early/late+promoter+for+protein+expression.">Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression.</a> BioTechniques. 23 (6), 1094-1097 (1997).</li><li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli:+Transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution+(recombinant+DNA).">One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution (recombinant DNA).</a> Biochemistry. 86, 2172-2175 (1989).</li><li>Chung, C. T., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+storage+of+competent+Escherichia+coli+cells.">Preparation and storage of competent Escherichia coli cells.</a> Methods in Enzymology. 218, 621-627 (1993).</li><li>Rahman, M. M., Liu, J., Chan, W. M., Rothenburg, S., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myxoma+Virus+Protein+M029+Is+a+Dual+Function+Immunomodulator+that+Inhibits+PKR+and+Also+Conscripts+RHA/DHX9+to+Promote+Expanded+Host+Tropism+and+Viral+Replication.">Myxoma Virus Protein M029 Is a Dual Function Immunomodulator that Inhibits PKR and Also Conscripts RHA/DHX9 to Promote Expanded Host Tropism and Viral Replication.</a> PLOS Pathogens. 9 (7), 1003465 (2013).</li><li>Evans, D. H., Stuart, D., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+genetic+recombination+among+cotransfected+plasmid+DNAs+in+poxvirus-infected+mammalian+cells.">High levels of genetic recombination among cotransfected plasmid DNAs in poxvirus-infected mammalian cells.</a> Journal of Virology. 62 (2), 367-375 (1988).</li><li>Ball, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+homologous+recombination+in+vaccinia+virus+DNA.">High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA.</a> Journal of Virology. 61 (6), 1788-1795 (1987).</li><li>Spyropoulos, D. D., Roberts, B. E., Panicali, D. L., Cohen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineation+of+the+viral+products+of+recombination+in+vaccinia+virus-infected+cells.">Delineation of the viral products of recombination in vaccinia virus-infected cells.</a> Journal of Virology. 62 (3), 1046-1054 (1988).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dominant+host-range+selection+using+Chinese+hamster+ovary+cells+to+generate+marker-free+recombinant+viral+vectors+from+vaccinia+virus.">Transient dominant host-range selection using Chinese hamster ovary cells to generate marker-free recombinant viral vectors from vaccinia virus.</a> BioTechniques. 62 (4), 183-187 (2017).</li></ol>

Her presenterer vi en variant av en forbigående markør valgstrategi 32 for å generere rekombinant vaccinia virus uten å beholde utenlandsk DNA i det endelige rekombinantviruset. Vår strategi bruker selektivt trykk mediert av verten antiviralprotein PKR i stedet for andre former for selektivt trykk som antibiotika. Bruken av vertsantivirale gener eliminerer muligheten for kjemisk induserte fenotypic endringer i cellene, eller økt risiko for mutasjon på grunn av utvalgnarkotika. Videre, i mot...

Vaccinia virus (VACV) var medvirkende for den første vellykkede utryddelse av et humant patogen, variola virus (VARV), fra naturen. Helt siden utryddelsen av variolavirus har poxvirus inkludert VACV fortsatt å være nyttige terapeutiske virus for både menneskelig og animalsk medisin. For eksempel har en VACV-basert rabiesvirusvaksine vært svært effektiv i å forhindre overføring av sylvatiske rabies i Europa1 og USA2. Mer nylig, rekombinant poxviruses uttrykker en rekke anti-tumor molekyler (f.eks en-kjede antistoffer eller menneskelig erytropoietin) har sett oppmuntrende suksess som onkolytiske midler3,4,5. VACV er spesielt attraktiv som vektor fordi det er lett mottagelig for genetisk manipulasjon, har et bredt vertsområde, og det er stabilt under en rekke forhold, slik at enkel transport og vaksine levedyktighet i feltet6,7. Mens flere teknikker er utviklet for å generere rekombinant VACV for laboratorieeksperimenter og vaksinegenerering, har dagens strategier for å generere disse virusene bemerkelsesverdige begrensninger.
På grunn av nytten av VACV, flere strategier for å generere rekombinant virus har blitt utviklet. Den første strategien benytter homolog rekombinasjon for å introdusere en kassett, inkludert transgene og et valgbart markørgen som et antibiotikaresistensgen. Kassetten er flankert av to ~ 500 nukleotider (nt) eller større armer som dirigerer genet til et bestemt sted i det virale genomet, som deretter stabilt integrert av doble crossover hendelser8,9,10. Denne strategien er rask og effektiv; Det resulterer imidlertid i ekstra genetisk materiale i form av markørgenet som kan gi uventede effekter. Videre er det en praktisk øvre grense for antall transgener som kan innføres begrenset av antall unike valgbare markører tilgjengelig. Forbigående dominerende utvalg (TDS) strategier har adressert dette problemet ved å legge til rette for generering av "knappe" rekombinant virus11. Ved hjelp av denne strategien er en plasmid som inneholder et mutert VACV-gen og et valgbart markørgen integrert i det virale genomet, men uten ytterligere flankering av VACV DNA. Denne tilnærmingen resulterer i forbigående integrering av hele plasmid og duplisering av VACV genet som følge av integrering av en enkelt crossover hendelse. Dette mellomspillet er stabilt så lenge det opprettholdes under utvalgstrykk, noe som tillater berikelse av denne konstruksjonen. Når valget fjernes, muliggjør VACV duplisering en andre crossover-hendelse som resulterer i fjerning av plasmid og påfølgende dannelse av enten vill type (wt) eller rekombinant virus i et omtrentlig 50:50-forhold. Mens TDS genererer rekombinant virus uten å kreve stabil innføring av utenlandsk DNA, flere viruskloner må screenes for den forventede mutasjonen ved sekvensering analyse, en potensielt tidkrevende og kostbart skritt.
Her presenterer vi en tilnærming til å generere rekombinant poxvirus som kombinerer de beste aspektene ved hver av disse tilnærmingene, lik en tilnærming som er beskrevet for replikering inkompetentmodifisert vaccinia Ankara12,13,14. Denne strategien kombinerer visuelt og vertsutvalgsvalg for raskt å generere rekombinantvirus ved doble crossover-hendelser, og deretter eliminere det valgbare markørgenet ved homolog rekombinasjon. Denne tilnærmingen tillater den raske generasjonen mutanter mediert av homolog rekombinasjon, med den "knappe" naturen til TDS tilnærminger, samtidig som det ikke krever et påfølgende screeningtrinn for å skille vill type og mutant virus. Vår metode bruker også vertsområdevalg i stedet for antibiotikavalg, og eliminerer risikoen for kjemisk induserte fenotypiske endringer i cellelinjen. For denne tilnærmingen har vi valgt å bruke verten antiviral protein kinase R (PKR) som selektiv middel for å generere rekombinant VACV. PKR uttrykkes som en inaktiv monomer i de fleste celletyper15. Ved binding av dobbeltstrandede RNA (dsRNA) ved N-terminal dsRNA-bindende domener, dimmer PKR og er autofosforylert16. Denne aktive formen for PKR fosforlater alfa-underenheten av eukaryyotisk initieringsfaktor 2 (eIF2), til slutt hemme levering av initiator methionyl-tRNA til ribosom, og dermed hindre intracellulær oversettelse og bredt hemme replikering av mange virus familier17,18.
Som svar på den brede og potente antivirale aktiviteten til PKR, har mange virus utviklet seg minst én strategi for å forhindre PKR-aktivering. De fleste poxviruses uttrykke to PKR antagonister, kodet av E3L og K3L gener i VACV, som antagoniserer PKR gjennom to forskjellige mekanismer19. E3 forhindrer PKR homodimerization ved å binde dobbeltstrandede RNA20,21, mens K3 fungerer som pseudosubsstrathemmer ved å binde direkte til aktivert PKR og dermed hemme interaksjon med substratet eIF2α22. Viktigere, disse to PKR antagonister ikke nødvendigvis hemme PKR fra alle arter. For eksempel, K3 homolog fra sheeppox viruset sterkt hemmet PKR fra sauer, mens sheeppox E3 homolog viste ikke betydelig PKR hemming23,24. I denne studien presenterer vi en metode for å bruke PKR-mediert selektivt trykk kombinert med fluorescensvalg for å generere en VACV rekombinant slettet for E3L og K3L (VC-R4), som ikke kan replikere i PKR kompetente celler avledet fra ulike arter. Dette rekombinantviruset gir en utmerket bakgrunn for rask generering av rekombinantvirus som uttrykker gener under kontroll av den innfødte E3L-arrangøren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2X-Q5 Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492L</td>
			<td>High-fidelity polymerase used in PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11593027</td>
			<td>Bacterial selective agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cell Scrapers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>08-100-242</td>
			<td>Cell scraper to harvest infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto 2 Cell imaging system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMAFD2000</td>
			<td>Fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube, GFP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AMEP4651</td>
			<td>GFP Cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube, RFP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AMEP4652</td>
			<td>RFP Cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenJet</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100489</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) Broth</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10855021</td>
			<td>Bacterial growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch DNA gel extraction kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1020L</td>
			<td>Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch Plasmid Miniprep kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1010L</td>
			<td>Miniprep kit ussed to purify plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q500 Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q500-110</td>
			<td>Sonicator for virus lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RK13 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-37</td>
			<td>Rabbit kidney cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Multiwell Cell Culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>Cell culture plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, seamless generation of recombinant poxviruses using host range and visual selection

Vaccinia virus (VACV) var medvirkende til å utrydde variola virus (VARV), årsaksmiddel av kopper, fra naturen. Siden første gangs bruk som vaksine har VACV blitt utviklet som vektor for terapeutiske vaksiner og som et onkolytisk virus. Disse programmene drar nytte av VACVs lett manipulerte genom og brede vertsområde som en enestående plattform for å generere rekombinantvirus med en rekke terapeutiske applikasjoner. Flere metoder er utviklet for å generere rekombinant VACV, inkludert markørvalgmetoder og forbigående dominerende utvalg. Her presenterer vi en forbedring av en vertsområdevalgmetode kombinert med visuell identifisering av rekombinantvirus. Vår metode utnytter selektivt trykk generert av verten antiviral protein kinase R (PKR) kombinert med en fluorescerende fusjon gen uttrykker mCherry-merket E3L, en av to VACV PKR antagonister. Kassetten, inkludert genet av interesse og mCherry-E3L fusjon er flankert av sekvenser avledet fra VACV genom. Mellom genet av interesse og mCherry-E3L er en mindre region som er identisk med de første ~ 150 nukleotider av 3 'arm, for å fremme homolog rekombinasjon og tap av mCherry-E3L genet etter valg. Vi viser at denne metoden tillater effektiv, sømløs generering av rVACV i en rekke celletyper uten å kreve legemiddelvalg eller omfattende screening for muterte virus.

Vi brukte prosedyren som er diagramt i figur 1 til å generere en VACV som mangler både PKR-antagonister E3L og K3L, ved å erstatte E3L med EGFP i et virus som allerede er slettet for K3L (vP872). Figur 2 viser røde fluorescerende plakk i PKR kompetente RK13-celler som indikerer viral uttrykk for mCherry-E3L, samt EGFP uttrykt i RK13+E3L+K3L-celler som bekrefter tapet av E3L og sammenbruddet av mCherry-E3L-markeringsmarkøren. Figur 3</st...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection at JoVE.com

Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

Dette er en metode for å generere "arrløse" rekombinant vaccinia virus ved hjelp av vertsområde valg og visuell identifikasjon av rekombinant virus.

Rask, sømløs generering av rekombinante poxvirus ved hjelp av vertsområde og visuelt utvalg

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a ...

Vår metode bruker utvalg av vertsserier og fluorescerende markører for effektiv og sømløs generering av rekombinant vaccina-virus i en rekke celletyper. Denne teknikken kombinerer hastigheten på homolog rekombinasjon med den arrfrie naturen til forbigående dominerende utvalg. I tillegg er vi vert for utvalgsvalg for å eliminere muligheten for kjemisk induserte endringer.Denne metoden kan også brukes til å modifisere vaccinia virus eller andre poxvirus for å uttrykke fremmede gener, for eksempel for å generere vaksiner. Hvis du bare utfører denne protokollen med fluorescensvalg, må du sørge for at du screener nok virus til å oppdage en relativt sjelden rekombinant uten PKR selektivt trykk. Denne metoden er avhengig av for gevinst og tap av fluorescerende markører for å kunne velge virus som har fått rekombinasjonskassetter og for å oppdage virus som har scarless recombined.For å generere en rekombinasjonsvektor, legg først til 17 mikroliter DNase fritt vann, 1,2 mikroliter av hver primer, fem mikroliter 5x PCR reaksjonsbuffer, mal-DNA og 0,5 mikroliter DNA-polymerase til ett PCR-rør per amplicon. Tilsett ekstra DNase gratis vann for å bringe det endelige volumet i hvert rør til 50 mikroliter. Og plasser rørene i en termocycler.Smelt DNA ved 98 grader Celsius i 30 sekunder før du bruker 25 runder av en tre-trinns PCR-protokoll som angitt. For å visualisere forsterkningsproduktene på en 1% agarose gel, tilsett 10 mikroliter av hvert DNA-produkt og 2 mikroliter lastebuffer til hver brønn. Kjør gelen i en time på åtte volt per centimeter.På slutten av løpet, bruk et DNA gel ekstraksjonssett i henhold til produsentens protokoll for å gel rense hver amplicon. Elute amplicons fra kolonnen med 50 mikroliter dnase fritt vann og umiddelbar sentrifugering. For å linearisere en kloningsvektor, legg først til ett mikrogram av vektoren, 17 mikroliter DNase fritt vann, 2 mikroliter reaksjonsbuffer og 1 mikroliter EcoRI til et rør i en time inkubasjon ved 37 grader Celsius.På slutten av inkubasjonen legger du til 0,2 picomoles av den lineariserte vektoren 10 mikroliter dnasefritt vann og 10 mikroliter DNA-monteringsmasterblanding til hver isolerte amplikon. Inkuber prøver ved 50 grader Celsius i en time. På slutten av inkubasjonen, forvandle kjemisk kompetent E.coli med to mikroliter av det monterte produktet i henhold til standardprotokoller.Plate 100 mikroliter av forvandlede celler på LB agarose plater supplert med 100 mikrogram per milliliter ampicillin. Etter overnatting inkubasjon ved 37 grader Celsius, velg godt isolerte kolonier for inokulasjon i Luria kjøttkraft supplert med 100 mikrogram per milliliter ampicillin over natten ved 37 grader Celsius og 225 omdreininger per minutt. Neste morgen, bruk en plasmid miniprep kit for å isolere plasmids.Og sjekk konsentrasjonen og renheten av DNA på et spektrofotometer. For rekombinant virusgenerering, infisere et sammenføyd monolag av egnede celler med viruset som skal kombineres på en multiplisitet av infeksjon av en i en seks-brønns plate. Og inkuber de infiserte cellene ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i en time.På slutten av inkubasjonen erstatter du supernatanten i hver brønn med fersk DMEM og bruker en kommersielt tilgjengelig transfection reagens i henhold til produsentens protokoll. Legg til tre mikrogram av rekombinasjonsvektoren av interesse for hver brønn. Plasser platen i inkubatoren i ytterligere 48 timer.Før pooling cellene fra hver transfection tilstand i individuelle 1,5 milliliter rør. Deretter fryse-tine de samlede cellene tre ganger før sonikering de resulterende lysates i 15 sekunder ved en 50% amplitude. Deretter fortynner seriell 10 ganger det sonikerte lysatet, høstet fra en 10 til den første til 10 til sjette konsentrasjon i fersk DMEM og legger til en milliliter av hver fortynning til individuelle samtidige brønner av en protein kinase R kompetent cellelinje.Plasser cellene i cellekulturinkubatoren i en time før du erstatter supernativa med friskt medium og returnerer cellene til cellekulturinkubatoren. Etter 24 til 48 timer, identifiser rekombinantvirus ved fluorescensmikroskopi. Plakk fra rekombinante virus uttrykker rød fluorescens på grunn av integrering av mCherry-E3L fusjonsgenet.Plakk renser rekombinante virus tre ganger på vill type RK13 celler. Etter tre runder med plakkrensing infiserer du RK13+E3L+K3L-celler med seriefortynninger av plakklysatet. For å identifisere de skjulte virusene, ved fluorescensmikroskopi ved hjelp av et passende bildebehandlingssystem utstyrt med GFP- og RFP-filterkuber.Deretter renser plakk kun grønn VC-R4, eller fargeløse E3L-plakk tre ganger på RK13 +E3L+K3L-celler. Sikre at ingen plakk fluorescerer rødt. Infisere cellene med minst 100 plakkdannende enheter for å øke sjansene for å identifisere en fargeløs plakk.I sjeldne tilfeller kan det være nødvendig med flere runder med infeksjon. Røde fluorescerende plakk i protein kinase R kompetente RK13 celler er et tegn på viral uttrykk for mCherry-E3L. Og fargeløse plakk eller plakk som uttrykker bare eGFP i RK13 + E3L + K3L-celler bekrefter sammenbruddet av mCherry-E3L-utvalgsmarkøren.Det rekombinante viruset VC-R4, som mangler både protein kinase R antagonister kan ikke replikere i protein kinase R kompetente RK13 celler mens det tilsynelatende viruset VP872, som uttrykker E3L er replikering kompetent. For å bekrefte at denne manglende evne til å replikere i RK13-celler bare skyldtes tap av E3L, ble forbedret GFP erstattet med E3L i VC-R4-viruset. Det genererte et relevant virus ved hjelp av samme utvalgsprotokoll.Interessant, mens du gjør dette viruset, fargeløse plakk i samsvar med sammenbrudd av mCherry-E3L utvalg markør ble identifisert før valg i RK13 + E3L + K3L celler som vanligvis er nødvendig for å velge scarless rekombinanter. Sannsynligvis på grunn av den utvidede sekvensidentiteten mellom mCherry-E3L-rekombinasjonskassetten og E3L-genet som settes inn i VC-R4. I gjennomsnitt gjennomgikk 12,6% av avkom virioner rekombinasjon med transfiserte plasmid, tilsvarende tidligere rapporterte frekvenser.Her vises hyppigheten av fargeløse plakk i forhold til de totale plakkene RK13+E3L+K3L-celler, noe som viser at kollapshastigheten og tapet av mCherry-E3L-utvalgsmarkøren forekom med en ca. 1,8 %frekvens. I første fase ved hjelp av PKR sikrer kompetente celler at alle plakkene med inneholdt rekombinant virus. I den andre fasen ved hjelp av PKR mangelfulle celler muliggjør påvisning av rekombinant virus med en kollaps mCherry-E3L locus.Denne tilnærmingen tillater oss å raskt generere virus som inneholder eksogene gener, for eksempel for vaksineproduksjon tilbyr uttrykk for ulike virale PKR-antagonister. for å lette analysen av artsspesifikke interaksjoner med PKR fra ulike verter.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Generasjon av rekombinant arenavirus for Vaccine Development i FDA-godkjente Vero Cells

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

Skalerbar høy gjennomstrømning Utvalg fra fag-vises Syntetiske antistoffbiblioteker

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Generasjon av rekombinant humant IgG monoklonale antistoffer fra udødelig Ordnet B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analyse av<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector Translokasjon i vertsceller Bruke Beta-laktamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visuelle og mikroskopiske evaluering av Streptomyces utviklingsmessige mutanter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Bruke en bakteriell patogen Probe for mobilnettet og Organismic-nivå vert svar

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Generasjon, forsterkning og titrering rekombinant respiratorisk Syncytial virus

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...