Name: rapid, seamless generation of recombinant poxviruses using host range and visual selection
Uploaded: 2020-05-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection at JoVE.com

Este projeto foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (AI114851) à RS.

1. Gerar o vetor de recombinação
<ol><li>Projete primers para gerar o de seleção. Projete cada amplicon individual com seqüências sobrepostas com amplicons vizinhos e o vetor para facilitar a montagem enzimática isotérmica de moléculas de DNA, também chamada de montagem gibson, usando qualquer uma das várias ferramentas de design de primer on-line. NOTA: Este protocolo também pode ser concluído usando métodos tradicionais de clonagem baseadaem endonuclease. Nesse caso, os primers de design com os locai...

<ol>
	<li>Brochier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+eradication+of+rabies+using+recombinant+vaccinia-rabies+vaccine.">Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine.</a> Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).</li><li>Pastoret, P. P., Brochier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+use+of+a+vaccinia-rabies+recombinant+oral+vaccine+for+the+control+of+wildlife+rabies;+a+link+between+Jenner+and+Pasteur.">The development and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur.</a> Epidemiology and Infection. 116 (3), 235-240 (1996).</li><li>Chan, W. M., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+Poxviruses.">Oncolytic Poxviruses.</a> Annual review of virology. 1 (1), 119-141 (2014).</li><li>Nguyen, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus-mediated+expression+of+human+erythropoietin+in+tumors+enhances+virotherapy+and+alleviates+cancer-related+anemia+in+mice.">Vaccinia virus-mediated expression of human erythropoietin in tumors enhances virotherapy and alleviates cancer-related anemia in mice.</a> Molecular Therapy. 21 (11), 2054-2062 (2013).</li><li>Frentzen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-VEGF+single-chain+antibody+GLAF-1+encoded+by+oncolytic+vaccinia+virus+significantly+enhances+antitumor+therapy.">Anti-VEGF single-chain antibody GLAF-1 encoded by oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12915-12920 (2009).</li><li>Pastoret, P. P., Vanderplasschen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxviruses+as+vaccine+vectors.">Poxviruses as vaccine vectors.</a> Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 26 (5-6), 343-355 (2003).</li><li>COLLIER, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+a+stable+smallpox+vaccine.">The development of a stable smallpox vaccine.</a> The Journal of Hygiene. 53 (1), 76-101 (1955).</li><li>Weir, J. P., Bajsz&#225;r, G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+the+vaccinia+virus+thymidine+kinase+gene+by+marker+rescue+and+by+cell-free+translation+of+selected+mRNA.">Mapping of the vaccinia virus thymidine kinase gene by marker rescue and by cell-free translation of selected mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (4), 1210-1214 (1982).</li><li>Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus:+a+selectable+eukaryotic+cloning+and+expression+vector.">Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (23), 7415-7419 (1982).</li><li>Nakano, E., Panicali, D., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+vaccinia+virus:+demonstration+of+marker+rescue.">Molecular genetics of vaccinia virus: demonstration of marker rescue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (5), 1593-1596 (1982).</li><li>Falkner, F. G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dominant+selection+of+recombinant+vaccinia+viruses.">Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses.</a> Journal of Virology. 64 (6), 3108-3111 (1990).</li><li>Staib, C., Drexler, I., Ohlmann, M., Wintersperger, S., Erfle, V., Sutter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Host+Range+Selection+for+Genetic+Engineering+of+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara.">Transient Host Range Selection for Genetic Engineering of Modified Vaccinia Virus Ankara.</a> BioTechniques. 28 (6), 1137-1148 (2000).</li><li>Staib, C., Drexler, I., Sutter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+Isolation+of+Recombinant+MVA.">Construction and Isolation of Recombinant MVA.</a> Vaccinia Virus and Poxvirology. , 77-99 (2004).</li><li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marker+gene+swapping+facilitates+recombinant+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara+production+by+host-range+selection.">Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection.</a> Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).</li><li>Pfaller, C. K., Li, Z., George, C. X., Samuel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+PKR+and+RNA+adenosine+deaminase+ADAR1:+New+roles+for+old+players+as+modulators+of+the+interferon+response.">Protein kinase PKR and RNA adenosine deaminase ADAR1: New roles for old players as modulators of the interferon response.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (5), 573-582 (2011).</li><li>Bevilacqua, P. C., George, C. X., Samuel, C. E., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+the+protein+kinase+PKR+to+RNAs+with+secondary+structure+defects:+Role+of+the+tandem+A+-+G+mismatch+and+noncontigous+helixes.">Binding of the protein kinase PKR to RNAs with secondary structure defects: Role of the tandem A - G mismatch and noncontigous helixes.</a> Biochemistry. 37 (18), 6303-6316 (1998).</li><li>Krishnamoorthy, T., Pavitt, G. D., Zhang, F., Dever, T. E., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+Binding+of+the+Phosphorylated+Subunit+of+Initiation+Factor+2+(eIF2)+to+the+Regulatory+Subunits+of+Guanine+Nucleotide+Exchange+Factor+eIF2B+Is+Required+for+Inhibition+of+Translation+Initiation.">Tight Binding of the Phosphorylated Subunit of Initiation Factor 2 (eIF2) to the Regulatory Subunits of Guanine Nucleotide Exchange Factor eIF2B Is Required for Inhibition of Translation Initiation.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (15), 5018-5030 (2001).</li><li>Rothenburg, S., Georgiadis, M. M., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+eIF2&#945;+kinases:+Adapting+translational+control+to+diverse+stresses.">Evolution of eIF2&#945; kinases: Adapting translational control to diverse stresses.</a> Evolution of the Protein Synthesis Machinery and Its Regulation. , 235-260 (2016).</li><li>Bratke, K. A., McLysaght, A., Rothenburg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+host+range+genes+in+poxvirus+genomes.">A survey of host range genes in poxvirus genomes.</a> Infection, Genetics and Evolution. 14, 406-425 (2013).</li><li>Chang, H. W., Watson, J. C., Jacobs, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E3L+gene+of+vaccinia+virus+encodes+an+inhibitor+of+the+interferon-induced,+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase.">The E3L gene of vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (11), 4825-4829 (1992).</li><li>Romano, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+PKR+by+vaccinia+virus+E3:+role+of+complex+formation+and+the+E3+N-terminal+domain.">Inhibition of double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR by vaccinia virus E3: role of complex formation and the E3 N-terminal domain.</a> Molecular and Cellular Biology. 18 (12), 7304-7316 (1998).</li><li>Beattie, E., Tartaglia, J., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus-encoded+eIF-2+alpha+homolog+abrogates+the+antiviral+effect+of+interferon.">Vaccinia virus-encoded eIF-2 alpha homolog abrogates the antiviral effect of interferon.</a> Virology. 183 (1), 419-422 (1991).</li><li>Park, C., Peng, C., Brennan, G., Rothenburg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+inhibition+of+antiviral+protein+kinase+R+by+capripoxviruses+and+vaccinia+virus.">Species-specific inhibition of antiviral protein kinase R by capripoxviruses and vaccinia virus.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1438 (1), 18-29 (2019).</li><li>Rothenburg, S., Brennan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-Specific+Host-Virus+Interactions:+Implications+for+Viral+Host+Range+and+Virulence.">Species-Specific Host-Virus Interactions: Implications for Viral Host Range and Virulence.</a> Trends in Microbiology. , (2019).</li><li>Chakrabarti, S., Sisler, J. R., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compact,+synthetic,+vaccinia+virus+early/late+promoter+for+protein+expression.">Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression.</a> BioTechniques. 23 (6), 1094-1097 (1997).</li><li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli:+Transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution+(recombinant+DNA).">One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution (recombinant DNA).</a> Biochemistry. 86, 2172-2175 (1989).</li><li>Chung, C. T., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+storage+of+competent+Escherichia+coli+cells.">Preparation and storage of competent Escherichia coli cells.</a> Methods in Enzymology. 218, 621-627 (1993).</li><li>Rahman, M. M., Liu, J., Chan, W. M., Rothenburg, S., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myxoma+Virus+Protein+M029+Is+a+Dual+Function+Immunomodulator+that+Inhibits+PKR+and+Also+Conscripts+RHA/DHX9+to+Promote+Expanded+Host+Tropism+and+Viral+Replication.">Myxoma Virus Protein M029 Is a Dual Function Immunomodulator that Inhibits PKR and Also Conscripts RHA/DHX9 to Promote Expanded Host Tropism and Viral Replication.</a> PLOS Pathogens. 9 (7), 1003465 (2013).</li><li>Evans, D. H., Stuart, D., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+genetic+recombination+among+cotransfected+plasmid+DNAs+in+poxvirus-infected+mammalian+cells.">High levels of genetic recombination among cotransfected plasmid DNAs in poxvirus-infected mammalian cells.</a> Journal of Virology. 62 (2), 367-375 (1988).</li><li>Ball, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+homologous+recombination+in+vaccinia+virus+DNA.">High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA.</a> Journal of Virology. 61 (6), 1788-1795 (1987).</li><li>Spyropoulos, D. D., Roberts, B. E., Panicali, D. L., Cohen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineation+of+the+viral+products+of+recombination+in+vaccinia+virus-infected+cells.">Delineation of the viral products of recombination in vaccinia virus-infected cells.</a> Journal of Virology. 62 (3), 1046-1054 (1988).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dominant+host-range+selection+using+Chinese+hamster+ovary+cells+to+generate+marker-free+recombinant+viral+vectors+from+vaccinia+virus.">Transient dominant host-range selection using Chinese hamster ovary cells to generate marker-free recombinant viral vectors from vaccinia virus.</a> BioTechniques. 62 (4), 183-187 (2017).</li></ol>

Aqui apresentamos uma variação de uma estratégia transitória de seleção de marcadores 32 para gerar vírus de vaccinia recombinantes sem reter DNA estranho no vírus recombinante final. Nossa estratégia usa pressão seletiva mediada pelo PKR de proteína antiviral hospedeira em vez de outras formas de pressão seletiva, como antibióticos. O uso de genes antivirais hospedeiros elimina a possibilidade de alterações pheotípicas quimicamente induzidas nas células, ou aumento do risco de mu...

O vírus da vaccinia (VACV) foi fundamental para a primeira erradicação bem sucedida de um patógeno humano, o vírus variola (VARV), da natureza. Desde o extermínio do vírus variola, os vírus da varíola, incluindo o VACV, continuam a ser vírus terapêuticos úteis para a medicina humana e animal. Por exemplo, uma vacina contra o vírus da raiva baseada em VACV tem sido muito eficaz na prevenção da transmissão da raiva silvestre na Europa1 e nos Estados Unidos2. Mais recentemente, os vírus da varíola recombinantes que expressam uma variedade de moléculas antitumorais (por exemplo, anticorpos de cadeia única ou eritropoietina humana) têm visto sucesso encorajador como agentes oncolíticos3,4,5. O VACV é particularmente atraente como vetor porque é facilmente passível de manipulação genética, possui uma ampla gama de hospedeiros, e é estável sob uma variedade de condições, permitindo fácil transporte e viabilidade vacinal no campo6,7. Embora várias técnicas tenham sido desenvolvidas para gerar VACV recombinante para experimentos laboratoriais e geração de vacinas, as estratégias atuais para gerar esses vírus têm limitações notáveis.
Devido à utilidade do VACV, várias estratégias para gerar vírus recombinantes foram desenvolvidas. A primeira estratégia emprega recombinação homóloga para introduzir um incluindo o transgene e um gene marcador selecionável, como um gene de resistência a antibióticos. O é ladeado por dois ~500 nucleotídeos (nt) ou braços maiores direcionando o gene para um local específico no genoma viral, que é então integrado por eventos de crossover duplo8,9,10. Essa estratégia é rápida e eficiente; no entanto, resulta em material genético extra na forma do gene marcador que pode produzir efeitos inesperados. Além disso, há um limite superior prático para o número de transgenes que pode ser introduzido limitado pelo número de marcadores selecionáveis únicos disponíveis. As estratégias transitórias de seleção dominante (TDS) abordaram essa questão facilitando a geração de vírus recombinantes "sem carro"11. Usando essa estratégia, um plasmídeo contendo um gene VACV mutante e um gene marcador selecionável são integrados ao genoma viral, mas sem dna vacv adicional. Esta abordagem resulta na integração transitória de todo o plasmídeo e duplicação do gene VACV como resultado da integração por um único evento de crossover. Este intermediário é estável desde que seja mantido sob pressão de seleção, permitindo o enriquecimento deste construto. Quando a seleção é removida, a duplicação vacv permite um segundo evento de crossover que resulta na remoção do plasmídeo e posterior formação do tipo selvagem (wt) ou do vírus recombinante em uma razão aproximada de 50:50. Enquanto o TDS gera vírus recombinantes sem exigir a introdução estável de DNA estranho, vários clones de vírus devem ser rastreados para a mutação esperada por meio da análise de sequenciamento, um passo potencialmente demorado e caro.
Aqui, apresentamos uma abordagem para a geração de porcavírus recombinantes combinando os melhores aspectos de cada uma dessas abordagens, semelhante a uma abordagem que foi descrita para a replicação incompetente da vaccinia modificada Ancara12,,13,14. Essa estratégia combina a seleção visual e de alcance do host para gerar rapidamente vírus recombinantes por eventos de crossover duplo e, posteriormente, eliminar o gene marcador selecionável por recombinação homóloga. Esta abordagem permite a rápida geração de mutantes mediados pela recombinação homóloga, com a natureza "sem brilho" das abordagens TDS, ao mesmo tempo em que não requer um passo de triagem subsequente para distinguir vírus selvagens e mutantes. Nosso método também utiliza a seleção da faixa do hospedeiro no lugar da seleção de antibióticos, eliminando o risco de alterações pheotípicas quimicamente induzidas na linha celular. Para esta abordagem, optamos por usar o host antiviral protein kinase R (PKR) como agente seletivo para gerar VACV recombinante. PKR é expresso como um monômero inativo na maioria dos tipos de células15. Ao vincular o RNA de dupla revasão (dsRNA) nos domínios n-terminal de ligação de dsRNA, o PKR dimeriza e é autofosforilado16. Esta forma ativa de PKR fosforila a subunidade alfa do fator de iniciação eucariótica 2 (eIF2), inibindo, em última análise, a entrega do iniciador methionyl-tRNA ao ribossomos, impedindo assim a tradução intracelular e inibindo amplamente a replicação de muitas famílias de vírus17,18.
Em resposta à ampla e potente atividade antiviral do PKR, muitos vírus desenvolveram pelo menos uma estratégia para impedir a ativação do PKR. A maioria dos vírus da varíola expressa dois antagonistas PKR, codificados pelos genes E3L e K3L no VACV, que antagonizam o PKR através de dois mecanismos distintos19. O E3 previne a homodimerização do PKR vinculando o RNA de dupla recadenação20,21, enquanto o K3 atua como um inibidor pseudosubstrato, vinculando-se diretamente ao PKR ativado e, assim, inibindo a interação com o seu substrato eIF2α22. É importante ressaltar que esses dois antagonistas pkr não necessariamente inibem o PKR de todas as espécies. Por exemplo, o homolog K3 do vírus da ovelhapox inibiu fortemente o PKR das ovelhas, enquanto o homolog sheeppox E3 não mostrou uma inibição considerável de PKR23,24. Neste estudo, apresentamos um método para usar a pressão seletiva mediada por PKR combinada com a seleção de fluorescência para gerar um REcombinante VACV excluído para E3L e K3L (VC-R4), que não pode se replicar em células competentes pkr derivadas de espécies diversas. Este vírus recombinante fornece um excelente fundo para a geração rápida de vírus recombinantes que expressam genes sob controle do promotor Nativo E3L.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2X-Q5 Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492L</td>
			<td>High-fidelity polymerase used in PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11593027</td>
			<td>Bacterial selective agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cell Scrapers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>08-100-242</td>
			<td>Cell scraper to harvest infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto 2 Cell imaging system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMAFD2000</td>
			<td>Fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube, GFP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AMEP4651</td>
			<td>GFP Cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube, RFP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AMEP4652</td>
			<td>RFP Cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenJet</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100489</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) Broth</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10855021</td>
			<td>Bacterial growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch DNA gel extraction kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1020L</td>
			<td>Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch Plasmid Miniprep kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1010L</td>
			<td>Miniprep kit ussed to purify plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q500 Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q500-110</td>
			<td>Sonicator for virus lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RK13 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-37</td>
			<td>Rabbit kidney cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Multiwell Cell Culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>Cell culture plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, seamless generation of recombinant poxviruses using host range and visual selection

O vírus da vaccinia (VACV) foi fundamental na erradicação do vírus variola (VARV), o agente causador da varíola, da natureza. Desde sua primeira utilização como vacina, o VACV tem sido desenvolvido como vetor para vacinas terapêuticas e como um vírus oncolítico. Essas aplicações aproveitam o genoma facilmente manipulado do VACV e a ampla gama de hospedeiros como uma excelente plataforma para gerar vírus recombinantes com uma variedade de aplicações terapêuticas. Vários métodos foram desenvolvidos para gerar VACV recombinante, incluindo métodos de seleção de marcadores e seleção dominante transitória. Aqui, apresentamos um refinamento de um método de seleção de alcance de host, juntamente com a identificação visual de vírus recombinantes. Nosso método aproveita a pressão seletiva gerada pelo hospedeiro da proteína antiviral kinase R (PKR) juntamente com um gene de fusão fluorescente expressando mCherry-tagged E3L, um dos dois antagonistas VACV PKR. O, incluindo o gene de interesse e a fusão mCherry-E3L é ladeado por seqüências derivadas do genoma VACV. Entre o gene de interesse e mCherry-E3L é uma região menor que é idêntica aos primeiros ~150 nucleotídeos do braço de 3', para promover a recombinação homóloga e a perda do gene mCherry-E3L após a seleção. Demonstramos que este método permite uma geração eficiente e perfeita de rVACV em uma variedade de tipos de células sem exigir seleção de medicamentos ou triagem extensiva para vírus mutantes.

Utilizou-se o procedimento diagramado na Figura 1 para gerar um VACV sem antagonistas PKR E3L e K3L, substituindo E3L por EGFP em um vírus já excluído para K3L (vP872). A Figura 2 apresenta placas fluorescentes vermelhas em células RK13 competentes do PKR indicativas de expressão viral de mCherry-E3L, bem como EGFP expressas em células RK13+E3L+K3L confirmando a perda de E3L e o colapso do marcador de seleção mCherry-E3L. A Figura 3<...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection at JoVE.com

Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

Este é um método para gerar vírus de vaccinia recombinante "sem scarless" usando seleção de alcance de host e identificação visual de vírus recombinantes.

Geração rápida e perfeita de vírus de varíola recombinante usando faixa de host e seleção visual

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a ...

Nosso método usa seleção de intervalo de hospedeiro e marcadores fluorescentes para a geração eficiente e perfeita do vírus da vacina recombinante em uma variedade de tipos de células. Esta técnica combina a velocidade da recombinação homóloga com a natureza sem cicatrizes da seleção dominante transitória. Além disso, hospedamos a seleção de intervalo para eliminar a possibilidade de alterações quimicamente induzidas.Este método também pode ser usado para modificar o vírus da vaccinia ou outros vírus da varíola para expressar genes estrangeiros, por exemplo, para gerar vacinas. Se você está executando este protocolo apenas com seleção de fluorescência, você deve garantir que você está rastreando vírus suficientes para detectar um recombinante relativamente raro sem pressão seletiva PKR. Este método se baseia no ganho e perda de marcadores fluorescentes para selecionar com sucesso vírus que adquiriram as fitas de recombinação e para detectar vírus que têm recombinado sem cicatrizes.Para gerar um vetor de recombinação, adicione primeiro 17 microliters de água livre DNase, 1,2 microliters de cada primer, cinco microliters de 5x pcr tampão de reação, DNA de modelo e 0,5 microliters de polimerase de DNA a um tubo PCR por amplicon. Adicione água livre de DNase adicional para trazer o volume final em cada tubo para 50 microliters. E coloque os tubos em um termociclador.Derreta o DNA a 98 graus Celsius por 30 segundos antes de usar 25 cartuchos de um protocolo PCR de três etapas, conforme indicado. Para visualizar os produtos de amplificação em um gel de 1% de agarose, adicione 10 microlitros de cada produto de DNA e 2 microlitros de tampão de carga para cada poço. Execute o gel por uma hora a oito volts por centímetro.No final da corrida, use um kit de extração de gel de DNA de acordo com o protocolo do fabricante para purificar cada amplicon. Elute os amputados da coluna com 50 microliters de dNase água livre e centrifugação imediata. Para linearizar um vetor de clonagem, primeiro adicione um micrograma do vetor, 17 microliters de água livre de DNase, 2 microliters de tampão de reação e 1 microliter de EcoRI a um tubo para uma incubação de uma hora a 37 graus Celsius.Ao final da incubação, adicione 0,2 picomoles do vetor linearizado 10 microliters de água livre DNase, e 10 microliters de montagem de DNA misturam-se a cada amplicon isolado. Incubar amostras a 50 graus Celsius por uma hora. Ao final da incubação, transforme e.coli quimicamente competente com dois microliters do produto montado de acordo com os protocolos padrão.Placa 100 microliters de células transformadas em placas de agarose LB suplementadas com 100 microgramas por mililitro de ampicillina. Após a incubação durante a noite a 37 graus Celsius, selecione colônias bem isoladas para inoculação no caldo luria complementada com 100 microgramas por mililitro de ampicilina durante a noite a 37 graus Celsius e 225 revoluções por minuto. Na manhã seguinte, use um kit de miniprep plasmídeo para isolar os plasmídeos.E verifique a concentração e pureza do DNA em um espectotômetro. Para a geração de vírus recombinantes, infecte uma monocamada confluente de células adequadas com o vírus a ser recombinado em uma multiplicidade de infecção de um em uma placa de seis poços. E incubar as células infectadas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por uma hora.No final da incubação, substitua o supernaente em cada poço por DMEM fresco e use um reagente de transfecção comercialmente disponível de acordo com o protocolo do fabricante. Adicione três microgramas do vetor de recombinação de interesse a cada poço. Coloque a placa na incubadora por mais 48 horas.Antes de agrupar as células de cada condição de transfecção em tubos individuais de 1,5 mililitros. Em seguida, congele as células agrupadas três vezes antes de sonicar os lises resultantes por 15 segundos a uma amplitude de 50%. Em seguida, diluir em série 10 vezes o liseto sônico, colhido de um 10 para o primeiro ao 10 para o sexto concentração em DMEM fresco e adicionar um mililitro de cada diluição a poços confluentes individuais de uma linha celular competente proteína quinase R.Coloque as células na incubadora de cultura celular por uma hora antes de substituir os supernantes por meio fresco e devolver as células à incubadora de cultura celular. Após 24 a 48 horas, identifique os vírus recombinantes por microscopia de fluorescência. Placas de vírus recombinantes expressam fluorescência vermelha devido à integração do gene de fusão mCherry-E3L.A placa purifica os vírus recombinantes três vezes em células RK13 tipo selvagem. Após três rodadas de purificação da placa, infecte células RK13+E3L+K3L com diluições seriais do lysate da placa. Para identificar os vírus colapsados, por microscopia de fluorescência utilizando um sistema de imagem adequado equipado com cubos de filtro GFP e RFP.Em seguida, a placa purificar placas VC-R4 apenas verde ou incolor três vezes nas células RK13+E3L+K3L. Garantindo que não haja placas fluoresce vermelhas. Infecte as células com pelo menos 100 unidades formadoras de placas para aumentar suas chances de identificar uma placa incolor.Em casos raros, podem ser necessárias várias rodadas de infecção. Placas fluorescentes vermelhas em proteínas quinase R células RK13 competentes são indicativas de expressão viral de mCherry-E3L. E placas ou placas incolores expressando apenas eGFP em células RK13+E3L+K3L confirmam o colapso do marcador de seleção mCherry-E3L.O vírus recombinante VC-R4, que não possui ambos os antagonistas da proteína quinase R não podem se replicar em proteínas quinase R células RK13 competentes enquanto o vírus aparente VP872, que expressa E3L é competente para a replicação. Para confirmar que essa incapacidade de se replicar em células RK13 foi apenas devido à perda de E3L, o GFP aprimorado foi substituído por E3L no vírus VC-R4. Gerou um vírus relevante usando o mesmo protocolo de seleção.Curiosamente, ao fazer esse vírus, placas incolores consistentes com o colapso do marcador de seleção mCherry-E3L foram identificadas antes da seleção em células RK13+E3L+K3L que são geralmente necessárias para selecionar recombinantes sem cicatrizes. Provavelmente devido à sequência estendida entre o de recombinação mCherry-E3L e o gene E3L sendo inserido no VC-R4. Em média, 12,6% dos virions progêneres foram submetidos à recombinação com o plasmídeo transfectado, semelhante às frequências relatadas anteriormente.Aqui, mostra-se a frequência de placas incolores em relação às placas totais RK13+E3L+K3L, demonstrando que a taxa de colapso e a perda do marcador de seleção mCherry-E3L ocorreram em aproximadamente 1,8%. No primeiro estágio, o uso de células competentes PKR garante que todas as placas com vírus recombinante contido. No segundo estágio, o uso de células deficientes PKR permite a detecção de vírus recombinantes com um lócus de colapso mCherry-E3L.Essa abordagem nos permite gerar rapidamente vírus contendo genes exógenos, por exemplo, para a produção de vacinas oferecer a expressão de diferentes antagonistas virais do PKR. para facilitar a análise de interações específicas de espécies com PKR de vários hospedeiros.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Geração de recombinante do vírus Influenza de DNA plasmidial

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Imunologia e Infecção

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Triagem para Fatores Hospedeiros Envolvidos na Vaccinia Infecção pelo Vírus usando Drosophila Células

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combinação de adesivos de fita baseada em amostragem e de fluorescência In situ Hibridação para detecção rápida de Salmonella On Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Geração de Arenavirus recombinante de Desenvolvimento de Vacinas no FDA-approved células Vero

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

Selecção de alta Scalable Rendimento de bibliotecas de anticorpos em fagos sintética exibida-

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Geração de IgG Humana Recombinante de Anticorpos Monoclonais As células seleccionadas a partir de B imortalizadas

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Análises de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector translocação em células hospedeiras Usando Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Avaliação visual e microscópica de Streptomyces mutantes do desenvolvimento

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Usando um patógeno bacteriano para sonda para celular e organísmica-nível Host respostas

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Geração, amplificação e titulação do vírus sincicial respiratórios recombinantes

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...