Name: rapid, seamless generation of recombinant poxviruses using host range and visual selection
Uploaded: 2020-05-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection at JoVE.com

Этот проект был профинансирован Национальными институтами здравоохранения (AI114851) в СР.

1. Создание вектор рекомбинации
<ol><li>Дизайн грунтовки для создания выбора кассеты. Дизайн каждого отдельного амплекона с перекрывающимися последовательностями с соседними амплеонами и вектором для облегчения изетермальной ферментативной сборки молекул ДНК, также называемой гибсон ...

<ol>
	<li>Brochier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+eradication+of+rabies+using+recombinant+vaccinia-rabies+vaccine.">Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine.</a> Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).</li><li>Pastoret, P. P., Brochier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+use+of+a+vaccinia-rabies+recombinant+oral+vaccine+for+the+control+of+wildlife+rabies;+a+link+between+Jenner+and+Pasteur.">The development and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur.</a> Epidemiology and Infection. 116 (3), 235-240 (1996).</li><li>Chan, W. M., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+Poxviruses.">Oncolytic Poxviruses.</a> Annual review of virology. 1 (1), 119-141 (2014).</li><li>Nguyen, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus-mediated+expression+of+human+erythropoietin+in+tumors+enhances+virotherapy+and+alleviates+cancer-related+anemia+in+mice.">Vaccinia virus-mediated expression of human erythropoietin in tumors enhances virotherapy and alleviates cancer-related anemia in mice.</a> Molecular Therapy. 21 (11), 2054-2062 (2013).</li><li>Frentzen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-VEGF+single-chain+antibody+GLAF-1+encoded+by+oncolytic+vaccinia+virus+significantly+enhances+antitumor+therapy.">Anti-VEGF single-chain antibody GLAF-1 encoded by oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12915-12920 (2009).</li><li>Pastoret, P. P., Vanderplasschen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxviruses+as+vaccine+vectors.">Poxviruses as vaccine vectors.</a> Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 26 (5-6), 343-355 (2003).</li><li>COLLIER, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+a+stable+smallpox+vaccine.">The development of a stable smallpox vaccine.</a> The Journal of Hygiene. 53 (1), 76-101 (1955).</li><li>Weir, J. P., Bajsz&#225;r, G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+the+vaccinia+virus+thymidine+kinase+gene+by+marker+rescue+and+by+cell-free+translation+of+selected+mRNA.">Mapping of the vaccinia virus thymidine kinase gene by marker rescue and by cell-free translation of selected mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (4), 1210-1214 (1982).</li><li>Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus:+a+selectable+eukaryotic+cloning+and+expression+vector.">Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (23), 7415-7419 (1982).</li><li>Nakano, E., Panicali, D., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+vaccinia+virus:+demonstration+of+marker+rescue.">Molecular genetics of vaccinia virus: demonstration of marker rescue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (5), 1593-1596 (1982).</li><li>Falkner, F. G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dominant+selection+of+recombinant+vaccinia+viruses.">Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses.</a> Journal of Virology. 64 (6), 3108-3111 (1990).</li><li>Staib, C., Drexler, I., Ohlmann, M., Wintersperger, S., Erfle, V., Sutter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Host+Range+Selection+for+Genetic+Engineering+of+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara.">Transient Host Range Selection for Genetic Engineering of Modified Vaccinia Virus Ankara.</a> BioTechniques. 28 (6), 1137-1148 (2000).</li><li>Staib, C., Drexler, I., Sutter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+Isolation+of+Recombinant+MVA.">Construction and Isolation of Recombinant MVA.</a> Vaccinia Virus and Poxvirology. , 77-99 (2004).</li><li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marker+gene+swapping+facilitates+recombinant+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara+production+by+host-range+selection.">Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection.</a> Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).</li><li>Pfaller, C. K., Li, Z., George, C. X., Samuel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+PKR+and+RNA+adenosine+deaminase+ADAR1:+New+roles+for+old+players+as+modulators+of+the+interferon+response.">Protein kinase PKR and RNA adenosine deaminase ADAR1: New roles for old players as modulators of the interferon response.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (5), 573-582 (2011).</li><li>Bevilacqua, P. C., George, C. X., Samuel, C. E., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+the+protein+kinase+PKR+to+RNAs+with+secondary+structure+defects:+Role+of+the+tandem+A+-+G+mismatch+and+noncontigous+helixes.">Binding of the protein kinase PKR to RNAs with secondary structure defects: Role of the tandem A - G mismatch and noncontigous helixes.</a> Biochemistry. 37 (18), 6303-6316 (1998).</li><li>Krishnamoorthy, T., Pavitt, G. D., Zhang, F., Dever, T. E., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+Binding+of+the+Phosphorylated+Subunit+of+Initiation+Factor+2+(eIF2)+to+the+Regulatory+Subunits+of+Guanine+Nucleotide+Exchange+Factor+eIF2B+Is+Required+for+Inhibition+of+Translation+Initiation.">Tight Binding of the Phosphorylated Subunit of Initiation Factor 2 (eIF2) to the Regulatory Subunits of Guanine Nucleotide Exchange Factor eIF2B Is Required for Inhibition of Translation Initiation.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (15), 5018-5030 (2001).</li><li>Rothenburg, S., Georgiadis, M. M., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+eIF2&#945;+kinases:+Adapting+translational+control+to+diverse+stresses.">Evolution of eIF2&#945; kinases: Adapting translational control to diverse stresses.</a> Evolution of the Protein Synthesis Machinery and Its Regulation. , 235-260 (2016).</li><li>Bratke, K. A., McLysaght, A., Rothenburg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+host+range+genes+in+poxvirus+genomes.">A survey of host range genes in poxvirus genomes.</a> Infection, Genetics and Evolution. 14, 406-425 (2013).</li><li>Chang, H. W., Watson, J. C., Jacobs, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E3L+gene+of+vaccinia+virus+encodes+an+inhibitor+of+the+interferon-induced,+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase.">The E3L gene of vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (11), 4825-4829 (1992).</li><li>Romano, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+PKR+by+vaccinia+virus+E3:+role+of+complex+formation+and+the+E3+N-terminal+domain.">Inhibition of double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR by vaccinia virus E3: role of complex formation and the E3 N-terminal domain.</a> Molecular and Cellular Biology. 18 (12), 7304-7316 (1998).</li><li>Beattie, E., Tartaglia, J., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus-encoded+eIF-2+alpha+homolog+abrogates+the+antiviral+effect+of+interferon.">Vaccinia virus-encoded eIF-2 alpha homolog abrogates the antiviral effect of interferon.</a> Virology. 183 (1), 419-422 (1991).</li><li>Park, C., Peng, C., Brennan, G., Rothenburg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+inhibition+of+antiviral+protein+kinase+R+by+capripoxviruses+and+vaccinia+virus.">Species-specific inhibition of antiviral protein kinase R by capripoxviruses and vaccinia virus.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1438 (1), 18-29 (2019).</li><li>Rothenburg, S., Brennan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-Specific+Host-Virus+Interactions:+Implications+for+Viral+Host+Range+and+Virulence.">Species-Specific Host-Virus Interactions: Implications for Viral Host Range and Virulence.</a> Trends in Microbiology. , (2019).</li><li>Chakrabarti, S., Sisler, J. R., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compact,+synthetic,+vaccinia+virus+early/late+promoter+for+protein+expression.">Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression.</a> BioTechniques. 23 (6), 1094-1097 (1997).</li><li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli:+Transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution+(recombinant+DNA).">One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution (recombinant DNA).</a> Biochemistry. 86, 2172-2175 (1989).</li><li>Chung, C. T., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+storage+of+competent+Escherichia+coli+cells.">Preparation and storage of competent Escherichia coli cells.</a> Methods in Enzymology. 218, 621-627 (1993).</li><li>Rahman, M. M., Liu, J., Chan, W. M., Rothenburg, S., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myxoma+Virus+Protein+M029+Is+a+Dual+Function+Immunomodulator+that+Inhibits+PKR+and+Also+Conscripts+RHA/DHX9+to+Promote+Expanded+Host+Tropism+and+Viral+Replication.">Myxoma Virus Protein M029 Is a Dual Function Immunomodulator that Inhibits PKR and Also Conscripts RHA/DHX9 to Promote Expanded Host Tropism and Viral Replication.</a> PLOS Pathogens. 9 (7), 1003465 (2013).</li><li>Evans, D. H., Stuart, D., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+genetic+recombination+among+cotransfected+plasmid+DNAs+in+poxvirus-infected+mammalian+cells.">High levels of genetic recombination among cotransfected plasmid DNAs in poxvirus-infected mammalian cells.</a> Journal of Virology. 62 (2), 367-375 (1988).</li><li>Ball, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+homologous+recombination+in+vaccinia+virus+DNA.">High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA.</a> Journal of Virology. 61 (6), 1788-1795 (1987).</li><li>Spyropoulos, D. D., Roberts, B. E., Panicali, D. L., Cohen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineation+of+the+viral+products+of+recombination+in+vaccinia+virus-infected+cells.">Delineation of the viral products of recombination in vaccinia virus-infected cells.</a> Journal of Virology. 62 (3), 1046-1054 (1988).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dominant+host-range+selection+using+Chinese+hamster+ovary+cells+to+generate+marker-free+recombinant+viral+vectors+from+vaccinia+virus.">Transient dominant host-range selection using Chinese hamster ovary cells to generate marker-free recombinant viral vectors from vaccinia virus.</a> BioTechniques. 62 (4), 183-187 (2017).</li></ol>

Здесь мы представляем вариации переходного маркера стратегии выбора 32 для создания рекомбинантных вирусов vaccinia без сохранения чужеродных ДНК в окончательном рекомбинантный вирус. Наша стратегия использует селективное давление при посредничестве принимающей противови?...

Вирус Ваккиния (VACV) сыграл важную роль в первом успешном искоренении патогена человека, вируса вариолы (VARV), от природы. С момента уничтожения вируса вариолы, поксвирусы, включая VACV, продолжают быть полезными терапевтическими вирусами как для медицины человека, так и для животных. Например, вакцина против бешенства на основе VACV была очень эффективной в предотвращении передачи сильватического бешенства в Европе1 и Соединенных Штатах2. Совсем недавно, рекомбинантные поксвирусы, выражающие различные противоопухолевые молекулы (например, одноцепные антитела или человеческий эритропоэтин) видели обнадеживающий успех, как онколитические агенты3,4,5. VACV особенно привлекателен в качестве вектора, потому что он легко поддается генетическим манипуляциям, обладает широким диапазоном хостов, и он стабилен в различных условиях, что позволяет легко транспортировать и жизнеспособность вакцины в поле6,7. Хотя было разработано несколько методов для создания рекомбинантных VACV для лабораторных экспериментов и создания вакцин, нынешние стратегии создания этих вирусов имеют заметные ограничения.
Из-за полезности VACV, несколько стратегий для создания рекомбинантных вирусов были разработаны. Первая стратегия использует гомологию рекомбинации для введения кассеты, включая трансген и выбираемый ген маркера, такой как ген устойчивости к антибиотикам. Кассета окружена двумя нуклеотидами (nt) или более крупными руками, направляющими ген к определенному участку в вирусном геноме, который затем прочно интегрируется двойными событиями кроссовера8,,9,,10. Эта стратегия является быстрой и эффективной; однако, это приводит к дополнительному генетическому материалу в виде гена маркера, который может привести к неожиданным эффектам. Кроме того, существует практический верхний предел числа трансгенов, который может быть введен ограниченным числом уникальных доступных маркеров. Переходный доминирующий выбор (TDS) стратегии рассмотрели этот вопрос путем облегчения генерации "безшрамов" рекомбинантных вирусов11. Используя эту стратегию, плазмида, содержащая мутантный ген VACV и выбираемый ген маркера, интегрирована в вирусный геном, но без дополнительного флангового ДНК VACV. Такой подход приводит к переходной интеграции всей плазмиды и дублированию гена VACV в результате интеграции одним событием кроссовера. Этот промежуточный является стабильным до тех пор, пока он поддерживается под давлением отбора, что позволяет обогащать эту конструкцию. При удалении выбора дублирование VACV позволяет второе событие кроссовера, что приводит к удалению плазмиды и последующему образованию либо дикого типа (WT) или рекомбинантного вируса в приблизительном соотношении 50:50. В то время как TDS генерирует рекомбинантные вирусы, не требуя стабильного внедрения чужеродных ДНК, несколько клонов вирусов должны быть проверены на ожидаемую мутацию путем секвенирования анализа, потенциально отнимающего много времени и дорогостоящий шаг.
Здесь мы представляем подход к генерации рекомбинантных поксвирусов, сочетающих лучшие аспекты каждого из этих подходов, похожий на подход, который был описан для репликации некомпетентных модифицированных vaccinia Анкара12,13,14. Эта стратегия сочетает в себе визуальный выбор диапазона и диапазона хоста для быстрого генерации рекомбинантных вирусов путем двойного кроссовера событий, а затем устранить выбираемый ген маркера гомологической рекомбинации. Такой подход позволяет быстрое поколение мутантов, опосредованное гомологичным рекомбинацией, с "безшрамным" характером подходов TDS, не требуя при этом последующего этапа скрининга для различения вирусов дикого типа и мутантов. Наш метод также использует выбор диапазона хоста вместо выбора антибиотиков, устраняя риск химически индуцированных фенотипических изменений в клеточной линии. Для этого подхода мы решили использовать противовирусную протеину киназы R (PKR) в качестве селективного агента для создания рекомбинантного VACV. PKR выражается как неактивный мономер в большинстве типов клеток15. При связывании двухцепочечной РНК (dsRNA) в N-терминалd dsRNA-связывающих доменов, PKR димеризирует и аутофосфорилируется16. Эта активная форма PKR фосфорилаты альфа-субъединицу эукариотического фактора инициации 2 (eIF2), в конечном счете, препятствуя доставке инициатора метионил-ТРНА к рибосоме, тем самым предотвращая внутриклеточный перевод и широко препятствуя репликации многих вирусных семейст. 17,18.
В ответ на широкую и мощную противовирусную активность PKR, многие вирусы разработали по крайней мере одну стратегию для предотвращения активации PKR. Большинство поксвирусов выражают два антагониста PKR, кодируемого генами E3L и K3L в VACV, которые антагонизируют PKR через два различных механизма19. E3 предотвращает гомемеризацию PKR путем связывания двухцепочечной РНК20,21, в то время как K3 действует как ингибитор псевдосубстрата, связывая непосредственно с активированным PKR и тем самым препятствуя взаимодействию с его субстратом eIF2 '22. Важно отметить, что эти два антагонистов PKR не обязательно подавляют PKR от всех видов. Например, Гомолог K3 от вируса овцеводческой оспы сильно ингибирует PKR от овец, в то время как овчарка E3 омолог не показал значительного торможения PKR23,24. В этом исследовании мы представляем метод использования PKR-опосредованного селективного давления в сочетании с выбором флуоресценции для создания рекомбинантного VACV, удаленного для E3L и K3L (VC-R4), который не может реплицироваться в компетентных клетках PKR, полученных из различных видов. Этот рекомбинантный вирус обеспечивает отличный фон для быстрого поколения рекомбинантных вирусов, выражающих гены под контролем родного E3L-промоутера.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2X-Q5 Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492L</td>
			<td>High-fidelity polymerase used in PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11593027</td>
			<td>Bacterial selective agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cell Scrapers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>08-100-242</td>
			<td>Cell scraper to harvest infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto 2 Cell imaging system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMAFD2000</td>
			<td>Fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube, GFP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AMEP4651</td>
			<td>GFP Cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube, RFP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AMEP4652</td>
			<td>RFP Cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenJet</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100489</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) Broth</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10855021</td>
			<td>Bacterial growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch DNA gel extraction kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1020L</td>
			<td>Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch Plasmid Miniprep kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1010L</td>
			<td>Miniprep kit ussed to purify plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q500 Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q500-110</td>
			<td>Sonicator for virus lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RK13 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-37</td>
			<td>Rabbit kidney cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Multiwell Cell Culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>Cell culture plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, seamless generation of recombinant poxviruses using host range and visual selection

Вирус Вакцинии (VACV) сыграл важную роль в искоренении вируса вариолы (VARV), возбудителя оспы, от природы. С момента своего первого использования в качестве вакцины, VACV был разработан в качестве переносчика терапевтических вакцин и в качестве онколитического вируса. Эти приложения используют легко управляемый геном VACV и широкий диапазон хост в качестве выдающейся платформы для создания рекомбинантных вирусов с различными терапевтическими приложениями. Для создания рекомбинантного VACV было разработано несколько методов, включая методы выбора маркеров и переходный доминирующий выбор. Здесь мы представляем уточнение метода выбора диапазона хоста в сочетании с визуальной идентификацией рекомбинантных вирусов. Наш метод использует селективное давление, генерируемое принимающей противовирусной протеиной киназы R (PKR) в сочетании с флуоресцентным геном синтеза, выражающим mCherry-tagged E3L, один из двух антагонистов VACV PKR. Кассета, включая интересуемый ген и слияние mCherry-E3L, окружена последовательностями, полученными из генома VACV. Между геном интереса и mCherry-E3L находится меньшая область, идентичная первым нуклеотидам 3' руки, чтобы способствовать гомологионной рекомбинации и потере гена mCherry-E3L после отбора. Мы демонстрируем, что этот метод позволяет эффективное, бесшовное генерации rVACV в различных типах клеток, не требуя отбора лекарств или тщательного скрининга на вирусы-мутанты.

Мы использовали процедуру диаграммы на рисунке 1 для создания VACV не хватает как PKR антагонистов E3L и K3L, заменив E3L с EGFP в вирус, уже удалены для K3L (vP872). На рисунке 2 показаны красные флуоресцентные бляшки в компетентных клетках PKR RK13, свидетельствующая о виру...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection at JoVE.com

Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

Это метод для создания "безшрамов" рекомбинантных вирусов vaccinia с использованием выбора хоста и визуальной идентификации рекомбинантных вирусов.

Быстрое, бесшовное поколение рекомбинантных поксвирусов с использованием диапазона хоста и визуального отбора

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a ...

Наш метод использует выбор диапазона хоста и флуоресцентные маркеры для эффективного и бесшовного генерации рекомбинантного вируса вакцины в различных типах клеток. Этот метод сочетает в себе скорость гомологичной рекомбинации с бескарастной природой переходного доминирующего отбора. Кроме того, мы размехаем выбор диапазона, чтобы исключить возможность химически индуцированных изменений.Этот метод также может быть использован для модификации вируса вакцины или других поксвирусов для выражения иностранных генов, например, для создания вакцин. Если вы выполняете этот протокол только с выбором флуоресценции, вы должны убедиться, что вы скрининга достаточно вирусов для обнаружения относительно редких рекомбинантов без избирательного давления PKR. Этот метод опирается на увеличение и потерю флуоресцентных маркеров для успешного выбора вирусов, которые приобрели рекомбинации кассеты и для обнаружения вирусов, которые имеют без шрамов рекомбинации.Для генерации вектора рекомбинации сначала добавьте 17 микролитров свободной воды DNase, 1,2 микролитров каждой грунтовки, пять микролитров буфера реакции ПЦР, шаблон ДНК и 0,5 микролитров полимеразы ДНК в одну трубку ПЦР на ампликон. Добавьте дополнительную бесплатную воду DNase, чтобы довести окончательный объем в каждой трубке до 50 микролитров. И поместите трубки в термоциклер.Растопить ДНК на 98 градусов по Цельсию в течение 30 секунд, прежде чем использовать 25 раундов трехшагового протокола ПЦР, как указано. Для визуализации продуктов усиления на 1%agarose гель, добавить 10 микролитров каждого продукта ДНК и 2 микролитров погрузочного буфера для каждой хорошо. Вы запустите гель в течение одного часа на восемь вольт на сантиметр.В конце пробега используйте набор для извлечения геля ДНК в соответствии с протоколом производителя для очистки каждого ампликона. Elute amplicons из колонны с 50 микролитров DNase свободной воды и немедленной центрифугации. Для линейной линии вектора клонирования сначала добавьте один микрограмм вектора, 17 микролитров свободной воды DNase, 2 микролитров буфера реакции и 1 микролитер EcoRI в трубку в течение одного часа инкубации при 37 градусах Цельсия.В конце инкубации добавьте 0,2 пикомолы линейного вектора 10 микролитров свободной воды DNase и 10 микролитров мастер-микса сборки ДНК к каждому изолированному ампликону. Инкубация образцов при 50 градусах цельсия в течение одного часа. В конце инкубации преобразуем химически компетентную E.coli с двумя микролитерами собранного продукта в соответствии со стандартными протоколами.Плита 100 микролитров преобразованных клеток на пластины АГАрозы LB дополнена 100 микрограммами на миллилитр ампициллина. После ночной инкубации при 37 градусах по Цельсию выберите хорошо изолированные колонии для прививки в бульоне Лурия, дополненном 100 микрограммами на миллилитр ампициллина на ночь при 37 градусах Цельсия и 225 революциях в минуту. На следующее утро используйте плазмиды miniprep комплект изолировать плазмиды.И проверить концентрацию и чистоту ДНК на спектрофотометре. Для рекомбинантного генерации вируса заразить смутный монослой подходящих клеток вирусом, который будет рекомбинироваться при множественности инфекции одного из шести хорошо пластины. И инкубировать инфицированные клетки при 37 градусах Цельсия и 5%углекислого газа в течение одного часа.В конце инкубации замените супернатант в каждой из них свежим DMEM и используя коммерчески доступный трансфектный реагент в соответствии с протоколом производителя. Добавьте три микрограмма вектора рекомбинации, представляющих интерес для каждой из них. Поместите тарелку в инкубатор еще на 48 часов.Перед объединением клеток из каждого состояния трансфекции в отдельные 1,5 миллилитров труб. Затем заморозить-разморозить объединили клетки три раза, прежде чем sonicating в результате лизатов в течение 15 секунд при 50%амплитуды. Далее, последовательно 10 раз разбавить sonicated лизат, собранный от 10 до первого до 10 до шестой концентрации в свежем DMEM и добавить один миллилитр каждого разбавления отдельных сотых скважин белка киназы R компетентных клеточных линий.Поместите клетки в инкубатор клеточной культуры в течение одного часа, прежде чем заменить супернатанты свежей средой и вернуть клетки в инкубатор клеточной культуры. Через 24-48 часов определите рекомбинантные вирусы с помощью микроскопии флуоресценции. Таблички от рекомбинантных вирусов выражают красную флуоресценцию благодаря интеграции гена синтеза mCherry-E3L.Табличка очищает рекомбинантные вирусы три раза на клетках дикого типа RK13. После трех раундов очистки бляшек заразить клетки RK13-E3L-K3L с серийными разбавлениями лизолята налета. Для идентификации рухнувших вирусов с помощью микроскопии флуоресценции с помощью соответствующей системы визуализации, оснащенной кубиками фильтра GFP и RFP.Затем налет очищает только зеленый VC-R4, или бесцветные E3L бляшки три раза на RK13-E3L-K3L клеток. Обеспечение того, чтобы не бляшки флуоресце красный. Заразить клетки, по крайней мере 100 бляшек формирования единиц, чтобы увеличить ваши шансы на выявление бесцветный налет.В редких случаях может потребоваться несколько раундов инфекции. Красные флуоресцентные бляшки в белковой киназе R компетентных клеток RK13 свидетельствуют о вирусной экспрессии mCherry-E3L. А бесцветные бляшки или бляшки, выражают только eGFP в ячейках RK13-E3L-K3L, подтверждают коллапс маркера выбора mCherry-E3L.Рекомбинантный вирус VC-R4, в котором отсутствуют оба белка киназы R антагонисты не могут размножаться в белках киназы R компетентных клеток RK13 в то время как очевидное вирус VP872, который выражает E3L является репликация компетентным. Чтобы подтвердить, что эта неспособность размножаться в клетках RK13 была только из-за потери E3L, расширенный GFP был заменен E3L в вирусе VC-R4. Он создал соответствующий вирус, используя тот же протокол отбора.Интересно, что при создании этого вируса, бесцветные бляшки в соответствии с коллапсом mCherry-E3L маркер отбора были определены до выбора в RK13'E3L-K3L клеток, которые, как правило, требуется для выбора без шрамов рекомбинантов. Вероятно, из-за расширенной последовательности идентичности между кассетой рекомбинации mCherry-E3L и геном E3L, вставляемым в VC-R4. В среднем 12,6% потомства виньоны прошли рекомбинацию трансфектной плазмидой, как и ранее сообщалось частоты.Здесь показана частота бесцветных бляшек относительно общего количества бляшек ячеек RK13-E3L-K3L, что свидетельствует о том, что скорость коллапса и потеря маркера отбора mCherry-E3L происходили с частотой примерно 1,8%. На первом этапе использование PKR компетентных клеток гарантирует, что все бляшки с содержащимся рекомбинантным вирусом. На втором этапе использование PKR дефицитных клеток позволяет обнаруживать рекомбинантный вирус с коллапсом локуса mCherry-E3L.Такой подход позволяет нам быстро генерировать вирусы, содержащие экзогенные гены, например, для производства вакцин предлагают выражение различных вирусных антагонистов PKR. для облегчения анализа видов-специфических взаимодействий с PKR от различных хостов.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Генерация рекомбинантного вируса гриппа от ДНК плазмиды

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Скрининг на хост факторов, участвующих в Vaccinia Вирусной инфекции использованием Drosophila Ячейки

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Сочетание Клей-ленты на основе выборки и флуоресценции На месте Гибридизация для быстрого обнаружения Сальмонеллы На Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Генерация рекомбинантного ареновирус для разработки вакцины в FDA-Approved клетках Веро

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

Масштабируемость Высокая пропускная Выбор фага-дисплее синтетических библиотек антител

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Генерация рекомбинантного человеческого IgG моноклональных антител из иммортализованных клеток Сортировка В

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Анализ<em&gt; Yersinia энтероколитные</em&gt; Эффектор Транслокация в клетки-хозяева с помощью Бета-лактамазы эффекторных Слияния

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Визуальные и микроскопических оценки Streptomyces развития мутантов

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Использование бактериальных патогенов чтобы зонд для сотовых и организмический уровне принимающей ответов

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Поколение, усилители и титрование рекомбинантных респираторных вирусов-синцитиальный

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...